Name: Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Lernen Sie die Herstellung dreidimensionaler Epithelgewebe in Kollagenmatrix für Gewebeengineering und Zellverhaltensforschung. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle mechanischer und biochemischer Faktoren mit hoher statistischer Aussagekraft.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem NIH (HL118532, HL120142, CA187692), der David &amp; Lucile Packard Foundation, der Camille &amp; Henry Dreyfus-Stiftung unterstützt wird, und der Burroughs Welcome Fund. ASP wurde teilweise durch eine Charlotte Elizabeth Procter ehrende Fellowship unterstützt.

1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Zur Herstellung einer 5 mg / ml - Lösung von Insulin, verdünnen das pulverisierte Insulin Lager mit 5 mM Salzsäure (HCl) in dH 2 O (500 mg Insulin in 100 ml Lösungsmittel). Herstellung von 100 ml Lösungsmittel durch 50 &amp; mgr; l konzentrierter HCl Zugabe zu 100 ml destilliertem Wasser (dH 2 O). </li><li> Um eine 1x PBS - Lösung machen, verdünnen das 10x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Stammlösung mit dH 2 O unter sterilen Bedingungen auf 1x. </li><li> Bereiten Sie das Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomerlösung wie folgt: mischen Sie das PDMS-Präpolymer zusammen mit dem Härter in einem 10: 1 (w: w) Verhältnis. </li><li> Bereiten Sie die Zellkulturmedium wie folgt: zu 500 ml Lager Dulbecco modifiziertem Eagle Medium: Nährsalzgemisch F-12 (DMEM / F-12), 10 ml sterilem fötalen Rinderserum (FBS), 500 ul Gentamicin Reagens und 500 &amp; mgr; l von 5 mg / ml Insulin. </li><li> Um die 1% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS-Lösung zuzubereiten, 1% (w: V) Lösung Pulver von BSA PBS auf 1x und gründlich mischen. </li><li> Um eine 4 mg / ml-Lösung von neutralisiert Rinder-Typ vorbereiten I-Kollagen, fügen Sie 50 ul 10x Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS) Puffer, 30 ul 0,1 N Natriumhydroxid (NaOH), 30 &amp; mgr; l Zellkulturmedium und 400 ul Lager Kollagen zu einem gekühlten Mikrozentrifugen-Röhrchen von 1,5 ml. Mischen Sie langsam durch Pipettieren nach oben und unten; vermeiden Blasen einzuführen. Um alle Blasen zu entfernen, kurz die Mischung bei 4 ° C zentrifugiert werden. </li><li> Bereiten Sie eine Fixierungslösung um 16% Paraformaldehyd Verdünnung 1: 4 (v: v) in 1x PBS. </li><li> Bereiten Sie eine Kerne Markierungslösung durch den Bestand Kerne Markierungslösung verdünnt 1: 1000 (v: v) in 1x PBS. </li><li> Vorbereiten eines 0,3% Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung und Detergens (PBST) Lösung, die durch Mischen von 1x PBS mit 0,3% (v: v) Waschmittel. </li><li> Bereiten Blocking-Puffer durch Verdünnen Ziegenserum 01.10 (v: v) in 0,3% PBST. </li><li> Bereiten eines primären Antikörperlösung für ein bestimmtes Protein von Interesse durch Verdünnen priMary Antikörper (beispielsweise Kaninchen-anti-focal adhesion kinase (FAK)) 1: 200 (v: v) in Blocking-Puffer. </li><li> Vorbereiten eines sekundären Antikörperlösung durch eine fluoreszierende Sonde konjugierte Antikörper verdünnt (beispielsweise Ziegen-anti-Kaninchen) 1: 1000 (v: v) in Blocking-Puffer. </li></ol> 2. Herstellung von Elastomer-Briefmarken für 3D-Mikrostrukturierung Hinweis: Elastomeres Stempel werden mit PDMS hergestellt. <ol><li> Machen Sie eine PDMS-Lösung im gleichen Verhältnis wie 1.3 in Schritt beschrieben und gründlich mischen. Platzieren der Mischung in einer Vakuumkammer für 15-30 min alle Luftblasen zu entfernen, die während des Mischprozesses eingebracht wurden. </li><li> Gießen Sie die entgaste Lösung in eine Plastik wiegen Boot oder eine Petrischale mit einem Silizium-Master enthält, die lithographisch mit Eigenschaften der gewünschten Geometrie strukturiert wird. Für die besten Ergebnisse, heilen die PDMS-Lösung bei 60 ° C für ca. 12 Stunden. Hinweis: Die Silizium-Meister hochgradig anpassbar sind; Dieses Protokoll verwendet rechteckige Strukturen mit Abmessungen von 50&amp; mgr; m × 200 &amp; mgr; m × 50 &amp; mgr; m Abstand 200 &amp; mgr; m voneinander entfernt. Die Silizium-Master können unter Verwendung von Standard-Photolithographietechniken hergestellt werden. Kurz gesagt wird ein auf Epoxybasis Photoresist auf einem Siliciumwafer spinbeschichtet. Eine Maske, die gewünschten Stempel Funktionen Detaillierung ist auf der Oberseite des Photoresist beschichteten Wafer angeordnet, die dann mit UV-Licht ausgesetzt wird. Die gewünschten Eigenschaften, die nicht von der Maske blockiert werden dem Licht ausgesetzt und der Photoresist an diesen Stellen wird vernetzt, während der Rest der Photoresistschicht löslich ist, und kann weggespült werden. </li><li> Nachdem das PDMS um die gewünschten Funktionen auf dem Silizium-Master ausgehärtet ist, entfernen Sie die PDMS und Master aus dem Plastikbehälter. Trennen Sie sorgfältig die PDMS aus dem Siliziumwafer und den Überschuss entfernen PDMS aus um die geprägten Merkmale einer sauberen Rasierklinge. </li><li> Schneiden Sie nun die PDMS gemustert mit aufgedrucktem Funktionen in einzelne rechteckigen Stempel (~ 8 mm x 5 mm) mit einer Rasierklinge. Bewahren Sie diese Funktion Seite nach oben in einem cleein 100-mm-Durchmesser Petrischale. </li><li> Darüber hinaus verwenden die PDMS-Lösung 1.3 in Schritt beschriebenen Träger für die rechteckigen Stempel zu machen. </li><li> Verwendung einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung, verteilt ~ 2-3 g des PDMS-Lösung gleichmäßig auf einer 100-mm-Durchmesser-Petrischale und härten die PDMS für ~ 12 Stunden bei 60 ° C, wie in Schritt 2.1. Dann mit einer Rasierklinge, schneiden Sie die dünne Schicht aus PDMS in Rechtecke (~ 5 mm x 2 mm). Hinweis: Zwei Stützen für jeden PDMS-Stempel in 2.3 Schritt gemacht benötigt werden. Die Träger können in der 100-mm-Durchmesser-Petrischale aufbewahrt werden, die die PDMS-Stempel enthält. </li><li> Bevor die PDMS-Stempel und Träger können für die Zellkultur verwendet werden, Sterilisieren durch Eintauchen in 70% Ethanol und trocken unter Verwendung eines Aspirator in einer biologischen Sicherheit Schrank (Zellkulturhaube). </li></ol> 3. Herstellung von 3D-Epithelgewebe <ol><li> In einem Biosicherheitsschrank, fügen Sie oben auf jeder Stempel einen Rückgang von etwa 50 &amp; mgr; l von 1% BSA in PBS. Legen Sie die Tröpfchen bei 4 ° C bedeckt Briefmarken für einen Minimum von 4 h, um sicherzustellen, dass das BSA an die Oberfläche des Stempels adsorbiert. </li><li> Absaugen BSA-Lösung aus den PDMS-Stempel. </li><li> Waschen der Oberflächen der zwei Mal mit Zellkulturmedium Tempel (50 &amp; mgr; l pro Wasch pro Stempel sollte ausreichend sein) und nach jeder Wasch Absaugen. </li><li> Behandeln Sie die sterilisierten PDMS-Stempel und Träger mit gebogenen Pinzette aus rostfreiem Stahl. In einem Biosicherheitsschrank, legen Sie ein 35-mm-Durchmesser-Gewebekulturschale für jeden Stempel PDMS. In jedem Gericht, legte sich zwei PDMS unterstützt durch einen Abstand, der etwas kleiner als die Länge der Stempel PDMS getrennt. </li><li> Mit Hilfe der Pinzette, sterilisieren, so viele kreisförmige Glasplättchen (15 mm Durchmesser, # 1), da PDMS-Stempel unter Verwendung von 70% igem Ethanol sind. Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit aus den Deckgläsern, während sie mit der Pinzette zu halten. Bewahren Sie die gewaschenen Deckgläser in einem separaten 100-mm-Durchmesser Petrischale. </li><li> Dispense ~ 50 &amp; mgr; l der Kollagenmischung zu gleichmäßig zu beschichten die Oberfläche jedes PDMS-Stempel. </li><li> Abholenjeweils mit Kollagen beschichteten PDMS-Stempel mit der Pinzette und invertieren sie sanft. Senken die invertierten Stempel auf der Oberseite des PDMS unterstützt gelegt in 35-mm-Durchmesser-Gewebekulturklöpper, so dass das Kollagen zwischen dem Stempel und dem Boden der Gewebekulturschale ist. Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Dispense ~ 50 &amp; mgr; l der verbleibenden Kollagenmischung auf jede der kreisförmigen Deckgläser (später, werden diese auf der Oberseite der engineered Gewebe platziert werden, um sie vollständig in Kollagen einkapseln) und inkubieren bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Besorgen Sie sich einen 100-mm-Durchmesser-Gewebekulturschale mit Epithelzellen (ex. EpH4 Maus Brustepithelzellen) bei ~ 40% Konfluenz. Absaugen Zellkulturmedium und wäscht einmal mit 10 ml 1x PBS. 2 ml Trypsin zu den Zellen und inkubiere bei 37 ° C für 5-10 min. </li><li> 8 ml frisches Kulturmedium auf die Gewebekulturschale mit Trypsin behandelt Zellen enthält, löst alle verbleibenden adhärenten Zellen von der Schale. Vorsichtig mischen durch Pipettieren und bewegen Sie das Zellgemisch in ein 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 100 × g für 5 min. </li><li> Absaugen Überstand aus dem konischen Rohr und Resuspendieren des Zellpellets in Zellkulturmedium. unter Verwendung eines Hämozytometers zählen die Zellen die Konzentration der Suspension zu bestimmen. Stellen Sie das Suspensionsvolumen um eine Endkonzentration von ~ 10 6 bis 10 7 Zellen / ml zu erhalten. </li><li> Entfernen Sie die gelierte Kollagenproben aus dem Inkubator. Mit der Pinzette, heben Sie vorsichtig die PDMS-Stempel gerade nach oben, sie aus dem geformten Kollagen zu lösen und sie zu verwerfen. </li><li> Dispense ~ 30 &amp; mgr; l der konzentrierten Zellsuspension auf die Oberfläche jedes Kollagengel Formhohlräume der gewünschten Geometrie enthält. Beachten Sie die Zellen unter einem Hellfeldmikroskop mit einem Objektiv 10x / 0,25 NA , während sanft die Gerichte Seite Schütteln zur Seite Zelle zu fördern innerhalb der Hohlräume nieder. Die Hohlräume sollten innerhalb von ca. 5 min gefüllt werden. </li><li> Um reMove die Hohlräume überschüssige Zellen aus der Umgebung, neigen jedes Schalenkultur Gewebe auf seiner Seite und sanft verzichtet ~ 400 &amp; mgr; l Zellkulturmedium über die Oberfläche des Kollagengels. Saugen Sie die Flüssigkeit, und wiederholen Sie den Wasch 1-2 weitere Male, die Kollagen-Gelen unter dem Mikroskop in zwischen jeder Wäsche zu überprüfen. </li><li> Nachdem die überschüssigen Zellen aus um die Zelle gefüllten Hohlräume in der Kollagenform gelöscht wurden, legen die Gewebekulturschalen in einer Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C für 15 min. Dann mit der Pinzette vorsichtig umdrehen, die mit Kollagen beschichteten Klasse Deck und legen Sie sie auf der Oberseite der Zelle gefüllten Kollagen Formen, so dass das Kollagen aus den Deckgläsern bildet eine Kappe über den Zell gefüllte Hohlräume. Inkubieren der Proben bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Sobald die Kollagenkappen an die Zelle gefüllten Kollagen Form anhaften, verzichtet ~ 2-2,5 ml Zellkulturmedium langsam über das Deckglas auf der Gele. Kultur die Proben bei 37 ° C für 1-3 Tage. Hinweis:24 h nach der anfänglichen Aussaat können die epithelialen Geweben mit Wachstumsfaktoren wie epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) oder Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) behandelt Verzweigung zu induzieren. </li></ol> 4. Immunofluoreszenz und Bildanalyse <ol><li> Saugen Sie das Zellkulturmedium aus den Gewebekulturschalen und fügen Sie genug Fixierungslösung, die zellhaltigen Gelen zu decken. Inkubieren Sie die Gerichte bei Raumtemperatur für 15 min auf einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Saugen Sie das Fixiermittel, füllen Sie die Gewebekulturschalen mit 1x PBS und Inkubation für 15 min auf einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt drei Wäschen. </li><li> Zur Kennzeichnung der Kerne: absaugen PBS aus der Gewebekulturschale und ersetzen mit Hoechst Lösung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15-20 min. Um FAK oder einen anderen Marker Fleck, der mit Antikörper nachweisbar ist, überspringen 4,5 Schritt. </li><li> Saugen Sie das Kernmarkierungslösung und waschen Sie die Zellen enthaltende gels dreimal mit 1x PBS, wie in Schritt 4.2. Befleckten Proben können in 1x PBS bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden. </li><li> Um sich für ein Protein von Interesse Fleck: absaugen PBS aus den Gewebekulturschalen, fügen Sie 300 ul 0,3% PBST und inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Saugen Sie das PBS, decken Sie die Gele mit Blocking-Puffer und Inkubation auf einem Schüttler (200 UpM) bei Raumtemperatur für ca. 4 Std. </li><li> Saugen Sie den Blockierungspuffer, decken Sie die Gele mit primären Antikörperlösung und bei 200 Umdrehungen pro Minute über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler inkubiert. </li><li> Aspirieren die primäre Antikörperlösung, Zugabe von 0,3% PBST-Lösung und Inkubieren auf einem Schüttler bei 200 rpm für 30 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie das PBST und wiederholen Sie alle 30 min für 3-4 Std. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.7 und 4.8, diesmal mit der sekundären Antikörperlösung inkubiert. Wickeln der Gewebekulturschalen mit Aluminiumfolie gegen Ausbleichung des sekundären Antikörpers zu verhindern. Nach dem final Wäsche, Bunt Proben können in 1x PBS bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden. </li><li> Um Proben zu visualisieren, verwenden Sie einen 10X / 0,30 NA - Objektiv auf der Mittelebene der epithelialen Geweben konzentriert. </li><li> Zur Visualisierung Zellkerne, Bild fixierten Proben mit einem nuklearen Marker markiert mit einem 10x / 0,30 NA - Objektiv unter UV - Beleuchtung. </li><li> Zur Visualisierung Proben für ein Protein von Interesse gefärbt, Bild ein 10x / 0,30 NA - Objektiv auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Um Frequenz Karten von Proteinfärbung von mehreren Geweben erstellen (in der Regel 50 oder mehr) von identischen Ausgangsgeometrie, erste Import jedes der Bilder Standardbildanalyse-Software (siehe Materialien) und wandeln sie in 8-Bit-Graustufen. </li><li> Um Schwelle dieser Bilder, wandeln sie in binäre (dh Halbton / schwarz und weiß) durch ein Grau Cutoff - Punkt definieren; Grauwerte unterhalb der Schwelle schwarz werden, und diejenigen, oberhalb der Schwelle werden weiß. Dann kombinierenjedes der einzelnen binären Bilder in einer einzigen Bildstapel. </li><li> Als nächstes registrieren die gestapelten Bilder (dh ausrichten oder sie entsprechen) in der Analyse - Software. Viele Bildanalyse-Software-Pakete sind mit einem frei verfügbaren Registrierung Plugin. <ol><li> Verwenden, um jedes Bild in einem Stapel als Vorlage für die Ausrichtung des nächsten Bildes, so dass die Bilder in dem gesamten Stapel werden durch Ausbreitung ausgerichtet sind. Schließlich Overlay (Projekt) werden die Bilder in der ausgerichteten Bildstapel auf mittlere Intensität anhand eines einzelnen Bildes mit einer Pixelfrequenz Karte zu bilden. Dieses Bild kann dann farblich gekennzeichnet sein Bildbearbeitungssoftware der Wahl 10,11 verwenden. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Affolter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+or+not+tube%3A+remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li>
<li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+signaling+in+the+regulation+of+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis.</a> Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).</li>
<li>Sternlicht, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+stages+in+mammary+gland+development%3A+the+cues+that+regulate+ductal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis.</a> Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).</li>
<li>Fata, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK%28ERK-1%2C2%29+pathway+integrates+distinct+and+antagonistic+signals+from+TGFalpha+and+FGF7+in+morphogenesis+of+mouse+mammary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium.</a> Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).</li>
<li>Ip, M. M., Darcy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mammary+primary+culture+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mammary primary culture model systems.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).</li>
<li>Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+three-dimensional+models+to+study+mammary+gland+branching+morphogenesis+and+functional+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).</li>
<li>Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+determines+sites+of+mammary+branching+morphogenesis+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures.</a> Science. 314 (5797), 298-300 (2006).</li>
<li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+patterns+of+mechanical+stress+are+required+for+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).</li>
<li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+mechanical+strains+and+stresses+around+quiescent+engineered+three-dimensional+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues.</a> Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).</li>
<li>Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+tensile+forces+drive+collective+cell+migration+through+three-dimensional+extracellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices.</a> Sci Rep. 5, 11458(2015).</li>
<li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+regulates+branch+initiation+and+extension+of+cultured+mammary+epithelia+via+Akt+and+Rac1+respectively%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively.</a> Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).</li>
<li>Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differentiation+and+alveolar+morphogenesis+of+primary+mammary+cultures+on+reconstituted+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane.</a> Development. 105 (2), 223-235 (1989).</li>
<li>Hirai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphin+functions+as+a+key+morphoregulator+for+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells.</a> J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).</li>
<li>Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+stroma+induces+branching+morphogenesis+of+engineered+epithelial+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules.</a> Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das oben beschriebene Protokoll skizziert ein Verfahren zur Herstellung identischer Epithelgewebe mit vordefinierter Form, das eine räumliche Kontrolle der mechanischen Belastung ermöglicht, die den Zellen im Gewebe ausgesetzt ist. Eine elastomere Form wird verwendet, um Hohlräume in Typ-I-Kollagen zu erzeugen, die dann mit Epithelzellen gefüllt und mit einer zusätzlichen Kollagenschicht bedeckt werden, so dass die Zellen vollständig in einer 3D-Kollagenmatrix-Umgebung eingekapselt sind. Die weitere Kultivierung dieser G...

Die Entwicklung von verzweigten epithelialen Geweben, als Verzweiger Morphogenese bekannt ist, wird von Zellen abgeleiteten, physikalischen und Umweltfaktoren reguliert wird. In der Brustdrüse, Morphogenese Verzweigung ist ein iterativer Prozess, durch den geführten kollektive Zellmigration eine baumartige Architektur schafft. Der erste Schritt ist die primäre Knospenbildung aus den Milchgängen, gefolgt von Zweig Initiierung und Dehnung 1,2. Invasion der Filialen in das umgebende Stroma wird durch die systemische Freisetzung von Steroidhormonen in der Pubertät induziert. Neue primäre Knospen initiieren dann von den Enden der bestehenden Filialen, und dieser Prozess wird fortgesetzt 3 eine epitheliale Baum zu erstellen. Obwohl viele wichtige biochemische Signale identifiziert wurden, ein umfassendes Verständnis der zellbiologischen Mechanismen, die diese komplexen Entwicklungsprozess führen derzeit fehlt. Darüber hinaus sind mechanistische Studien über die Einflüsse der spezifischen Signale nur schwer von Erfah zu dekonstruierenrungen in vivo sind so präzise Raum - Zeit - Störungen und Messungen oft nicht möglich. Dreidimensionale (3D) Kulturtechniken, wie beispielsweise Vollorgankultur, primäre Organoiden und Zellkulturmodellen, sind nützliche Werkzeuge für die systematische Untersuchung der Mechanismen , darunter liegende Gewebe - Morphogenese 4-6. Dies kann besonders nützlich sein für die Bestimmung der Einflüsse von spezifischen Faktoren einzeln, wie mechanische Kräfte und biochemische Signale auf einer Vielzahl von Zellverhalten, einschließlich der Migration, Proliferation und Differenzierung. 6 Engineered Zellkulturmodellen, insbesondere leicht die Störung ermöglichen von einzelnen Zellen und deren Mikroumgebung. Eine solche Kulturmodell verwendet einen Mikro-basierten Ansatz Modell mammaepithelialen Gewebe zu konstruieren mit 3D-Struktur gesteuert, die konsistent und reproduzierbar Zweige bilden, die gemeinsam wandern, wenn sie mit dem eine induzierteppropriate Wachstumsfaktoren. Der große Vorteil des Modells ist die Fähigkeit, genau zu manipulieren und die Auswirkungen der physikalischen und biochemischen Faktoren, wie beispielsweise Muster der mechanischen Beanspruchung mit hoher statistischer Sicherheit messen. Diese Technik, die zusammen mit Computermodellierung, wurde bereits verwendet 7-11 die relativen Beiträge der physikalischen und biochemischen Signale in der Leitung von der normalen Entwicklung der Brust-Epithelgewebe und anderen verzweigten Epithelien zu bestimmen. Dargestellt ist hier ein detailliertes Protokoll für diese Modellgewebe Gebäude, das leicht auf andere Arten von Zellen und extrazellulären Matrix erweitert werden kann (ECM) Gele, und die dazu dient, als mögliches Instrument für die Prüfung von Therapeutika.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Härter</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Lithographisch gemusterter Silikonmeister</td><td>selbsthergestellt</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Wiege</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-115</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen mit 100 mm Durchmesser</td><td>BioExpress</td><td>D-2550-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol 200 Proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Stellen Sie eine 70%ige EtOH (v:v) -Lösung her, indem Sie sie mit dH2O</td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>American Safety Razor</td><td>620179</td><td></td></tr><tr><td>1:1 Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium : Schinken (') s F12 Nährstoffmischung (DMEM/F12) (1:1)</td><td>Hyklone</td><td>SH30023FS</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank' s ausgewogene Salzlösung (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>Rind Kollagen Typ I (nicht pepsinisiert)</td><td>Koken</td><td>IAC-50</td><td></td></tr><tr><td>Albumin aus Rinderserum (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette aus Edelstahl</td><td>Dumont</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschalen mit 35 mm Durchmesser</td><td>BioExpress</td><td>T-2881-6</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konische Röhrchen</td><td>BioExpress</td><td>C-3394-2</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Runde #1 Glasabdeckgläser, 15 mm Durchmesser</td><td>Bellco Glass Inc.</td><td>Sonderbestellung</td><td></td></tr><tr><td>0,05% 1x Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300260</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H 9661</td><td>Resuspendiert in dH2O bei 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Maus FAK Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>AMO0672</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Kaninchen Alexa 488 Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>Wird zur Farbcodierung von Pixelfrequenzkarten verwendet.</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Kostenlose Bildanalysesoftware zum Schwellenwerten, Registrieren und Überlagern von Bildern zur Erstellung einer Pixelfrequenzkarte. Das StackReg-Plugin wurde für die Registrierung von Binärbildern verwendet.</td></tr></tbody></table>

technik dreidimensionale epithelgewebe eingebettet in extrazellulären matrix

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Die Architektur verzweigter Organe wie Lunge, Nieren und Brustdrüsen entsteht durch den Entwicklungsprozess der verzweigten Morphogenese, der durch eine Vielzahl von löslichen und physikalischen Signalen in der Mikroumgebung reguliert wird. Hier wird eine Methode beschrieben, die entwickelt wurde, um den Prozess der Verzweigungsmorphogenese zu untersuchen, indem künstlich hergestellte dreidimensionale (3D) Epithelgewebe mit definierter Form und Größe gebildet werden, die vollständig in eine extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet sind. Diese Methode ermöglicht die Bildung von Arrays identischer Gewebe und ermöglicht die Kontrolle einer Vielzahl von Umweltfaktoren, einschließlich Gewebegeometrie, Abstand und EZM-Zusammensetzung. Diese Methode kann auch mit weit verbreiteten Techniken wie der Traktionskraftmikroskopie (TFM) kombiniert werden, um mehr Informationen über die Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer umgebenden EZM zu erhalten. Das Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Zell- und Gewebeprozessen zu untersuchen, die über die verzweigte Morphogenese hinausgehen, einschließlich der Krebsinvasion.

Allgemeines Schema von mammaepithelialen Gewebe Mikro Eine allgemeine schematische Darstellung der Mikrofabrikationsverfahren des experimentellen Arbeitsablauf umreißt in Abbildung 1 dargestellt ist. Das Ergebnis ist ein Array von Epithelgewebe identischer Geometrie und den Abstand, der in einer ECM - Gel vollständig eingebettet sind. Ein repräsentatives Experiment verwendet EpH4 Maus-Mamma-Epithelzellen kultiviert in einem G...

Diese Handschrift beschreibt eine weiche Lithographie-basierte Technik einheitlichen Arrays von dreidimensionalen (3D) Epithelgewebe definierter Geometrie durch extrazelluläre Matrix umgeben zu konstruieren. Dieses Verfahren ist offen für eine große Vielfalt von Zelltypen und experimentelle Kontexten und ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von identischen Replikaten.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, identische dreidimensionale Gewebe zu erzeugen, die in einem Kollagengel eingebettet sind und für zahlreiche experimentelle Anwendungen genutzt werden können, beispielsweise zur Untersuchung des Einflusses mechanischer Spannungen auf die verzweigte Morphogenese. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Gewebemorphogenese zu beantworten, etwa die Ermittlung der zugrundeliegenden Mechanismen des kollektiven Zellverhaltens. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Geometrie der erzeugten Gewebe kontrollierbar und reproduzierbar ist, was eine präzise Manipulation und Messung physikalischer sowie biochemischer Faktoren ermöglicht.Daher ist die Stichprobengröße ausreichend groß, um Schlussfolgerungen mit hoher statistischer Sicherheit zu ziehen. Bereiten Sie zunächst einen Silizium-Grundkörper vor, der mit Ihrem gewünschten Array durch Standardverfahren der Fotolithographie strukturiert wurde. Das in diesem Video verwendete Muster besteht aus rechteckigen Strukturen, die im Abstand von 200 Mikrometern angeordnet sind.Mischen Sie anschließend 50 Gramm PDMS, indem Sie das Prepolymer und einen Härter in einem Einweggefäß im Verhäl

engineering-three-dimensional-epithelial-tissues-embedded-within

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Eine einfache Methode ist für die Analyse von Auswirkungen von Fibroblasten aus dem Bindegewebe auf verbundene Epithelzellen beschrieben. Die Kombination dieser Verfahren und dreidimensionalen Gewebekultur Analyse von Zellen nach der Isolierung aus 3D zu erleichtern. Die Technik ist für Zellen unterschiedlicher maligne Potential, so dass systematische Untersuchung der Wirkungen von Tumor-assoziiertem Stroma auf Tumorzellen.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

Um hochorganisierte Strukturen aus komplexem Gewebe zu erzeugen, muss man mehrere Materialien und Zelltypen zu einem integrierten Komposit zusammenfügen.  Dieses kombinatorische Design umfasst organspezifische geschichtete Zellblätter mit zwei unterschiedlichen biologisch abgeleiteten Materialien, die eine starke fibröse Matrixbasis enthalten, und Endothelzellen zur Verbesserung der Bildung neuer Gefäße.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Gewebezüchtungen Fibroblasten-nativen Matrix ist eine aufstrebende Werkzeug, um eine Stroma-Substrat, das epitheliale Zellproliferation und Differenzierung unterstützt generieren. Hier wird ein Protokoll gemäß dieser Methode die Auswirkung verschiedener stromalen Zelltypen auf Tumor Zellbiologie Beurteilung vorgelegt.

Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden für die Verwendung von dreidimensionalen (3D-) Assays auf Brustkrebszellinvasion zu quantifizieren. Insbesondere diskutieren wir die Verfahren erforderlich, um solche Tests einrichten, Quantifizierung und Datenanalyse, sowie Methoden, um den Verlust der Membranintegrität, die bei Zellen eindringen tritt zu untersuchen.

Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

Dies ist eine Methode, um eine 3-dimensionale Zellkultur Gerüst von pulmonaler extrazellulären Matrix zu schaffen. Intact Lunge in Hydrogelen verarbeitet, die das Wachstum von Zellen in drei Dimensionen zu unterstützen.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Hier beschreiben wir eine dreidimensionale Kultur-Methode, um die Morphologie des primären Brustkrebs-Zellen, sowie deren direkte/indirekte Wechselwirkungen mit Monozyten und die Ergebnisse wie Kollagen-Abbau, Immunzelle Rekrutierung, Zelle studieren analysieren Invasion, und Förderung der Krebs-in Verbindung stehenden Entzündung.

Analyse der Kommunikation zwischen Monozyten und primären Brustkrebs-Zellen in einer extrazellulären Matrix (ECME) extrahieren-basiertes dreidimensionales System

Wir beschreiben eine Methode, um Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multikellulären Organoiden zu experimentieren. Dieses Gerät ermöglicht die Analyse von zellulären Reaktionen auf lösliche Signale in 3D-Mikroumgebungen mit definierten Chemoattractged-Steigungen. Organoide sind besser als einzelne Zellen, wenn es um die Erkennung schwacher lauter Eingänge geht.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Das Ziel dieser Methode ist es, fibroblast-abgeleitete 3D-Matrizen als natürliches Gerüst für nachfolgende zelluläre Assays zu erhalten. Fibroblasten werden in einer vorbehandelten Kulturplatte gesät und mit Ascorbinsäure für die Matrixgenerierung stimuliert. Matrizen werden dezellularisiert und an kulturrelevante Zellen (z. B. Endothelzellen) blockiert.

Fibroblast-Derived 3D Matrix System anwendbar auf Endothel Tube Formation Assay

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Fähigkeiten und die wesentlichen Kulturmodalitäten des Open-Top Organ-Chips für die erfolgreiche Etablierung und Reifung von Organ-on-Chip-Kulturen in voller Dicke von primären Geweben (Haut, Alveole, Atemwege und Darm) und bietet die Möglichkeit, verschiedene funktionelle Aspekte der humanen epithelial/mesenchymalen und vaskulären Nischenschnittstelle in vitro zu untersuchen.

Rekonstitution der Zytoarchitektur und Funktion von humanem Epithelgewebe auf einem offenen Organchip

Hier zeigen wir, wie Epithelzellen, die mit Fibroblasten in dem nanofaserigen membranbasierten Zweischichtsystem kultiviert wurden, stabil an der Membran haften und auf ihr wachsen können.

Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

Lernen Sie die Herstellung dreidimensionaler Epithelgewebe in Kollagenmatrix für Gewebeengineering und Zellverhaltensforschung. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle mechanischer und biochemischer Faktoren mit hoher statistischer Aussagekraft.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Weitere Videos entdecken