Visualisierung von Blatt- und Braktealnektaren von Baumwolle mittels digitaler Mikroskopie zur Verbesserung der Punktgenauigkeit und Datenerhaltung

Die aktuelle Studie zielt auf die Methode ab, die die Expression des Nektarmerkmals genau bewertet. Zur Veranschaulichung des Nektarmerkmales wurden sowohl Baumwollblatt- als auch Brakteal-Nektare als Modellgewebe verwendet. Diese Methode überwindet die Einschränkung der traditionellen Wertung, die für die Nectary-Trade-Bewertung unzuverlässig und ungenau ist.

Um zu beginnen, transportiere eine Kühlbox und beschriftete Ziploc-Beutel zum Gewächshaus zur Probenentnahme, sammle junges Blattgewebe von zwei bis drei Monate alten Baumwollpflanzen im Gewächshaus und lege es in die beschrifteten Probenbeutel. Geben Sie mindestens zwei Blätter pro Pflanzenprobe in den jeweiligen beschrifteten Beutel und schließen Sie den Beutel nach der Entnahme sicher ab. Lege jede versiegelte Probentüte mit Blattgewebe in die Kühlbox.

Sammeln Sie gesunde Blüten von den oberen Ästen, wenn die Pflanzen sich in der mittleren Blütephase befinden. Legen Sie mindestens zwei Blumen in einen beschrifteten Probenbeutel und schließen Sie den Beutel. Bringen Sie die versiegelten Probenbeutel mit Blumen in die Kühlbox zum Transport ins Labor.

Schalten Sie ein Mikroskop ein und führen Sie die ersten Startschritte durch. Lege ein halb gefaltetes, weißes A4-Blatt, das der Größe der Mikroskopbühne entspricht, auf die Bühne. Benutze die kleinen Lichtknöpfe am Konsolencontroller, um das Licht auf der Mikroskopbühne auf maximale Intensität einzustellen.

Dann drehe ich den großen Helligkeitsregler um drei Viertel, um ihn auf mittlere Stufe zu stellen. Wählen Sie am Computer die 10-fache Vergrößerung in der Mikroskopsoftware aus. Lege das Blattgewebe auf das vorgeschnittene weiße Blatt auf der Mikroskopbühne mit der abaxialen Seite nach oben und zentriere es auf der Bühne.

Drehen Sie vorsichtig die Kurs- und Feinverstellknöpfe, um sich auf die mittlere Rippe des Blattes zu konzentrieren. Weiter anpassen, bis das Bild klar und unscharf erscheint. Positionieren Sie das untere Ende der Mittelrippe, wo sich der Nektar befindet, im Zentrum des Sichtfelds und sorgen Sie für eine klare Sicht auf die divergierenden lateralen Venen.

Die Verwendung der Lauf- und Feinjustierknöpfe verfeinert den Fokus weiter, um die digitale Bildklarheit zu verbessern. Fotografiere das Nektarbild. Wenn die Software darauf auffordert, speichert das Bild mit der Stichproben-Identifikationsnummer an der gewünschten Stelle und weist dann eine Punktzahl von eins bis vier basierend auf dem beobachteten Blattnektarphänotyp zu.

Verwenden Sie eine Pinzette oder die Hand, um die Hochblätter von der Blüte zu entfernen. Legen Sie die Blume auf ein sauberes Schneidebrett. Mit einer sterilen Klinge schneiden Sie den Stängel der Blüte ab und machen Sie dann einen geraden Schnitt entlang der Kante der entfernten Hochblätter.

Legen Sie das vorbereitete Blütengewebe kopfüber auf das vorgeschnittene weiße Blatt auf der Mikroskop-Bühne. Verwenden Sie die Kurs- und Feinjustierungsknöpfe, um die Klarheit des auf dem Bildschirm angezeigten Bildes zu verbessern. Speichere das Bild mit der entsprechenden Probenidentifikationsnummer.

Die digitale Bildaufnahme der abaxialen Blattfläche an der unteren Seite der mittleren Rippe zeigte zwei Phänotypen mit einer Punktzahl ohne Nektare an der mittleren Rippe. Und vier Punkte mit einem voll entwickelten Nektar mit Nektar. Bei der Analyse von Blütenproben auf Braktealnektar wurden zwei Phänotypen beobachtet, wobei eine Punktzahl keinen Nektar zeigte und vier eine vollständig ausgebildete Nektarproduktion zeigte.

Digitale Bilder von Nektarpflanzen zeigten deutlich sowohl Blatt- als auch Bracteal-Nektarstrukturen bei 10-, 20- und 40-facher Vergrößerung. Ausgewählte digitale Blattbilder, die dem Standardbewertungsformat entsprechen, zeigten die Punktzahl eins ohne Nektar, die zwei mit einem unterentwickelten Nektar, den Punkt drei mit einem kleineren Nektar und den Punkt vier bei einem vollständig entwickelten Nektar. Eine genaue Bewertung von nektarfreien Pflanzen aus den segregierenden Populationen von nektar- und nektarlosen Kreuzungen ist für die Auswahl nektarfreier Pflanzen unerlässlich, die sowohl Insektenschäden als auch Ertragsverluste verringern können.

Daher ist die Auswahl dieses Merkmals wichtig für nachgelagerte Anwendungen wie DNA-Marker, die mit dem nektarlosen Merkmal assoziiert sind und wertvolle Werkzeuge für die markerunterstützte Auswahl sind.