Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

Dieses Protokoll ermöglicht die spezifische Kennzeichnung und anschließende Anreicherung und Identifizierung von endogenen CK2-Substraten aus einer komplexen biologischen Probe wie einem Zell- oder Gewebelysat. Diese Methode kann auf jeden Zelltyp oder jedes Gewebe angewendet werden. So erleichtern, die Untersuchung von CK2 in verschiedenen biologischen Kontexten.

Demonstriert wird das Verfahren von John Chojnowski, einem Doktoranden aus meinem Labor. Zunächst wird die Gewebeprobe oder die kultivierten Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben, mechanisch lysieren, um insgesamt 900 Mikroliter Probe zu sammeln. Zentrifuge bei 17, 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für drei Minuten.

Dann übertragen Sie 270 Mikroliter des Überstandes auf jeweils drei neue 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohre. Entfernen Sie 40 Mikroliter des verbleibenden Überstandes, der als Eingangssteuerung verwendet werden soll, und übertragen Sie ihn in ein neues Rohr. Legen Sie alle Proben auf Eis.

Beschriften Sie zunächst jedes der drei Probenröhrchen, wie hier gezeigt. Zum Kinase-Reaktionsrohr 2,7 Mikroliter CK2 und 2,7 Mikroliter 2,5 Millimolar GTPgammaS hinzufügen. Streichen Sie die Röhre zu mischen, und legen Sie es sofort auf Eis.

Zum GTPgammaS nur Rohr, fügen Sie 2,7 Mikroliter von 2,5 Millimolar GTPgammaS, und 2,7 Mikroliter Lysis Buffer. Streichen Sie diese Röhre zu mischen, und legen Sie es sofort auf Eis. Zum PNBM Only Tube 5,4 Mikroliter Lysis Buffer hinzufügen.

Streichen Sie die Röhre zu mischen, und legen Sie es sofort auf Eis. Alle drei Röhren in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius für eine Minute inkubieren. Danach fügen Sie 13,5 Mikroliter PNBM bei 12 Milligramm pro Milliliter zu jeder Röhre hinzu.

Invertieren Sie die Rohre, um die Proben zu mischen, und inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für eine Stunde. Während die Proben inkubiert werden, beschriften Sie jede der Spalten für das zu ladende Beispiel, wie hier gezeigt. Bereiten Sie die Spalten vor, indem Sie jede Spalte mehrmals umkehren, um das Sephadex G-25-Harz im Speicherpuffer wieder auszusetzen.

Befestigen Sie jede Säule an einem Klemmständer, und lassen Sie sie etwa fünf Minuten ungestört sitzen, damit sich das Harz absetzen kann. Platzieren Sie als Nächstes eine Röhre unter der unteren Öffnung jeder Spalte. Entfernen Sie die Kappen sowohl von der Ober- als auch vom Unterseite jeder Säule, damit der Speicherpuffer durch Schwerkraft in die Rohre abfließen kann.

Sobald der Speicherpuffer erschöpft ist, fügen Sie jeder Spalte etwa 2,7 Milliliter Lysispuffer hinzu, um sie auszulagern, und stellen Sie sicher, dass der Durchfluss gesammelt und verworfen wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie Lysis Buffer hinzufügen und den Durchfluss dreimal verwerfen. Laden Sie zunächst jedes Beispiel in die jeweilige Spalte.

Sammeln und verwerfen Sie den Fluss durch. Fügen Sie 420 Mikroliter Lysisbuffer zu jeder Spalte hinzu, um die Proben zu waschen. Lassen Sie den Lysispuffer durch die Spalte filtern, und sammeln und verwerfen Sie den Flow durch.

Platzieren Sie dann Die Rohre unter jeder Spalte für die Probenentnahme. Fügen Sie 500 Mikroliter Lysisbuffer zu jeder Spalte hinzu, um die Proben zu löschen. Sammeln Sie den Durchfluss, der nun eine angereicherte Population von thiophosphorylierten und alkylierten CK2-Substraten in der Kinase-Reaktion enthält.

Die gtPgammaS-Reaktion enthält Substrate, die von jedem endogenen CK2-Wert thiophosphoryliert und alkyliert werden. Die reine PNMB-Reaktion enthält alkylierte Hintergrundproteine. Entfernen Sie 80 Mikroliter aus jeder Elution als Elution Input Control Probe.

Als nächstes teilen Sie jede Probe in zwei Röhren auf, die jeweils 200 Mikroliter enthalten. Beschriften Sie jede der Röhren als Antithiophosphatester oder Immunglobulin G, wie hier gezeigt. Fügen Sie 2,8 Mikrogramm Antithiophosphatester-Antikörper zu jedem der Antithiophosphat-Ester-Röhren hinzu.

Fügen Sie jedem der IGG-Röhren 2,8 Mikrogramm Isotype Control Antikörper hinzu. Dann legen Sie die Rohre auf einen Rotator bei vier Grad Celsius für zwei Stunden. Während der letzten 15 Minuten der Probeninkubation verwenden Sie eine saubere Rasierklinge, um das Ende einer P200 Pipettenspitze abzuschneiden, um die Spurweite zu erhöhen.

Unmittelbar vor der Verwendung das Speicherrohr mit den Agaroseperlen kurz wirbeln. Mit der geschnittenen Pipettenspitze 100 Mikroliter der Perlenschlämme pro Immunpräzipitation auf ein neues 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen. Es ist wichtig, die Perlen vor jedem Transfer zu wirbeln, um zu verhindern, dass sich Perlen absetzen.

Zentrifugieren Sie die Rohre bei 17, 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für eine Minute. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Perlen wieder auf, indem Sie 200 Mikroliter Lysis Buffer hinzufügen und kurz wirbeln, um sie zu mischen.

Wiederholen Sie diesen Prozess des Zentrifugierens und Waschens der Perlen dreimal. Nach der letzten Wäsche die Perlen auf Eis legen, bis sie fertig sind. Wenn die Proben die Inkubation beendet haben, zentrifugieren Sie sie bei 17, 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für drei Minuten.

Dann 200 Mikroliter jeder Probe in die Röhrchen mit den gewaschenen Perlen geben. Legen Sie die Rohre eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einen Rotator. Als nächstes zentrieren Sie die Rohre bei 17, 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für eine Minute.

Entfernen Sie 40 Mikroliter von jedem Überstand, um ihn als Erschöpfungskontrolle zu speichern. Entfernen und entsorgen Sie den Rest des Überstandes, wobei Sie darauf achten, die Perlen nicht zu stören. Waschen Sie die Proben, indem Sie jeweils 200 Mikroliter Lysisbuffer hinzufügen und kurz wirbeln.

Zentrifuge bei 17, 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für eine Minute, den Überstand zu entsorgen. Wiederholen Sie diesen Wasch- und Zentrifugationsprozess dreimal mit Vorsicht, um die Perlen nicht zu stören. Danach fügen Sie 50 Mikroliter 2X Probenpuffer zu jeder Probe hinzu, die Perlen enthält.

Für alle anderen Samples, zu denen das Eingabesteuerelement, die Elution Input Controls und die Depletion Controls gehören, fügen Sie 8 Mikroliter 6X Sample Buffer hinzu. Pipette jede Röhre nach oben und unten mit Ausnahme von Rohren mit Perlen zu mischen, und erhitzen Sie alle Proben bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, bevor Sie mit SDS-PAGE fortfahren. Um zu beurteilen, ob die Immunpräzipitation erfolgreich war, führen Sie 25 bis 30 Mikroliter jeder Probe durch, die perlend auf einem separaten 12,5%Polyacrylamid-Gel entging.

Färben Sie jedes Gel mit Coomassie Blue, um angereicherte Proteine aus verschiedenen Stadien des experimentellen Protokolls zu visualisieren. Mit neuen, sauberen Rasierklingen, sorgfältig verbrauchen alle einzigartigen Bänder in der Kinase-Reaktion Anti-Thiophosphat-Ester IP Lane vorhanden, während sie ihre ungefähren Molekulargewichte beachten. Für jedes einzelne Band sollte eine neue Rasierklinge verwendet werden.

Die Zugrundeliegende dieser Technik ist diese Technik die ungewöhnliche Fähigkeit von CK2, GTP für phosphorylgruppentransfer zu verwenden. Die Zugabe von exogenem CK2-Holoenzym zusammen mit dem GTP-Analog, GTPgammaS, zu einem Zelllysat führt zu einer Thiophosphorylierung endogener CK2-Substrate. Die nachfolgende Behandlung des Lysats mit dem Alkylierungsreagenz p-Nitrobenzyl-Mesylat erzeugt Thiophosphatester-Moiety auf diesen spezifischen Substratproteinen, die dann mit einem Antithiophosphatester-Antikörper immunpräzipiert und schließlich durch Massenspektrometrie identifiziert werden können.

In den hier gezeigten repräsentativen positiven Ergebnissen waren CK2-abhängige Thiophosphorylierung und anschließende Alkylierung erfolgreich. Wie erwartet wird ein verbessertes Antithiophosphat-Ester-Signal durch Western Blotting nur in der Spur beobachtet, die die vollständige Kinase-Reaktion enthält, und nicht nur in den GTPgammaS- und PNMB-Proben. Ein Coomassie Blue-Gefärbtgel der immunpräzipierten und angedeuteten Proteine weist ebenfalls ein positives Ergebnis auf.

Da mehrere einzigartige Bänder nur in der Antithiophosphat-Ester-IP-Lane zu erkennen sind, in der das Lysat mit exogenen CK2 und GTPgammaS inkubiert wurde. Das markierte Band wird dann aus dem Gel entfernt und zur Proteinidentifikation mittels Massenspektrometrie eingereicht. Nach diesem Verfahren müssen vermeintliche CK2-Substrate, die durch eine Massenspektrometrie identifiziert werden, mit einem zusätzlichen Ansatz validiert werden, z. B. durch CK2-abhängige Phosphorylierung in einem Standard-In-vitro-Kinase-Assay.