Screening-Assay für niedermolekulare Nematizide: Eine Methode mit mittlerem Durchsatz zum Screening potenzieller Nematizide gegen Ditylenchus dipsaci

Pflanzenparasitäre Nematoden wie Ditylenchus dipsaci sind mikroskopisch kleine Würmer. Die lebenden Würmer zeigen sinusförmige Bewegungen durch Muskelkontraktionen, und ihre Beweglichkeit ist ein wichtiger Faktor für ihre Gesundheit unter Kulturbedingungen.

Die Exposition gegenüber Nematiziden - chemischen Giftstoffen - kann wichtige biologische Prozesse beeinträchtigen und die Mobilität dieser kultivierten Nematoden beeinträchtigen und zu ihrem Tod führen.

Um niedermolekulare Nematizide zu screenen, nehmen Sie eine mit destilliertem Wasser enthaltende Multi-Well-Platte. Übertragen Sie mit einem sauberen Pinning-Tool die potenziellen kleinen molekularen Nematizide von der chemischen Stammplatte auf die Assay-Platte, um einen Transfer konsistenter Molekülmengen in jede Vertiefung sicherzustellen.

Geben Sie die gleiche Anzahl Nematoden in jede Vertiefung der Platte. Versiegeln Sie die Platten unter feuchten Bedingungen, um das Überleben und die Mobilität der Nematoden zu unterstützen. Inkubieren Sie die Platte unter leichtem Rühren, um zu verhindern, dass sich Würmer ansiedeln.

Während der Inkubation wirken verschiedene giftige kleine Moleküle auf Würmer und töten sie, während ungiftige keine Auswirkungen haben. Betrachten Sie die Platte unter einem Präpariermikroskop, um die Vertiefungen mit einer nicht beweglichen Wurmpopulation zu identifizieren.

Ergänzen Sie die Testplatten mit Natronlauge - einem chemischen Endpunktstimulans. Dies löst die Bewegung aller ruhenden Würmer aus und unterscheidet sie von toten.

Das Vorhandensein von unbeweglichen Würmern nach der Behandlung mit Natronlauge in einigen Vertiefungen bestätigt die Wirksamkeit entsprechender kleiner Moleküle als Nematizide.

Um die Assay-Platten vorzubereiten, gießen Sie autoklaviertes destilliertes Wasser in einen sterilen Trog und geben Sie 40 Mikroliter destilliertes Wasser aus dem Trog in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden und einer Mehrkanalpipette ab. Geben Sie Chemikalien aus den 96-Well-Chemikalien-Vorratsplatten in die Assay-Platten, indem Sie sie dreimal in die Chemikalienplatte stecken. Übertragen Sie dann die Pins 10 Mal in die Assay-Platte. Tupfen Sie es vor der Reinigungslösung auf Papier.

Um die Anzahl der Nematoden aus der Sammlung zu zählen, resuspendieren Sie zuerst die Sammlung und pipettieren Sie dann 5 Mikroliter der Lösung mit Spitzen mit geringer Retention auf einen Objektträger. Zählen Sie die Anzahl der Nematoden in 5 Mikrolitern mit einem Präpariermikroskop. Stellen Sie dann die Konzentration mit sterilem destilliertem Wasser auf zwei Würmer pro Mikroliter ein.

Geben Sie anschließend 10 Mikroliter der Probe mit einer Mehrkanalpipette und einem Trog in jede Vertiefung der 96-Well-Platten. Wickeln Sie die Teller mit einem feuchten Papiertuch ein und legen Sie sie in eine Schachtel. Fügen Sie dann ein zusätzliches feuchtes Papiertuch hinzu, um die Platten zu stabilisieren und eine minimale Bewegung zu gewährleisten, und befestigen Sie sie auf einem klebrigen Pad in einem 20 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator, der auf 200 U/min eingestellt ist.

Betrachten Sie die Platten an Tag 5 unter einem Präpariermikroskop. Zählen Sie die Anzahl der mobilen und Gesamt-D. dipsaci in DMSO-Lösungsmittelkontrollen und medikamentenbehandelten Vertiefungen.

Wenn die Würmer unbeweglich sind, geben Sie 2 Mikroliter 1 molare Natronlauge bis zu einer Endkonzentration von 40 Millimolar in die Vertiefung, um die Bewegung zu stimulieren. Berechnen Sie den Anteil der mobilen Würmer. In den D. dipsaci-Screens werden Vertiefungen, die reproduzierbar 0 % mobile Würmer ergaben, als starke Treffer eingestuft.