Eine automatisierte Methode zur Bestimmung der Leistungsfähigkeit von Drosophila als Reaktion auf Temperaturänderungen in Raum und Zeit
12. Oktober 2018
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um automatisch bestimmen die lokomotorische Leistung von Drosophila bei schwankenden Temperaturen mit einer programmierbaren temperaturgeführte Arena, die schnell und präzise Temperaturänderungen in Zeit und Raum produziert.
Diese Methode kann uns helfen, wichtige Fragen über die Reaktion von Fliegen auf Temperaturänderungen zu beantworten, wie Z. B. Unterschiede zwischen Genotypen, die Interaktion mit anderen sensorischen Hinweisen oder die Funktion verschiedener Temperaturrezeptoren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie mehrere schnelle und präzise Temperaturänderungen ermöglicht, die Zeit und Raum steuern und auf automatisierte Weise. Beginnen Sie damit, 20 männliche und 20 weibliche Fliegen in eine Aufzuchtflasche mit 45 Millilitern Fliegenfuttermedium zu legen und die Flasche in einem 25 Grad Celsius Inkubator unter 12 Stunden Licht, 12 Stunden dunkle Zyklen.
Nach 10 Tagen die neu geschlossenen Fliegen auf Kohlendioxid-Pads für maximal vier Minuten anbesen. Und verwenden Sie einen Pinsel, um Jungfliegen in 2,5 mal 9,5 Zentimeter fliegen den Fläschchen mit 6,5 Millilitern frischem Fliegenfuttermedium zu sammeln, getrennt durch Sex in Gruppen von 20 Fliegen pro Durchstechflasche. Dann geben Sie die Fläschchen für fünf bis sieben Tage an den Inkubator zurück.
Um eine temperaturgeregelte Arena einzurichten, schalten Sie die Arena ein und öffnen Sie das Temperaturphasenskript im Steuercomputer. Stellen Sie sicher, dass die Temperatursequenz richtig eingestellt ist, und überprüfen Sie, ob die Dauer jeder Versuchsphase auf 60 Sekunden eingestellt ist. Bestätigen Sie im Start-Experimentalblockabschnitt diese Einstellungen: die gewünschte Anzahl von Phasen, iterative ein-/aus-Setup der indikativen Rotlichtemittenten, zwei Grad Celsius Temperaturanstieg pro Phase und 16 Grad Celsius als Starttemperatur.
Führen Sie als Nächstes das Skript für Temperaturphasen aus. Die Software initialisiert für fünf Sekunden und stoppt dann. Für Temperaturverhaltensexperimente legen Sie einen Strang aus weißem leitfähigem Klebeband auf die Oberseite der Kupferfliesen der Arena, um sicherzustellen, dass alle Kanten abgedeckt sind.
Legen Sie einen beheizten Aluminiumring um die Kupferfliesen und verwenden Sie ein sauberes Gewebe, um die Glasabdeckung zu wischen. Legen Sie die Abdeckung auf die Oberseite des Aluminiumrings und hinterlassen Sie eine Lücke, durch die eine Fliege eingeblasen werden kann, und tippen Sie zweimal auf eine akklimatisierte Fliegenfläschchen, um die Fliegen an den Boden der Durchstechflasche zu zwingen. Mit einem Mundsauger, fangen Sie eine Fliege und schließen Sie die Durchstechflasche, bevor Sie sie wieder in den Inkubator.
Blasen Sie die Fliege in die Arena durch die Lücke zwischen der Glasabdeckung und dem Aluminiumring und drücken Sie sofort den Glasklee, um die Lücke zu schließen. Platzieren Sie einen Lichtrahmen um die Arena, um eine symmetrische Beleuchtung zu gewährleisten, und starten Sie die Aufnahme mit dem Videoaufnahmeprogramm. Drücken Sie dann die Leertaste des Steuercomputers, um mit der Ausführung der experimentellen Phasen zu beginnen.
Um die Videos zu verfolgen, öffnen Sie die Fly Steps Tracking-Software und öffnen Sie die Konfigurationsdatei im Fly Tracker-Ordner. Legen Sie den Speicherort der Videos im Videoordner und die Namen der Videos in Videodateien fest. Geben Sie die Grenzen der Flugarena in arena-Einstellungen basierend auf den x/y-Pixelkoordinaten mehrerer Punkte am Rand der Arena an.
Richten Sie die Position der inaktiven roten LEDs in LED-Einstellungen ein, basierend auf den x/y-Pixelkoordinaten der Position der Mitte der LEDs. Um den Speicherort der Ränder der Fly-Arena zu überprüfen, legen Sie debuggen in den Arena-Einstellungen auf true fest, klicken Sie auf Speichern, und führen Sie das Skript im Terminal aus. Eine Bildschirmaufnahme des Videos wird mit einem blauen Quadrat angezeigt, das durch die Koordinaten gebildet wird, die in die Arena-Einstellungen eingegeben werden.
Ändern Sie dann das Debuggen in den Arenaeinstellungen in false. Klicken Sie auf Speichern, und führen Sie den Bildschirm im Terminal erneut aus, um den Nachverfolgungsprozess zu starten. In einem typischen Temperaturverhaltensexperiment weisen einzelne Fliegen, die 16, 20 oder 24 Grad Celsius ausgesetzt sind, zu Beginn des Experiments eine höhere Fortbewegung auf als nach fünf Minuten.
Die temperaturgeregelte Arena kann auch verwendet werden, um Flugverhaltensreaktionen aus verschiedenen genetischen Hintergründen mit dynamischen Temperaturänderungen zu vergleichen. In diesem Experiment beispielsweise stieg die Geschwindigkeit aller getesteten Arten entsprechend ihren eigenen Ansprechkurven an, als die Temperatur stieg, bis sie einen Punkt der maximalen Leistung erreichte, nach dem ihre Geschwindigkeiten verfielen und die Fliegen untergingen. Wenn einzelne Fliegen in der Mitte und einer Seitenfliese 40 Grad Celsius ausgesetzt waren, mit der anderen Seitenfliese bei angenehmen 22 Grad Celsius, blieben die Wild-Fliegen schnell nicht mehr entlang der Arena und bleiben in der komfortablen Lage.
Im Gegensatz dazu erkunden die klassischen Memory-Mutanten Dunce-Fliegen immer wieder die Arena und verbringen weniger Zeit als Kontrollen in der komfortablen Lage. Darüber hinaus sind Testkombinationen von Temperatur und Position auch nützlich, um die Funktion verschiedener Temperaturrezeptoren bei dynamischen Temperaturänderungen zu verstehen. Wie in diesem Experiment gezeigt, in dem einzelne d melanogaster Mutanten steigenden Temperaturen ausgesetzt waren, während eine sich verschiebende komfortable Lage bei 22 Grad Celsius zur Verfügung gestellt wurde.
Denken Sie beim Ausführen dieser Prozedur daran, die Schritte in der Reihenfolge und schnell auszuführen, damit Sie so viel fliegendes Verhalten wie möglich erfassen können. Neben diesem Verfahren können andere Methoden wie negative Geotaxis oder Hitzedrossel-Assays verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wo sich Fliegen normal bewegen oder einen normalen Wärmewiderstand haben. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zu uns, um neurologische Störungen oder Mutationen zu verstehen, bei denen Temperaturwahrnehmung oder Schmerz eine Rolle spielen.
Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, kämpfen, weil jeder Schritt für sich allein einfach ist, aber sie müssen perfekt koordiniert werden, so dass die Technik geübt werden muss.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Beurteilung der motorischen Leistungsfähigkeit von Drosophila in Reaktion auf Temperaturänderungen mithilfe einer programmierbaren, temperaturgesteuerten Versuchsanordnung vorgestellt. Die Methode ermöglicht schnelle und präzise Temperaturwechsel und erleichtert dadurch die Untersuchung der Reaktionen der Fliegen auf Umweltveränderungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensbiologie
- Temperatursensitivität
Hintergrund
- Drosophila dient als Modellorganismus zur Untersuchung genetischer und umweltbedingter Wechselwirkungen.
- Temperaturänderungen können die motorische Aktivität und das Verhalten erheblich beeinflussen.
- Das Verständnis dieser Reaktionen kann Einblicke in die sensorische Verarbeitung und Anpassung liefern.
- Automatisierte Methoden erhöhen die Präzision unter experimentellen Bedingungen.
Zweck der Studie
- Untersuchung der motorischen Leistungsfähigkeit von Drosophila bei unterschiedlichen Temperaturen.
- Untersuchung von Unterschieden in den Reaktionen zwischen verschiedenen Genotypen.
- Analyse der Wechselwirkungen mit anderen sensorischen Reizen.
Verwendete Methoden
- Nutzung einer programmierbaren, temperaturgeregelten Versuchsanlage.
- Platzierung von männlichen und weiblichen Fliegen in kontrollierten Umgebungen.
- Überwachung der motorischen Aktivität unter wechselnden Temperaturbedingungen.
- Automatisierte Datenerfassung zur genauen Analyse.
Hauptergebnisse
- Zeigte die Fähigkeit, Temperaturen schnell zu wechseln und das Verhalten von Fliegen zu bewerten.
- Identifizierte signifikante Unterschiede in der motorischen Leistungsfähigkeit zwischen Genotypen.
- Zeigte Wechselwirkungen zwischen Temperaturreaktionen und sensorischen Reizen auf.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen robusten Rahmen, um die Temperatursensitivität bei Drosophila zu untersuchen.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis genetischer und umweltbedingter Einflüsse auf das Verhalten bei.
- Zukünftige Studien können diese Technik für breitere Anwendungen in der Neurowissenschaft nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine hochdurchsatzfähige, automatisierte Bewertung der temperaturabhängigen motorischen Leistungsfähigkeit bei Drosophila und liefert quantitative phänotypische Daten zur Zielvalidierung in neurogenetischen Studien. Durch die Erfassung dynamischer Verhaltensreaktionen auf räumlich und zeitlich kontrollierte thermische Reize unterstützt sie die Aufklärung der zugrundeliegenden Mechanismen von Temperatursensorikwegen, die für Schmerz- und Sinnesstörungsmodelle relevant sind. Das automatisierte Tracking und die reproduzierbare Umgebungskontrolle erhöhen die Vorhersagegenauigkeit in frühen Entdeckungsworkflows, die Untersuchungen zur Genfunktion und zur Interaktion mit der Umwelt beinhalten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung genetischer Beiträge zu thermischen Reaktionsphänotypen und unterstützt die funktionelle Validierung von Temperatursensor-Genen und neuronalen Signalwegen.
- Operativer Wert: Erleichtert den direkten Vergleich von Mutanten- und Wildtyp-Stämmen unter identischen, programmierbaren Umweltbedingungen, um genotypspezifische Effekte zu isolieren.
- Prädiktiver Wert: Erzeugt dosisabhängigkeitsähnliche Leistungskurven über Temperaturgradienten hinweg und unterstützt so die Identifizierung funktioneller Schwellenwerte und phänotypischer Schweregrade zur Priorisierung von Zielstrukturen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare motorische Ausgangsgrößen (Geschwindigkeit, Ortpräferenz), die als robuste, informationsreiche phänotypische Messgrößen zur Untersuchung genetischer Bibliotheken oder pharmakologischer Modulatoren der Wärmeempfindlichkeit dienen.
- Operativer Wert: Die automatisierte Video-Verfolgung und die Standardisierung der Versuchsanlage verringern die Variabilität zwischen Experimenten und ermöglichen skalierbare, reproduzierbare Assays, die sich für Screening-Kampagnen mit mittlerer bis hoher Durchsatzleistung eignen.
- Einsatzbereitschaft des Assays: Erzeugt normalisierte Verhaltensmetriken, die über verschiedene Genotypen und experimentelle Ansätze hinweg verglichen werden können, wodurch die Assay-Validierung und die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren unterstützt wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Relevanz: Modelliert Mechanismen der thermischen Anpassung bei Ektothermen und liefert Erkenntnisse über konservierte neuronale Thermowahrnehmungspfade mit möglicher Bedeutung für schmerzrelevante und thermoregulatorische Zielstrukturen bei Säugetieren.
- Präklinische Kontinuität: Ermöglicht die longitudinale Erfassung thermischer Leistungskurven und unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung in Target-Validierungs-Pipelines, indem Genotyp-Phänotyp-Umgebungs-Beziehungen etabliert werden.
- Mechanistische Entwederung: Erlaubt die Aufklärung der Funktion von Temperaturrezeptoren durch räumliche und zeitliche Temperaturprofilerstellung und verringert so die Unsicherheit bei der Verknüpfung genetischer Läsionen mit Defiziten in der sensorischen Informationsverarbeitung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und verbindet genetische Störungen mit quantifizierbaren Verhaltensausgaben in einem kontrollierten Umweltkontext, wodurch hypothesengetriebene Zielvalidierungs- und Leitstruktur-Identifizierungsansätze in der neuroverhaltensbezogenen Forschung unterstützt werden.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die systematische Untersuchung der Genfunktion bei der Temperaturwahrnehmung, indem der genetische Hintergrund mit dynamischen Bewegungsreaktionen auf kontrollierte thermische Reize korreliert wird.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Verhaltensparameter (z. B. Geschwindigkeit, räumliche Präferenz), die ein zuverlässiges Screening von Substanzen oder Genotypen in temperaturabhängigen Signalwegen ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt zeit- und temperaturaufgelöste Verhaltensdatensätze, die für den statistischen Vergleich von Leistungskurven, EC50-ähnlichen thermischen Schwellenwerten und Flächen-unter-der-Kurve-Kenngrößen zwischen experimentellen Gruppen geeignet sind.
- Translationale Forschung: Verbindet thermische Reaktionsphänotypen von Drosophila mit evolutionär konservierten Mechanismen der sensorischen Signaltransduktion und unterstützt so die validierung von Zielstrukturen über Arten hinweg in der Thermosensorik- und Schmerzforschung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die automatisierte Versuchsanlage und die Nachverfolgungspipeline stellen eine wiederverwendbare Plattform dar, um Gen-Umwelt-Interaktionen über mehrere Sinnesmodalitäten hinausgehend zu untersuchen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert mechanistische Erkenntnisse über temperatursensorische neuronale Schaltkreise, indem präzise räumlich-zeitliche thermische Reize ermöglicht und das Verhalten automatisiert quantifiziert wird.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Umweltkontrolle, automatisierte Datenerfassung und reduziertes manuelles Handling, wodurch die vom Bediener abhängige Variabilität minimiert wird.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungssicherheit bei der Beurteilung von Fortsetzungsentscheidungen (go/no-go), indem objektive, quantitative phänotypische Daten bereitgestellt werden, die die Abhängigkeit von subjektiven Verhaltensbewertungen in neurogenetischen Screens verringern.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikobasierte Priorisierung von Zielstrukturen, indem genetische Läsionen mit messbaren Defiziten in der thermischen Leistungsfähigkeit verknüpft werden, was die frühzeitige Identifizierung von vielversprechenden therapeutischen Zielstrukturen unterstützt.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Drosophila, in der Gestaltung von Verhaltensassays sowie in der Konfiguration von videobasierten Verfolgungssoftware.
- Abhängig von temperaturgesteuerten Versuchsanlagen, synchronisierter Beleuchtung und Videosystemen zur genauen Erfassung von Umwelt- und Verhaltensdaten.
- Erfordert eine standardisierte Abstimmung zwischen Teams hinsichtlich Kalibrierung der Versuchsanlage, Verfolgungsparametern und Definition thermischer Protokolle, um die Reproduzierbarkeit an verschiedenen Standorten oder Nutzern sicherzustellen.
- Die Anpassung an andere Insektenmodelle oder sensorische Reize kann eine Neukalibrierung der Anlagendimensionen, Verfolgungsschwellenwerte und Temperaturanstiegsgeschwindigkeiten erfordern, basierend auf artenspezifischer Größe und Reaktionskinetik.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen Kapazitätsgrenzen der Anlage (eine Fliege pro Durchlauf) und die Notwendigkeit einer sorgfältigen prozeduralen Abstimmung, um die zeitliche Synchronisation zwischen Temperaturwechseln und Verhaltensaufzeichnung aufrechtzuerhalten.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Fly and Temperature-Controlled Arena Preparation
2:02
Temperature Behavioral Experiments
3:13
Video Tracking and Data Analysis
4:31
Results: Representative Drosophila Performance Analyses in Response to Temperature Changes in Space and Time
6:08
Conclusion
