Screening Cotton Genotypes auf Reniform Nematode Resistenz

Hier wird ein Protokoll für das schnelle zerstörungsfreie Screening von Baumwollgenotypen auf reniforme Nematodenresistenz vorgelegt. Das Protokoll beinhaltet die visuelle Untersuchung der Wurzeln von nematodeninfizierten Baumwollsämlingen, um die Infektionsreaktion zu bestimmen. Der vegetative Trieb aus jeder Pflanze wird dann vermehrt, um Pflanzen für die Saatgutproduktion zurückzugewinnen.

Diese Methode könnte bei der Entwicklung von reniformnematodenresistenten Baumwollsorten helfen. Durch die Identifizierung resistenter Genotypen aus anderen Baumwollarten und die Bewertung von Zuchtpopulationen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine einfache und zerstörungsfreie Methode für reniforme Nematoden-Screening bietet.

Beginnen Sie, indem Sie eine Kugel Baumwolle in den Boden von einem vier Zentimeter Durchmesser, 21 Mittelhöhe konischen Kunststofftopf pro Samen. Und füllen Sie die Töpfe mit Dampf pasteurisierte Bodenmischung bis etwa zwei Zentimeter von der Oberseite des Topfes. Legen Sie einen Plastikpfahl in jeden Topf, der den zu pflanzenden Genotyp bezeichnet, und pflanzen Sie einen Samen des entsprechenden Baumwollgenotyps in jeden Topf.

Füllen Sie jeden Topf mit zusätzlichem Boden, um das Saatgut zu bedecken und legen Sie die Töpfe in eine Wachstumskammer auf konstante Temperatur von 28 Grad Celsius mit einer 16 Stunden fluoreszierenden und Glühlampen Fotoperiode eingestellt. Dann legen Sie Wasserstrahler in jeden Topf und verwenden Sie ein automatisches Bewässerungssystem, um die Töpfe zweimal täglich zu wässern. Sieben Tage nach der Pflanzung, erstellen Sie eine kleine Depression im Boden neben jeder Pflanze und fügen Sie einen Milliliter Reniform Nematoden Suspension in jede Depression.

Nach der Impfung muss das Topfwasser sorgfältig kontrolliert werden, um zu verhindern, dass die Nematoden aus der Wurzelzone gewaschen werden. 28 Tage nach der Impfung verwenden Sie eine Schere, um die meisten der vollständig erweiterten Blätter aus den Pflanzen zu entfernen, bevor Sie jeden Topf drücken und den Boden in eine Hand schieben, um die Pflanzen zu entfernen. Rühren Sie das Wurzelsystem in Leitungswasser vorsichtig in einem 10-Liter-Behälter, um den Boden von den Wurzeln zu entfernen, gefolgt von einer kurzen Spülung in einem Behälter mit sauberem Leitungswasser.

Verwenden Sie eine Schere, um das gereinigte Wurzelsystem aus der Pflanze etwa einen Zentimeter unter der Bodenlinie zu entfernen. Legen Sie die Wurzeln in einen 120 Milliliter nicht sterilen Einweg-Einwegbehälter aus Kunststoff. Als nächstes das Wurzelsystem mit ca. 30 Millilitern roter Lebensmittelfärbelösung vollständig abdecken und den Probenbehälter in einen Mikrowellenherd legen, um die Färbelösung zu erhitzen, bis sie zu kochen beginnt.

Wenn die Probe auf Raumtemperatur abgekühlt ist, ersetzen Sie die rote Lebensmittelfärbungslösung durch 100 Milliliter Leitungswasser, um überschüssige Flecken zu entfernen. Legen Sie dann die Abdeckung auf den Probenbehälter und lagern Sie die Probe bei vier Grad Celsius bis zur Wurzelinfektionsanalyse. Um die Pflanzen für die Samenproduktion zu bergen, legen Sie eine Kugel Baumwolle in den Boden eines neuen konischen Plastiktopfes und füllen Sie den Topf teilweise mit Torfmoos-Topfmedium.

Legen Sie ein Wurzelsystem geerntet vegetative Trieb in den Topf und fest Topfmedium hinzufügen, um den Topf zu füllen. Legen Sie einen neuen beschrifteten Kunststoffpfahl in jeden Topf, um den Baumwollgenotyp zu bezeichnen und legen Sie das Tablett der Töpfe in einen Plastikbehälter mit Wasser. Gießen Sie die Pflanzen kurz, um das Topfmedium zu befeuchten und legen Sie die Töpfe in eine Wachstumskammer, die auf eine konstante Temperatur von 28 Grad Celsius und eine 16-stündige Fotoperiode eingestellt ist.

Nach ca. 30 Tagen teilweise einen Sechsliter-Kunststofftopf pro Pflanze mit Topfmedium füllen. Übertragen Sie jede Pflanze in einen Sechs-Liter-Topf, wobei Sie jedem Topf, wenn jeder Sämling gepflanzt wird, fest Daseintopfmedium hinzufügen. Dann legen Sie die Pflanzen in einem Glashaus und fügen Sie Wasser, um das Topfmedium zu befeuchten.

Um die R.reniformis-Wurzelinfektion zu bewerten, entfernen Sie eine Wurzelprobe aus dem Probenbehälter. Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Anzahl der weiblichen Nematoden zu zählen, die an das Wurzelsystem unter der 20-fachen Vergrößerung angebracht sind. Eine erfolgreiche Infektion des Nematodenwurzelsystems kann durch mehrere Faktoren beeinflusst werden, einschließlich der Lebensfähigkeit des Nematoden, das für die Impfung und saisonale Variation verwendet wird, da die Nematoden in den Wintermonaten weniger aktiv sind.

Legen Sie dann das Wurzelsystem für ca. 10 Minuten auf Papiertücher, um die überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Wiegen Sie das Wurzelsystem, um das frische Wurzelgewicht zu bestimmen. Abweichungen im Wurzelwachstum sind zwischen den Exzisionen häufig.

Diese Schwankungen, gemessen am frischen Wurzelgewicht, können auch zwischen Pflanzen desselben Genotyps beobachtet werden. Relativ weniger weibliche reniforme Nematoden sind in der Lage, eine Futterstelle für den resistenten Baumwollgenotyp im Vergleich zum anfälligen Genotyp zu etablieren. Die Daten über das frische Wurzelgewicht können verwendet werden, um die Anzahl der weiblichen reniforme Nematoden pro Gramm Wurzelgewebe für jeden Genotyp zu berechnen.

Die Anzahl der weiblichen reniformen Nematoden pro Gramm Wurzel für resistente Genotypen ist im Allgemeinen kleiner als 10, während anfällige Genotypen in der Regel mehr als 30 Nematoden pro Gramm Wurzel aufweisen. Hier wird eine Teilmenge der Daten aus einer segregierenden F2-Population gezeigt, die 300 Pflanzen umfasste. Diese Variationsbereiche für Wurzelwachstum und Nematodeninfektion der Wurzelsysteme werden häufig bei Nematodenbewertungen beobachtet, was die Fähigkeit dieses Verfahrens veranschaulicht, eine große Anzahl von Pflanzen in einem einzigen Experiment zu untersuchen, diese Variation zu minimieren und eine genaue Beurteilung der Genetik des Widerstands zu ermöglichen.

Nach diesem Verfahren kann die Genetik der reniformen Nematodenresistenz bestimmt werden, um die DNA-Marker zu identifizieren, die mit dem Widerstand verbunden sind. Diese Marker können dann für die markerunterstützte Züchtung und für die Übertragung der Nematodenresistenz auf Hochlandbaumwolle verwendet werden. Nach ihrer Entwicklung bot diese Technik eine zerstörungsfreie Methode, die es Forschern ermöglichte, Pflanzen nach dem Nematoden-Rescreening zurückzugewinnen, um bei der Züchtung resistenter Baumwollsorten zu helfen.