Dreidimensionale Biomimetic Technologie: Neuartige Biorubber Erzeugt definierte Mikro- und Makro-Skala Architekturen in Collagen Hydrogele

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, dreidimensionale Kollagengerüste zu entwickeln, die den architektonischen Merkmalen, der Zusammensetzung und den mechanischen Eigenschaften von In-vivo-Gewebe ähneln können. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Tissue Engineering zu beantworten, wie z. B. Interaktionen mit EZM-Zellen, den Einfluss architektonischer Merkmale bei der Herstellung von künstlich hergestellten Geweben und die Entwicklung von Gewebeersatz. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein praktikables Verfahren bietet, um die Mikrogeometrie von inneren Strömungskanälen und -wegen mit hoher Genauigkeit in einem biologisch abbaubaren Material zu rekapitulieren.

Das Verfahren wird von Veronica Rodriguez-Rivera, einer Postdoktorandin in meinem Labor, demonstriert. Die Materialien, die zur Herstellung des BSA-Gummis verwendet werden, müssen bis zur Gebrauchsbereitschaft gelagert und kalt gehalten werden, damit der BSA-Gummi nicht vorzeitig aushärtet. Auch die Sterilität ist bei diesem Verfahren sehr wichtig.

Sterilisieren Sie zuerst den Spender. Legen Sie in einer Nicht-Zellkulturhaube die O-Ringe, die Spritze, ihre Kappe, die Mischspitze und den Vier-zu-Eins-Spender aus. UV-sterilisieren Sie diese Materialien für 30 Minuten.

Schrauben Sie zunächst die beiden Edelstahl-Formteile zusammen und bringen Sie den Luer-Lock an. Besprühen Sie vor dem Zusammenbau des Spenders Pipetten und Reagenzien mit 70 % Ethanol, bevor Sie sie in die Haube einführen. Befestigen Sie zuerst die Spitzenkappe am Lösungshalter.

Laden Sie anschließend die 30%ige BSA-Lösung in die größere Kammer, ohne die andere Kammer zu verunreinigen. Lassen Sie genügend Platz, um den O-Ring anzubringen. Befüllen Sie dann die kleinere Dosierkammer mit drei Prozent Glutaraldehyd und bringen Sie einen weiteren O-Ring an.

Befestigen Sie nun die Spritze am Spender. Kippen Sie dann die Baugruppe, sodass die Kappe oben aufliegt, und ersetzen Sie die Kappe durch eine Mischkanüle. Klopfen Sie dann vorsichtig auf die Seiten, damit die Luftblasen nach oben wandern können.

Stellen Sie dann den Spender in einen autoklavierten Beutel, um die Abgaslösung aufzunehmen. Geben Sie bei aufrechtem Spender eine kleine Menge Lösung in den Beutel, um die gesamte Luft aus der Spritze zu entfernen. Das Entfernen der Luft ist sehr wichtig.

Befestigen Sie dann schnell den Luer-Lock der Y-Form aus Edelstahl an der Spritzenspitze. Nun, mit der Form in Ihrer nicht dominanten Hand, werfen Sie die Lösung abwechselnd in den linken und rechten Auslass der Auslasskanäle aus. Drücken Sie die Auspuffe und füllen Sie so die inneren Hohlräume mit Lösung.

Positionieren Sie dann die Form horizontal und injizieren Sie sie mit mehr Lösung, bis die Hälfte des Spendervolumens verwendet wurde. Die Form sollte nun in eine Schale gegeben, in Parafilm eingewickelt und über Nacht bei vier Grad Celsius gelagert werden. Dieses Verfahren wird auf vier Gramm angesäuertes Kollagen skaliert.

Bewahren Sie es bis zur Verwendung kühl auf. Nachdem das Kollagen gewogen wurde, fahren Sie mit der Sterilisation der Lösung durch Gammastrahlung fort. Zur Vorbereitung frische 0,2 normale HEPES-Lösung in Wasser herstellen.

Füllen Sie dann den Inhalt in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen um. Stellen Sie den pH-Wert mit konzentriertem Natriumhydroxid auf neun ein. Achten Sie darauf, die Haube UV-zu sterilisieren und die Pinzette, den Spatel und das Skalpell zu autoklavieren.

Mischen Sie in der Haube 1,5 Milliliter der HEPES-Lösung mit 1,5 Millilitern 10x MEM. Lagern Sie diese Mischung auf Eis. Kühlen Sie außerdem eine 12-Well-Platte und eine 20-Milliliter-Spritze 10 Minuten lang im Gefrierschrank

Für zusätzliche Sterilität besprühen Sie die beteiligten Röhrchen und Platten mit 70 % Ethanol, bevor Sie sie in die Haube einsetzen. Sprühen Sie die Formplatte ein und legen Sie sie in die Haube. Entfernen Sie dann die BSA-Gummiformen mit einer Pinzette.

Schneide dann mit einem Skalpell die Auslasskanäle von der Form ab. Anschließend die HEPES-MEM-Mischung kurz vortexen und einen Milliliter zum Kollagen geben. Mischen Sie dann die Lösung gründlich mit einem sterilen Spatel.

Anschließend einen kurzen Vortex auftragen und die Lösung schnell in die kalte 20-Milliliter-Spritze umfüllen. Während Sie nun den BSA-Gummi im Inneren des Bohrlochs befestigen, geben Sie die Hälfte der Kollagen-Hydrogel-Lösung in den Bohrlochboden. Positionieren Sie dann die Form mit einer Pinzette so, dass die Ein- und Auslaufenden des Gummis die Wände des Brunnens berühren.

Bedecken Sie dann die Form mit Kollagen-Hydrogel. Versiegeln Sie nun die Vertiefung mit Parafilm und laden Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Warten Sie eine Stunde, bis das Kollagen polymerisiert ist.

Lassen Sie während dieser Zeit das UV-Licht in der Kapuze eingeschaltet. Stellen Sie außerdem die UV-Vernetzungsvorrichtung so ein, dass sie 630.000 Mikrojoule pro Quadratzentimeter liefert. Sprühen Sie nun Ihre behandschuhten Hände mit 70% Ethanol ein, laden Sie die Platte mit den mit Kollagen bedeckten Formen in den Vernetzer und starten Sie den Bestrahlungsprozess.

Sprühen Sie nach der Bestrahlung Ihre Handschuhe erneut ein und entladen Sie die Platte aus dem Vernetzer. Nehmen Sie dann mit einem sterilen Spatel das Gel aus der Vertiefung, drehen Sie es um und vernetzen Sie den Boden des Hydrogels. Fahren Sie nach dem letzten Vernetzungszyklus mit dem Enzymaufschluss fort.

Um den BSA-Gummi zu entfernen, ohne das Kollagengerüst zu stören, verwenden Sie eine sterile 0,25%ige Trypsinlösung bei einem pH-Wert von 7,8 und drücken Sie sie durch einen 0,20-Mikron-Filter. Übertragen Sie genügend gefilterte Trypsinlösung in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Übertragen Sie dann das Kollagen-Hydrogel in das konische Röhrchen, das die Enzymlösung enthält.

Stellen Sie sicher, dass das Hydrogel vollständig mit der Lösung bedeckt ist. Verschließen Sie die Tube mit Parafilm und wirbeln Sie sie etwa eine Minute lang vorsichtig ein. Inkubieren Sie dann das Röhrchen bei 30 Grad Celsius und lassen Sie den Aufschluss 15 bis 24 Stunden lang laufen.

Entfernen Sie den Schlauch in den ersten vier Stunden alle 15 bis 30 Minuten und wirbeln Sie ihn vorsichtig ein, um den BSA-Gummiaufschluss zu vervollständigen. Am nächsten Tag gilt der Aufschluss als abgeschlossen, wenn kein Gummi in der Lösung schwimmt oder sich keine abgebauten Gummistücke im Hydrogel befinden. Ersetzen Sie nun die Trypsinlösung durch eine sterile Mosconas-Lösung und lassen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius schütteln.

Später aspirieren Sie die Mosconas-Lösung und wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Mal, um das Kollagengerüst vollständig zu reinigen. Eine umfangreiche Anzahl von Tests wurde verwendet, um den Einsatz des Biokautschuks zu optimieren und im Textprotokoll detailliert beschrieben. Unter Verwendung des optimierten Protokolls und dreier fester Formteile wurden Kollagen-Hydrogele hergestellt und detailliert untersucht.

Die benötigte Y-Form wurde auf einer Microlution-Maschine hergestellt. Die Y-Form wurde mit 30 % BSA und drei Prozent Glutaraldehyd injiziert, die über Nacht bei vier Grad Celsius reagierten. Anschließend wurde der BSA-Kautschuk mit dem Kollagen gegossen und eine Stunde lang auf 37 Grad Celsius erhitzt.

Der Gummi wurde 15 Stunden lang durch Enzyme verdaut, wodurch er so stark geschwächt wurde, dass er abfiel, ohne die Geometrie des Kollagen-Hydrogels zu beeinflussen. Der von der Form gegossene vier Millimeter große Einströmkanal wurde mit Messschiebern auf genau vier Millimeter im Kollagen-Hydrogel gemessen. Bei der Prüfung der Stabilität der Form wurde festgestellt, dass Abmessungen von nur 300 Mikrometern zuverlässig konstruiert werden konnten.

Darüber hinaus wurden die Gerüste nach den Mosconas-Waschungen auf Glutaraldehydreste getestet, wobei keine Rückstände gefunden wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man 3D-Kollagengerüste herstellt, die das Potenzial haben, In-vivo-Geometrien nachzuahmen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, die diese Technik ergänzen, wie z. B. die Erstellung von 3D-Modellen von In-vivo-Geweben und die Herstellung von Formen mit spezifischen architektonischen Merkmalen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Tissue Engineering, um die Interaktion zwischen internen architektonischen Merkmalen und Matrixkomponenten mit Zellen in In-vitro-Modellen zu untersuchen.