Bewertung der Keratinozyten Verbreitung auf zwei- und dreidimensionale Typ I Kollagen Substrate
22. April 2019
Hier prĂ€sentieren wir ein Protokoll fĂŒr die Zubereitung von zwei verschiedenen Formen der Kultursubstrate nutzen Typ I Kollagen. Je nach mit Kollagen Umgang KollagenmolekĂŒle entweder zweidimensionale, nicht faserigen Form beibehalten oder wieder zusammenbauen in Fibrille DreidimensionalitĂ€t. Zellproliferation auf Typ I Kollagen ist drastisch Fibrille Bildung betroffen.
Dieses Video zeigt, wie zwei verschiedene Arten von Zellkultursubstraten mithilfe von Kollagen typ I und einer zweidimensionalen und dreidimensionalen Kulturmethode vorbereitet werden. Die dreidimensionale Kulturmethode wird als biologische Umgebung betrachtet, was zeigt, wie man leicht ein dreidimensionales Kultursubstrat vorbereitet, ist fĂŒr Studien nĂŒtzlich. In zahlreichen Zelltypen variiert das Zellverhalten trotz der Verwendung des gleichen Kollagens erheblich zwischen zwei- und dreidimensionalen Substraten.
Mit Hilfe des dreidimensionalen Kultursubstrats könnte das Zellverhalten, das dem von lebenden Organismen Àhnlicher ist, leicht untersucht werden. Diese Methode ist sehr einfach und erfordert minimale spezielle Reagenz. Visuelle Demonstration ist wichtig, denn wÀhrend wir zeigen wollen, dass diese Methode leicht versucht werden kann, ist das dreidimensionale Gel zerbrechlich, und die richtige Handhabung ist sehr wichtig.
Zu Beginn bereiten Sie das entsprechende Kulturmedium vor. Um mit der Vorbereitung des Kollagens zu beginnen, legen Sie 10x PBS, entionisiertes Wasser, Kollagen, eine 96-Well-Kulturplatte und eine leere Zwei-Milliliter-Röhre auf Eis. Mit einer Pipette 1,12 Milliliter entionisiertes Wasser in das leere Zwei-Milliliter-Rohr geben.
FĂŒgen Sie dem entionisierten Wasser 200 Mikroliter 10x PBS hinzu und schĂŒtteln Sie das Rohr mehrmals vorsichtig. Unmittelbar vor der Anwendung 0,66 Milliliter Kollagen in die Zwei-Milliliter-Röhre geben. SchĂŒtteln Sie die Röhre vorsichtig und schnell mehrmals.
GieĂen Sie 100 Mikroliter dieser Kollagenlösung in jeden Brunnen der 96-Well-Kulturplatte und decken Sie die gesamte OberflĂ€che der Brunnen ab. SchĂŒtteln Sie die Platte vorsichtig mit einer Bewegung von links nach rechts. Inkubieren Sie die Kulturplatte in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius fĂŒr eine Stunde.
Dann kippen Sie die Platte, um die Gelation des Kollagens zu bestĂ€tigen, und bewegen Sie die Kulturplatte auf eine saubere Bank. GieĂen Sie 150 Mikroliter K110 vorsichtig auf die Gele, indem Sie entlang der Wand des Brunnens pfeifen. In einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius fĂŒr eine Stunde inkubieren.
Danach bewegen Sie die Kulturplatte auf eine saubere Bank. Unmittelbar vor der Zellkultur verwenden Sie eine Pipette, um den K110 vorsichtig zu entsorgen. Verwenden Sie zunĂ€chst eine Pipette, um vier Mikroliter Kollagen zu 1,2 Milliliter einer Millimolaren SalzsĂ€ure in einem 1,5-Milliliter-Rohr hinzuzufĂŒgen, und mischen Sie es vorsichtig.
GieĂen Sie 100 Mikroliter dieser Kollagenmischung in jeden Brunnen einer neuen 96-Well-Kulturplatte. SchĂŒtteln Sie die Platte vorsichtig in einer Bewegung von links nach rechts und bebrĂŒten Sie bei Raumtemperatur eine Stunde lang. Danach entsorgen Sie die Kollagenlösung.
Mit einer Pipette, waschen Sie jeden gut mit PBS. FĂŒgen Sie 150 Mikroliter 1%BSA und PBS zu jedem Brunnen der Kulturplatte hinzu und brĂŒten Sie bei Raumtemperatur fĂŒr eine Stunde. Verwerfen Sie vor der Zellkultur die 1%BSA-Lösung.
Bereiten Sie zunĂ€chst die FEPE1L-8-Zellen und die K110-, Trypsin- und Trypsin-Inhibitoren wie im Textprotokoll beschrieben vor. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus der Kulturschale, und verwenden Sie eine Pipette, um drei Milliliter 0,05%Trypsin hinzuzufĂŒgen. Legen Sie die Schale wieder in den Kohlendioxid-Inkubator und brĂŒten Sie bei 37 Grad Celsius fĂŒr fĂŒnf Minuten.
Verwenden Sie dann die Phasenkontrastmikroskopie bei 10-facher VergröĂerung, um die Zellablösung von der OberflĂ€che der Kulturschale zu ĂŒberprĂŒfen. FĂŒgen Sie drei Milliliter Trypsin-Inhibitor hinzu, und verwenden Sie eine Pipette, um die abgetrennten Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenrohr zu sammeln. Zentrifuge bei 200 mal g fĂŒr fĂŒnf Minuten.
Danach den Ăberstand entsorgen und das Pellet in 10 Milliliter K110 wieder aufhĂ€ngen. Verwenden Sie die Phasenkontrastmikroskopie bei 10-facher VergröĂerung, um die Zellen zu zĂ€hlen, und verdĂŒnnen Sie die Zellen mit K110 auf eine Zelldichte von 50 000 Zellen pro Milliliter. Saugen 0,1 Milliliter der Zellsuspension in jeden Brunnen der Kulturplatte, indem sie entlang der Wand des Brunnens pfeifen.
In kubieren Inkubation in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius fĂŒr die entsprechende Dauer. Mischen Sie zunĂ€chst 130 Mikroliter Tetrazoliumsalz und WST-8 mit 1,3 Millilitervorgeheiztem K110 in einem Zwei-Milliliter-Rohr. Bewegen Sie die Kulturplatte auf eine saubere Bank und verwenden Sie eine Pipette, um die K110 vorsichtig aus den Brunnen zu entsorgen.
Mit K110 sanft wegwaschen und nicht haftende Zellen. Dann fĂŒgen Sie 110 Mikroliter K110 gemischt mit WST-8 zu jedem Brunnen. In einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius fĂŒr zwei Stunden inkubieren.
Danach bewegen Sie die Kulturplatte auf eine saubere Bank. Sammeln Sie 100 Mikroliter des konditionierten Mediums aus jedem Brunnen und bewegen Sie es in die Brunnen einer neuen 96-Well-Kulturplatte. Messen Sie mit einem Mikroplattenleser die Absorption von 450 Nanometern und schÀtzen Sie die Anzahl lebensfÀhiger Zellen.
Die Zellmorphologie wird auf den nichtfaserigen und fibrillen Formen beobachtet. In den ersten zwei Stunden der Kultivierung haften und verbreiten sich die Zellen auf beiden Formen von Kollagen. Drei Tage nach der Aussaat breiten sich die Zellen auf der nichtfaserigen Form weiter aus, und die Zellzahlen nehmen zu, wÀhrend die Zellen auf der fibrilen Form eine begrenzte Ausbreitung aufweisen.
FEPE1L-8-Zellen vermehren sich weiterhin auf der nichtfaserigen Form von Kollagen Typ I und auf den unbehandelten SchalenoberflÀchen. Im Gegensatz dazu vermehren sich die Zellen nicht auf der fibrilen Form. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das dreidimensionale Gel sehr zerbrechlich ist.
Man muss aufpassen, dass die Lösung oder die Spitzen nicht direkt mit den Gelen in BerĂŒhrung kommen. Diese Methode kann auf vielfĂ€ltige Weise geĂ€ndert werden. Um beispielsweise die Membrankomponenten der Probe zu mischen, kann man ein Zellkultursubstrat herstellen, das eine Kellermembran imitiert.
In zahlreichen FÀllen sind die Funktionen der extrazellulÀren Matrix in lebenden Körpern unbekannt. Um Zellen in der dreidimensionalen Kultur zu kulturieren, kann man die Funktion der extrazellulÀren Matrixkomponente untersuchen, die dem lebenden Körper Àhnlicher ist. Durch die Anwendung dreidimensionaler Gelkulturtechniken kann man effektiv die Konzentration von Medikamenten in Zellen testen.
Dieses Aufderatrat könnte verwendet werden, um komplexe dreidimensionale Kultursubstrate zu entwickeln, indem andere EGM-Komponenten oder Wachstumsfaktoren wÀhrend der Gelationen gemischt werden.
Ăbersicht
Dieser Artikel prĂ€sentiert ein Protokoll zur Herstellung von zwei Arten von Zellkultursubstraten unter Verwendung von Kollagen Typ I und hebt die Unterschiede im Zellverhalten auf zweidimensionalen gegenĂŒber dreidimensionalen Substraten hervor.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellkulturtechniken
- Herstellung von Kollagensubstraten
- Analyse des Zellverhaltens
Hintergrund
- Typ I Kollagen kann in zwei Formen existieren: nicht-fibrĂŒs und fibrillĂ€r.
- Die Zellproliferation wird durch die verwendete Form des Kollagens erheblich beeinflusst.
- Dreidimensionale Kulturmethoden ahmen biologische Umgebungen besser nach.
- Der Umgang mit dreidimensionalen Gelen erfordert Sorgfalt aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit.
Zweck der Studie
- Eine einfache Methode zur Herstellung von kollagenbasierten Kultursubstraten zu demonstrieren.
- Das Zellverhalten auf zweidimensionalen und dreidimensionalen Substraten zu vergleichen.
- Studien zu erleichtern, die eine biologisch relevantere Umgebung erfordern.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Kollagenlösungen und Kulturplatten.
- Inkubation der Substrate zur Förderung der Gelierung.
- Zelllösung und ZÀhlung unter Verwendung von Trypsin.
- Bewertung der ZelllebensfÀhigkeit durch Absorptionsmessung.
Hauptergebnisse
- Zellen proliferaierten effektiver auf nicht-fibrĂŒsem Kollagen im Vergleich zu fibrillĂ€ren Formen.
- Die Zellmorphologie variierte erheblich zwischen den beiden Substrattypen.
- Dreidimensionale Kulturen lieferten Einblicke in das Zellverhalten Àhnlich den in-vivo-Bedingungen.
- Die Zerbrechlichkeit der dreidimensionalen Gele erforderte eine sorgfÀltige Handhabung.
Schlussfolgerungen
- Dreidimensionale Kultursubstrate können die Untersuchung des Zellverhaltens verbessern.
- Diese Methode kann fĂŒr verschiedene experimentelle BedĂŒrfnisse angepasst werden.
- Das VerstĂ€ndnis der Rolle der extrazellulĂ€ren Matrix ist entscheidend fĂŒr zukĂŒnftige Forschung.
HĂ€ufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Evaluating keratinocyte proliferation on two- and three-dimensional type I collagen substrates enables mechanistic de-risking in target validation by revealing how extracellular matrix architecture influences cellular behavior. This comparative approach supports predictive confidence in preclinical models by identifying substrate-dependent differences in adhesion, spreading, and proliferation. Such insights inform assay development and phenotypic screening strategies where physiological relevance is critical for drug efficacy assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by clarifying how collagen dimensionality affects keratinocyte proliferation and adhesion.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct comparison of cell behavior on physiologically relevant versus standard culture substrates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing substrate-specific proliferation baselines.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility through defined collagen preparation and gelation protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances disease relevance by modeling wound healing-like conditions using on-gel keratinocyte culture.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation by mimicking in vivo extracellular matrix environments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable platform to assess how extracellular matrix composition influences cellular phenotypes prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating the variable of collagen dimensionality.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative viability readouts via WST-8 absorbance.
- Analytics: Enables comparative analysis of cell proliferation and morphology between 2D and 3D conditions using microplate reader outputs.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling physiological cell behaviors relevant to drug efficacy testing.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to various cell types and extracellular matrix component screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in keratinocyte responses to extracellular matrix cues.
- Operational Value: Promotes standardization and scalability through simple, reagent-minimal collagen preparation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying substrate-dependent proliferation risks early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on physiological relevance of culture systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture techniques and extracellular matrix biology.
- Depends on standard laboratory instrumentation including incubators, pipettes, phase contrast microscopes, and microplate readers.
- Necessitates cross-team standardization of collagen handling due to gel fragility and sensitivity to mechanical disruption.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or extracellular matrix compositions.
- Includes practical limitations such as the fragility of three-dimensional gels requiring careful handling to avoid damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:12
Preparation of Keratinocyte Culture Medium and the Fibril Form of Type I Collagen
2:53
Preparation of the Non-fibrous Form of Type I Collagen
3:50
Culture of FEPE1L-8 Cells
5:20
Estimation of the Number of Viable Cells
6:20
Results: Evaluation of Keratinocyte Proliferation
7:01
Conclusion
