Eine automatisierte Methode zur Bestimmung der Leistungsfähigkeit von Drosophila als Reaktion auf Temperaturänderungen in Raum und Zeit

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um automatisch bestimmen die lokomotorische Leistung von Drosophila bei schwankenden Temperaturen mit einer programmierbaren temperaturgeführte Arena, die schnell und präzise Temperaturänderungen in Zeit und Raum produziert.

Diese Methode kann uns helfen, wichtige Fragen über die Reaktion von Fliegen auf Temperaturänderungen zu beantworten, wie Z. B. Unterschiede zwischen Genotypen, die Interaktion mit anderen sensorischen Hinweisen oder die Funktion verschiedener Temperaturrezeptoren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie mehrere schnelle und präzise Temperaturänderungen ermöglicht, die Zeit und Raum steuern und auf automatisierte Weise. Beginnen Sie damit, 20 männliche und 20 weibliche Fliegen in eine Aufzuchtflasche mit 45 Millilitern Fliegenfuttermedium zu legen und die Flasche in einem 25 Grad Celsius Inkubator unter 12 Stunden Licht, 12 Stunden dunkle Zyklen.

Nach 10 Tagen die neu geschlossenen Fliegen auf Kohlendioxid-Pads für maximal vier Minuten anbesen. Und verwenden Sie einen Pinsel, um Jungfliegen in 2,5 mal 9,5 Zentimeter fliegen den Fläschchen mit 6,5 Millilitern frischem Fliegenfuttermedium zu sammeln, getrennt durch Sex in Gruppen von 20 Fliegen pro Durchstechflasche. Dann geben Sie die Fläschchen für fünf bis sieben Tage an den Inkubator zurück.

Um eine temperaturgeregelte Arena einzurichten, schalten Sie die Arena ein und öffnen Sie das Temperaturphasenskript im Steuercomputer. Stellen Sie sicher, dass die Temperatursequenz richtig eingestellt ist, und überprüfen Sie, ob die Dauer jeder Versuchsphase auf 60 Sekunden eingestellt ist. Bestätigen Sie im Start-Experimentalblockabschnitt diese Einstellungen: die gewünschte Anzahl von Phasen, iterative ein-/aus-Setup der indikativen Rotlichtemittenten, zwei Grad Celsius Temperaturanstieg pro Phase und 16 Grad Celsius als Starttemperatur.

Führen Sie als Nächstes das Skript für Temperaturphasen aus. Die Software initialisiert für fünf Sekunden und stoppt dann. Für Temperaturverhaltensexperimente legen Sie einen Strang aus weißem leitfähigem Klebeband auf die Oberseite der Kupferfliesen der Arena, um sicherzustellen, dass alle Kanten abgedeckt sind.

Legen Sie einen beheizten Aluminiumring um die Kupferfliesen und verwenden Sie ein sauberes Gewebe, um die Glasabdeckung zu wischen. Legen Sie die Abdeckung auf die Oberseite des Aluminiumrings und hinterlassen Sie eine Lücke, durch die eine Fliege eingeblasen werden kann, und tippen Sie zweimal auf eine akklimatisierte Fliegenfläschchen, um die Fliegen an den Boden der Durchstechflasche zu zwingen. Mit einem Mundsauger, fangen Sie eine Fliege und schließen Sie die Durchstechflasche, bevor Sie sie wieder in den Inkubator.

Blasen Sie die Fliege in die Arena durch die Lücke zwischen der Glasabdeckung und dem Aluminiumring und drücken Sie sofort den Glasklee, um die Lücke zu schließen. Platzieren Sie einen Lichtrahmen um die Arena, um eine symmetrische Beleuchtung zu gewährleisten, und starten Sie die Aufnahme mit dem Videoaufnahmeprogramm. Drücken Sie dann die Leertaste des Steuercomputers, um mit der Ausführung der experimentellen Phasen zu beginnen.

Um die Videos zu verfolgen, öffnen Sie die Fly Steps Tracking-Software und öffnen Sie die Konfigurationsdatei im Fly Tracker-Ordner. Legen Sie den Speicherort der Videos im Videoordner und die Namen der Videos in Videodateien fest. Geben Sie die Grenzen der Flugarena in arena-Einstellungen basierend auf den x/y-Pixelkoordinaten mehrerer Punkte am Rand der Arena an.

Richten Sie die Position der inaktiven roten LEDs in LED-Einstellungen ein, basierend auf den x/y-Pixelkoordinaten der Position der Mitte der LEDs. Um den Speicherort der Ränder der Fly-Arena zu überprüfen, legen Sie debuggen in den Arena-Einstellungen auf true fest, klicken Sie auf Speichern, und führen Sie das Skript im Terminal aus. Eine Bildschirmaufnahme des Videos wird mit einem blauen Quadrat angezeigt, das durch die Koordinaten gebildet wird, die in die Arena-Einstellungen eingegeben werden.

Ändern Sie dann das Debuggen in den Arenaeinstellungen in false. Klicken Sie auf Speichern, und führen Sie den Bildschirm im Terminal erneut aus, um den Nachverfolgungsprozess zu starten. In einem typischen Temperaturverhaltensexperiment weisen einzelne Fliegen, die 16, 20 oder 24 Grad Celsius ausgesetzt sind, zu Beginn des Experiments eine höhere Fortbewegung auf als nach fünf Minuten.

Die temperaturgeregelte Arena kann auch verwendet werden, um Flugverhaltensreaktionen aus verschiedenen genetischen Hintergründen mit dynamischen Temperaturänderungen zu vergleichen. In diesem Experiment beispielsweise stieg die Geschwindigkeit aller getesteten Arten entsprechend ihren eigenen Ansprechkurven an, als die Temperatur stieg, bis sie einen Punkt der maximalen Leistung erreichte, nach dem ihre Geschwindigkeiten verfielen und die Fliegen untergingen. Wenn einzelne Fliegen in der Mitte und einer Seitenfliese 40 Grad Celsius ausgesetzt waren, mit der anderen Seitenfliese bei angenehmen 22 Grad Celsius, blieben die Wild-Fliegen schnell nicht mehr entlang der Arena und bleiben in der komfortablen Lage.

Im Gegensatz dazu erkunden die klassischen Memory-Mutanten Dunce-Fliegen immer wieder die Arena und verbringen weniger Zeit als Kontrollen in der komfortablen Lage. Darüber hinaus sind Testkombinationen von Temperatur und Position auch nützlich, um die Funktion verschiedener Temperaturrezeptoren bei dynamischen Temperaturänderungen zu verstehen. Wie in diesem Experiment gezeigt, in dem einzelne d melanogaster Mutanten steigenden Temperaturen ausgesetzt waren, während eine sich verschiebende komfortable Lage bei 22 Grad Celsius zur Verfügung gestellt wurde.

Denken Sie beim Ausführen dieser Prozedur daran, die Schritte in der Reihenfolge und schnell auszuführen, damit Sie so viel fliegendes Verhalten wie möglich erfassen können. Neben diesem Verfahren können andere Methoden wie negative Geotaxis oder Hitzedrossel-Assays verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wo sich Fliegen normal bewegen oder einen normalen Wärmewiderstand haben. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zu uns, um neurologische Störungen oder Mutationen zu verstehen, bei denen Temperaturwahrnehmung oder Schmerz eine Rolle spielen.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, kämpfen, weil jeder Schritt für sich allein einfach ist, aber sie müssen perfekt koordiniert werden, so dass die Technik geübt werden muss.