Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, identische dreidimensionale Gewebe zu erzeugen, die in einem Kollagengel eingebettet sind und für zahlreiche experimentelle Anwendungen genutzt werden können, beispielsweise zur Untersuchung des Einflusses mechanischer Spannungen auf die verzweigte Morphogenese. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Gewebemorphogenese zu beantworten, etwa die Ermittlung der zugrundeliegenden Mechanismen des kollektiven Zellverhaltens. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Geometrie der erzeugten Gewebe kontrollierbar und reproduzierbar ist, was eine präzise Manipulation und Messung physikalischer sowie biochemischer Faktoren ermöglicht.

Daher ist die Stichprobengröße ausreichend groß, um Schlussfolgerungen mit hoher statistischer Sicherheit zu ziehen. Bereiten Sie zunächst einen Silizium-Grundkörper vor, der mit Ihrem gewünschten Array durch Standardverfahren der Fotolithographie strukturiert wurde. Das in diesem Video verwendete Muster besteht aus rechteckigen Strukturen, die im Abstand von 200 Mikrometern angeordnet sind.

Mischen Sie anschließend 50 Gramm PDMS, indem Sie das Prepolymer und einen Härter in einem Einweggefäß im Verhältnis 10:1 kombinieren. Danach stellen Sie die Mischung für 15 bis 30 Minuten unter Vakuum, um eventuelle Luftblasen zu entfernen, die während des Mischvorgangs entstanden sind. Legen Sie die strukturierte Seite des Silikonabdrucks nach oben in ein kunststoffbeschichtetes Wiegeboot und gießen Sie die entlüftete PDMS-Lösung auf die Oberseite der Form.

Stellen Sie die Schale dann in einen Ofen und härten Sie das PDMS bei 60 Grad Celsius für 12 Stunden aus. Nach der Aushärtung entfernen Sie das PDMS und das Master von dem Kunststoffbehälter. Trennen Sie das PDMS vorsichtig von dem Siliziumwafer.

Entfernen Sie anschließend mit einer sauberen Rasierklinge überschüssiges PDMS um die abgebildeten Strukturen herum. Schneiden Sie nun das strukturierte PDMS mit einer Rasierklinge in einzelne rechteckige Stempel. Bewahren Sie diese Stempel mit der Strukturseite nach oben in einer sauberen Petrischale mit 100 Millimeter Durchmesser auf.

Bereiten Sie anschließend eine frische Menge entgaster PDMS-Lösung im gleichen Verhältnis von 10:1 (Vorpolymere zu Härter) vor. Tragen Sie mittels Schleuderbeschichtung zwei bis drei Gramm dieser Lösung auf eine Petrischale mit 100 Millimeter Durchmesser auf und härten Sie das PDMS 12 Stunden lang bei 60 Grad Celsius aus. Schneiden Sie danach die dünne PDMS-Schicht mit einer Rasierklinge in Rechtecke, die als Träger für die Stempel verwendet werden.

Für jeden Stempel werden zwei Träger benötigt. Nachdem alle Träger zugeschnitten sind, sterilisieren Sie die PDMS-Stempel und -Träger, indem Sie sie in 70 % Ethanol eintauchen und sie anschließend mit einem Aspirator in einem Biosicherheitswerkbank trocknen. Geben Sie in einer Biosicherheitswerkbank jeweils 50 Mikroliter 1 % BSA in PBS auf die Oberseite jedes Stempels.

Stellen Sie die mit Tropfen bedeckten Stempel mindestens vier Stunden bei vier Grad Celsius, um sicherzustellen, dass das BSA an die Oberfläche des Stempels bindet. Danach bringen Sie die Stempel zurück in den Biosicherheitswerkbank und aspirations die BSA-Lösung von den PDMS-Stempeln ab. Waschen Sie anschließend die Oberflächen der Stempel zweimal mit jeweils 50 Mikrolitern Zellkulturmedium.

Entfernen Sie nach jeder Wäsche das Medium. Legen Sie pro PDMS-Stempel eine Gewebekulturschale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern bereit. Platzieren Sie in jeder Schale zwei PDMS-Unterstützungen im Abstand, der geringfügig kleiner ist als die Länge der PDMS-Stempel.

Verwenden Sie dann eine Pinzette, um Deckgläser mit einem Durchmesser von 15 Millimeter aufzunehmen, und sterilisieren Sie diese mit 70 % Ethanol. Aspirieren Sie die überschüssige Flüssigkeit von den Deckgläsern, während Sie diese mit der Pinzette halten, und lagern Sie sie anschließend in einer separaten Petrischale. Geben Sie danach jeweils 50 Mikroliter einer Kollagenmischung mit einer Konzentration von vier Milligramm pro Milliliter direkt auf jeden Stempel, um die Oberfläche der PDMS-Stempel gleichmäßig zu beschichten.

Mit der Pinzette jeden der mit Kollagen beschichteten PDMS-Stempel aufnehmen und vorsichtig umdrehen. Die umgedrehten Stempel mit der Kollagen-Seite nach unten auf die PDMS-Träger in den Zellkulturschalen ablegen. Anschließend die Schalen 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nächster Schritt: Geben Sie 50 Mikroliter der verbleibenden Kollagenmischung auf jede der runden Deckgläser und inkubieren Sie diese 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Zu diesem Zeitpunkt gewinnen Sie Ihre gewünschte Zellart. Hier verwenden wir EpH4-Maus-Mammarepithelzellen, die wir in einer Konzentration von einer bis zehn Millionen Zellen pro Milliliter suspendiert haben.

Entfernen Sie nun die gelierte Kollagenprobe aus dem Inkubator. Heben Sie die PDMS-Stempel mit der Pinzette vorsichtig senkrecht nach oben an, um sie vom geformten Kollagen zu lösen, und entsorgen Sie sie. Es ist wichtig, den Stempel senkrecht nach oben zu heben, um eine Verformung der Strukturen im Kollagengel zu vermeiden.

Geben Sie 30 Mikroliter der konzentrierten Zellsuspension auf die Oberfläche jedes Kollagengels, das geformte Hohlräume mit der gewünschten Geometrie enthält. Beobachten Sie die Zellen unter einem Hellfeldmikroskop, während Sie die Schalen vorsichtig von Seite zu Seite schütteln, um das Absinken der Zellen in die Hohlräume zu fördern. Die Hohlräume sollten innerhalb von fünf Minuten gefüllt sein.

Um überschüssige Zellen um die Hohlräume herum zu entfernen, kippen Sie jede Zellkulturschale zur Seite und geben Sie vorsichtig 400 Mikroliter Zellkulturmedium über die Oberfläche des Kollagengels. Es ist wichtig, vorsichtig zu waschen, indem das Kulturmedium langsam über das Gel gegeben wird, während die Schale gekippt ist, damit überschüssige Zellen von der Geloberfläche entfernt werden, die Zellen in den Hohlräumen des Gels jedoch nicht verschoben werden. Aspirieren Sie die Flüssigkeit und wiederholen Sie den Waschvorgang noch zweimal.

Überprüfen Sie die Kollagengele unter dem Mikroskop zwischen den einzelnen Waschschritten, um zu beobachten, wann die überschüssigen Zellen abgespült wurden. Nachdem die überschüssigen Zellen aus dem Bereich um die zellgefüllten Hohlräume entfernt wurden, stellen Sie die Zellkulturschalen 15 Minuten lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Drehen Sie anschließend mit der Pinzette vorsichtig die mit Kollagen beschichteten Glasdecken um und legen Sie sie auf die zellgefüllten Kollagenformen, sodass das Kollagen vom Deckglas eine Abdeckung über den zellgefüllten Hohlräumen bildet.

Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Sobald die Kollagenkappen an den mit Zellen gefüllten Kollagenschablonen haften, geben Sie langsam zwei bis 2 1/2 Milliliter Zellkulturmedium über die Deckgläser auf die Gele und kultivieren Sie die Proben für ein bis drei Tage bei 37 Grad Celsius. Diese Bilder stammen aus Ansichten mit niedriger und hoher Vergrößerung der in ein Typ-I-Kollagen-Gel eingebetteten Arrays vor der Aussaat der Zellen.

Die Form der Vertiefungen wird durch die Form der Strukturen auf dem Silizium-Abformkörper bestimmt. Hier wurden die rechteckigen Vertiefungen mit Brustepithelzellen befüllt. In diesem Beispiel enthält jede rechteckige Vertiefung von 200 mal 50 Mikrometer etwa 80 bis 100 Zellen.

24 Stunden nach der Zellseeding wurden die Zellen beobachtet, wie sie innerhalb der Vertiefungen aneinander hafteten, um ein Gewebe zu bilden. 24 Stunden nach der Zugabe des Wachstumsfaktors HGF zum Kulturmedium ist zu erkennen, dass die Gewebe eine verzweigende Morphogenese durchlaufen. Eines der Proteine, die an der Zellmigration beteiligt sind, ist die fokale Adhäsionskinase, deren Konzentration – wie anhand dieses Zusammengesetzten Bildes ersichtlich – an den Enden der Vertiefungen zunimmt, wo typischerweise Verzweigungen auftreten.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Traktionskraftmikroskopie, die Echtzeit-RT-PCR und die Western Blotting durchgeführt werden, um die von wandernden Zellen ausgeübten Kräfte sowie Veränderungen in den Transkript- und Proteinspiegeln interessierender Gene zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dieses 3D-Zellkultursystem aufbaut, bei dem Gewebe mit definiierter Anfangsgeometrie in einem Kollagengel eingebettet werden.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.