Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Anhebung von identischen dreidimensionalen Geweben zu erzeugen, die in ein Kollagengel eingebettet sind, um sie in vielen experimentellen Kontexten zu verwenden, z. B. um den Einfluss mechanischer Belastung auf die verzweigte Morphogenese zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Gewebemorphogenese zu beantworten, wie z.B. die Bestimmung der zugrundeliegenden Mechanismen des kollektiven Zellverhaltens. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Geometrie der hergestellten Gewebe kontrolliert und reproduzierbar ist, was eine präzise Manipulation und Messung physikalischer und biochemischer Faktoren ermöglicht.

Somit ist die Stichprobengröße groß genug, um Schlussfolgerungen mit hoher statistischer Sicherheit ziehen zu können. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Silizium-Masters, der mit dem gewünschten Array unter Verwendung von Standard-Fotolithographietechniken fotostrukturiert ist. Das in diesem Video verwendete Muster besteht aus rechteckigen Strukturen, die einen Abstand von 200 Mikrometern haben.

Mischen Sie anschließend 50 Gramm PDMS, indem Sie das Prepolymer und ein Härtungsmittel in einer Einwegschale im Verhältnis 10:1 kombinieren. Legen Sie die Mischung dann 15 bis 30 Minuten lang unter Vakuum, um alle Luftblasen zu entfernen, die während des Mischvorgangs eingebracht wurden. Legen Sie die texturierte Seite des Silikonmasters nach oben in eine Kunststoffwaage und gießen Sie die entgaste PDMS-Lösung auf die Form.

Stellen Sie dann die Form in einen Ofen und härten Sie das PDMS 12 Stunden lang bei 60 Grad Celsius aus. Entfernen Sie nach dem Aushärten das PDMS und den Master aus dem Kunststoffbehälter. Trennen Sie das PDMS vorsichtig vom Siliziumwafer.

Verwenden Sie dann eine saubere Rasierklinge, um überschüssiges PDMS um die aufgedruckten Merkmale herum zu entfernen. Schneide nun mit einer Rasierklinge das gemusterte PDMS in einzelne rechteckige Stempel. Bewahren Sie diese Stempel mit der Seite nach oben in einer sauberen Petrischale mit einem Durchmesser von 100 Millimetern auf.

Bereiten Sie als Nächstes eine frische Charge entgaster PDMS-Lösung mit dem gleichen Verhältnis von Prepolymer zu Härter von 10:1 vor. Schleudern Sie zwei bis drei Gramm dieser Lösung auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 100 Millimetern und härten Sie das PDMS dann 12 Stunden lang bei 60 Grad Celsius aus. Schneiden Sie dann mit einer Rasierklinge die dünne Schicht PDMS in Rechtecke, die als Stützen für die Stempel verwendet werden.

Für jeden Stempel werden zwei Stützen benötigt. Sobald alle Stützen geschnitten sind, sterilisieren Sie die PDMS-Stempel und -Stützen, indem Sie sie in 70%iges Ethanol tauchen und mit einem Aspirator in einer Biosicherheitswerkbank trocknen. Geben Sie in einer Biosicherheitswerkbank 50 Mikroliter 1 % BSA in PBS auf den oberen Rand jedes Stempels.

Platzieren Sie die mit Tröpfchen bedeckten Briefmarken mindestens vier Stunden lang bei vier Grad Celsius, um sicherzustellen, dass das BSA von der Oberfläche des Stempels absorbiert wird. Geben Sie dann die Stempel wieder in die Biosicherheitswerkbank zurück und aspirieren Sie die BSA-Lösung aus den PDMS-Stempeln. Waschen Sie anschließend die Oberflächen der Stempel zweimal mit 50 Mikrolitern Zellkulturmedium ab.

Saugen Sie das Medium nach jeder Wäsche an. Legen Sie für jeden PDMS-Stempel eine Gewebekulturschale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern aus. Legen Sie in jede Schale zwei PDMS-Stützen, die durch einen Abstand voneinander getrennt sind, der etwas kleiner ist als die Länge der PDMS-Stempel.

Nehmen Sie dann mit einer Pinzette Glasabdeckgläser mit einem Durchmesser von 15 Millimetern auf und sterilisieren Sie sie mit 70 % Ethanol. Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit aus den Deckgläsern ab, während Sie sie mit der Pinzette festhalten, und bewahren Sie sie dann in einer separaten Petrischale auf. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter einer Kollagenmischung von vier Milligramm pro Milliliter direkt auf jeden Stempel, um die Oberfläche der PDMS-Stempel gleichmäßig zu beschichten.

Nehmen Sie mit der Pinzette jeden der kollagenbeschichteten PDMS-Stempel auf und drehen Sie sie vorsichtig um. Senken Sie die umgedrehten Stempel mit der Kollagenseite nach unten auf die PDMS-Stützen in den Gewebekulturschalen ab. Anschließend die Gerichte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Geben Sie anschließend 50 Mikroliter der restlichen Kollagenmischung auf jedes der kreisförmigen Deckgläser und inkubieren Sie diese 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Ernten Sie an dieser Stelle den Zelltyp, den Sie interessieren. Hier haben wir EpH4-Epithelzellen von Maussäugetieren, die wir in einer Konzentration zwischen einer und 10 Millionen Zellen pro Milliliter suspendiert haben.

Entnehmen Sie nun die gelierten Kollagenproben aus dem Inkubator. Heben Sie die PDMS-Stempel mit der Pinzette vorsichtig gerade nach oben, um sie vom geformten Kollagen zu lösen und zu entsorgen. Es ist wichtig, den Stempel gerade nach oben zu heben, um die Gesichtszüge des Kollagengels nicht zu verzerren.

Geben Sie 30 Mikroliter der konzentrierten Zellsuspension auf die Oberfläche jedes Kollagengels, das geformte Hohlräume der gewünschten Geometrie enthält. Beobachten Sie die Zellen unter einem Hellfeldmikroskop, während Sie die Schalen vorsichtig von einer Seite zur anderen schütteln, um die Ansiedlung der Zellen in den Hohlräumen zu fördern. Die Hohlräume sollten innerhalb von fünf Minuten gefüllt sein.

Um überschüssige Zellen aus der Umgebung der Kavitäten zu entfernen, kippen Sie jede Gewebekulturschale auf die Seite und geben Sie vorsichtig 400 Mikroliter Zellkulturmedium über die Oberfläche des Kollagengels. Es ist wichtig, vorsichtig zu waschen, indem man das Kulturmedium langsam über das Gel gibt, während man die Schale kippt, damit überschüssige Zellen auf der Geloberfläche entfernt werden und die Zellen in den Hohlräumen des Gels nicht verdrängt werden. Saugen Sie die Flüssigkeit ab und wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal.

Überprüfen Sie die Kollagengele zwischen jedem Waschen unter dem Mikroskop, um zu beobachten, wann die überschüssigen Zellen weggespült wurden. Nachdem die überschüssigen Zellen aus den mit Zellen gefüllten Hohlräumen entfernt wurden, stellen Sie die Gewebekulturschalen für 15 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Drehen Sie dann mit der Pinzette die mit Kollagen beschichteten Glasdeckgläser vorsichtig um und legen Sie sie auf die mit Zellen gefüllten Kollagenformen, so dass das Kollagen aus dem Deckglas eine Kappe über den mit Zellen gefüllten Hohlräumen bildet.

Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Sobald die Kollagenkappen an den mit Zellen gefüllten Kollagenformen haften, geben Sie zwei bis 2 1/2 Milliliter Zellkulturmedium langsam über die Glasabdeckung, die auf die Gele geschoben wird, und kultivieren Sie die Proben ein bis drei Tage lang bei 37 Grad Celsius. Diese Bilder stammen aus Ansichten mit niedriger und hoher Vergrößerung der Arrays, die vor der Zellaussaat zu einem Typ-I-Kollagengel geformt wurden.

Die Form der Vertiefungen wird durch die Form der Merkmale auf dem Silizium-Master bestimmt. Hier wurden die rechteckigen Vertiefungen mit Epithelzellen von Säugetieren gefüllt. In diesem Beispiel enthält jede rechteckige Vertiefung von 200 x 50 Mikrometern etwa 80 bis 100 Zellen.

24 Stunden nach der Zellaussaat wurde beobachtet, wie die Zellen in den Vertiefungen aneinander hafteten, um ein Gewebe zu bilden. 24 Stunden nach der Zugabe eines Wachstumsfaktors HGF zum Kulturmedium ist zu sehen, wie das Gewebe eine verzweigte Morphogenese durchläuft. Eines der Proteine, die an der Zellmigration beteiligt sind, ist die fokale Adhäsionskinase, die, wie Sie auf diesem Kompositbild sehen können, an den Enden der Vertiefungen zunimmt, wo typischerweise Verzweigungen auftreten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Zugkraftmikroskopie, Echtzeit-RT-PCR und Western Blot durchgeführt werden, um die Kräfte zu bestimmen, die von Zellen während ihrer Wanderung ausgeübt werden, sowie Veränderungen der Transkript- und Proteinspiegel von Genen von Interesse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dieses 3D-Zellkulturmodell einrichten, in dem Gewebe mit definierter Ausgangsgeometrie in ein Kollagengel eingebettet sind.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.