Name: Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Generierung von mehrlagigen Zellsphäroiden mit einer zentrifugalen Lab-on-a-CD-Plattform. Diese Methode nutzt Zentrifugalkraft zur effizienten Zellablagerung in Mikrowells für Gewebeengineering.

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Diese Forschung wurde durch das Basic Science Research Program (2016R1D1A1B03934418) und das Bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) des NRF und finanziert von der koreanischen Regierung MSIT unterstützt.

1. Zentrifugal mikrofluidische Basis Sphäroid (CMS) Kultur Chip Herstellung
<ol><li>Machen Sie PC-Formen für die oberen und unteren Schichten des CMS-Kulturchips durch CNC-Bearbeitung. Detaillierte Abmessungen des Chips sind in Abbildung 1angegeben.</li>
	<li>Mischen Sie PDMS-Basis und PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 (w/w) für 5 min und legen Sie sie in einen Trockengrund für 1 h, um Luftblasen zu entfernen.</li>
	<li>Nachdem Sie das PDMS-Gemisch in die Formen des CMS-Kulturchips gegossen haben, entfernen Sie Luftblasen für 1 h mehr und härten Sie in einer Wärmekammer bei 80 °C für 2 h aus.</li>
	<li>Legen Sie sie in den gesaugten Plasmareiniger mit den zu verklebenden Oberflächen nach oben und setzen Sie sie mit einer Leistung von 18 W für 30 s luftunterstütztem Plasma aus.</li>
	<li>Die beiden Schichten des CMS-Kulturchips verkleben und 30 min bei 80 °C in die Wärmekammer legen, um die Haftfestigkeit zu erhöhen.</li>
	<li>Sterilisieren Sie den CMS-Kulturchip in einem Autoklavensterilisator bei 121 °C und 15 psi.</li>
</ol>2. Zellvorbereitung
<ol><li>Die 1 ml der Durchstechflasche mit 5 x 105x 1 x 106 hASCs oder MRC-5s-Zellen in einem Wasserbad bei 36,5 °C für 2 min auftauen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) in eine Durchstechflasche und mischen Sie sie vorsichtig mit einer 1.000 L Pipette.</li>
	<li>15 ml des DMEM auf 36,5 °C in eine Petrischale mit 150 mm Durchmesser mit einer Pipette geben und die Zellen aus der Durchstechflasche hinzufügen.</li>
	<li>Nach 1 Tag die DMEM ansaugen und durch 15 ml frischeDMEM ersetzen. Wechseln Sie anschließend alle 2 oder 3 Tage die Medien.</li>
	<li>Um die Zellen von der Petrischale zu lösen, fügen Sie 4 ml Trypsin in die Petrischalen ein und legen Sie sie in einen Inkubator bei 36,5 °C und 5%CO2 für 4 min.</li>
</ol>3. Monokultur Sphäroidbildung
<ol><li>Legen Sie 2,5 ml 4% (w/v) pluronische F-127-Lösung in das Einlassloch des CMS-Kulturchips (Abbildung 2A) und drehen Sie den Chip bei 500–1.000 U/min und drehen Sie den Chip dann mit 3 min mit dem CMS-System um 4.000 U/min (Abbildung 2B). HINWEIS: Die pluronische Beschichtung verhindert die Zellbefestigung am Einlassanschluss, während sich der Chip dreht. Stellen Sie sicher, dass die Luft nicht in den Mikrobrunnen eingeschlossen ist.</li>
	<li>Inkubieren Sie den cmS-Kulturchip, der über Nacht bei 36,5 °C in 5%CO2mit pluronischer Lösung gefüllt ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die pluronische Lösung, waschen Sie die verbleibende pluronische Lösung mit DMEM aus und trocknen Sie den Chip für 12 h auf einer sauberen Bank.</li>
	<li>Fügen Sie dem CMS-Kulturchip 2,5 ml DMEM hinzu und drehen Sie den Chip um 3 min für 3 min, um die Innenseite des Chips vorzuvernetzen.</li>
	<li>Stoppen Sie die Drehung und ziehen Sie 100 l DMEM heraus, um Platz für die Injektion der Zellsuspension zu schaffen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die entweder 5 x 105 hASCs oder 8 x 105 MRC-5s enthalten, indem Sie die Zellen gleichmäßig verteilen, indem sie 3–5x zur Resuspension pipetieren.</li>
	<li>Drehen Sie den Chip bei 3.000 U/min für 3 min, um Zellen in jedem Mikrobrunnen durch Zentrifugalkraft einzufangen. HINWEIS: Übermäßige Rotationsgeschwindigkeit kann zu Zellaustritt enden durch Lösungsauswurflöcher.</li>
	<li>Kultur die Zellen für 3 Tage im Inkubator bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2,rotieren d.h. bei 1.000–2.000 U/min. Ändern Sie Kulturmedium jeden Tag.</li>
</ol>4. Coculture Sphäroidbildung
<ol><li>
Konzentrische Sphäroide Bildung
	<ol>
<li>Fügen Sie die ersten Zellen, 2,5 x 105 hASCs, und drehen Sie den Chip bei 3.000 U/min. Nach 3 min fügen Sie die zweiten Zellen, 4 x 105 MRC-5s, hinzu und drehen Sie den Chip bei 3.000 U/min für 3 min. Injizieren Sie insgesamt 100 l Zellsuspensionen durch Pipetten. Wenn die Zellen injiziert werden, verschieben Sie die Rotationsgeschwindigkeit auf 500-1.000 Rpm.</li>
		<li>Kultur die Zellen im Inkubator bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit% und 5%CO2 durch Drehen bei 1.000–2.000 U/min. Die konzentrischen Sphäroide werden innerhalb von 24 h erstellt. Für eine langfristige Kultur, ändern Sie das Kulturmedium jeden Tag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Janus Sphäroid-Formation
	<ol>
<li>Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die die ersten Zellen enthalten, 2,5 x 105 hASCs, indem Sie Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.</li>
		<li>Inkubieren Sie den Chip bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2, indem Sie bei 1.000–2.000 U/min für 3 h rotieren.</li>
		<li>Fügen Sie 100 l der Zellsuspensionen hinzu, die den zweiten Satz von Zellen, 4 x 105 MRC-5s, enthalten, indem Sie Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.</li>
		<li>Kultur die Zellen im Inkubator bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2 durch Drehen bei 1.000–2.000 U/min. Die Janus Sphäroide werden innerhalb von 24 h erstellt. Für eine langfristige Kultur, ändern Sie das Kulturmedium jeden Tag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sandwich-Sphäroid-Formation
	<ol>
<li>Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die die ersten Zellen enthalten, 1,5 x 105 hASCs, indem Sie Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.</li>
		<li>Inkubieren Sie den Chip bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit und 5%CO2, indem Sie bei 1.000–2.000 U/min für 3 h rotieren.</li>
		<li>Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die die zweiten Zellen enthalten, 3 x 105 MRC-5s, durch Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.</li>
		<li>Inkubieren Sie den Chip bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit% und 5%CO2, indem Sie bei 1.000–2.000 U/min für 3 h rotieren.</li>
		<li>Fügen Sie 100 l Zellsuspensionen hinzu, die die dritten Zellen enthalten, 1,5 x 105 hASCs, indem Sie Pipettieren, während sich der Chip bei 500–1.000 U/min dreht. Drehen Sie dann den Chip bei 3.000 Rpm für 3 min.</li>
		<li>Kultur die Zellen im Inkubator bei 36,5 °C, >95% Luftfeuchtigkeit% und 5%CO2 durch Drehen bei 1.000–2.000 U/min. Die Sandwich-Sphäroide werden innerhalb von 12 h erstellt. Für eine langfristige Kultur, ändern Sie das Kulturmedium jeden Tag.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Zellfärbung
<ol><li>Erwärmen Sie den Zellfluoreszenzfarbstoff auf Raumtemperatur (20 °C).</li>
	<li>Fügen Sie 20 l wasserfreies Dimethylsulfoxid (DMSO) pro Durchstechflasche hinzu, um eine 1 mM-Lösung herzustellen.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Fluoreszenz mit DMEM auf eine Endarbeitskonzentration von 1 m.</li>
	<li>Fügen Sie die Fluoreszenz in die Zellsuspension und setzen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette wieder auf.</li>
	<li>20 min bei 36,5 °C inkubieren, Luftfeuchtigkeit von >95% und 5%CO2.</li>
</ol>

<ol><li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+Advantages+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li>
<li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li>
<li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+in+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li>
<li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li>
<li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
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<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105(2014).</li>
<li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li>
<li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+A%3A+Physical%22%5BJournal%5D)">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li>
<li>Park, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1(2016).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li>
<li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li>
<li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li>
<li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li>
<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das CMS ist ein geschlossenes System, bei dem alle injizierten Zellen ohne Abfall in den Mikrobrunnen gelangen, was es effizienter und wirtschaftlicher macht als herkömmliche mikrowellbasierte Sphäroid-Erzeugungsmethoden. Im CMS-System wird das Medium alle 12–24 h durch ein Saugloch ersetzt, das entwickelt wurde, um die Medien im Chip zu entfernen (Abbildung 3A). Während des Mediensaugvorgangs entweicht kaum ein Medium aus dem Inneren des Mikrobrunnens aufgrund der Oberflächenspannung zwisch...

Es ist einfacher, biologische In-vivo-Mikroumgebungen mit dreidimensionaler (3D) Sphäroid-Zellkultur zu simulieren als mit zweidimensionaler (2D) Zellkultur (z. B. konventionelle Petrischalenzellkultur), um physiologisch realistischere experimentelle Ergebnisse1. Derzeit verfügbare Sphäroid-Bildungsmethoden umfassen die Hängetropfentechnik2, Flüssigkeits-Overlay-Technik3, Carboxymethyl-Zellulose-Technik4, magnetische kraftbasierte mikrofluidische Technik5, und die Verwendung von Bioreaktoren6. Obwohl jede Methode ihre eigenen Vorteile hat, ist eine weitere Verbesserung der Reproduzierbarkeit, Produktivität und Erzeugung von Cokultursphäroiden erforderlich. Während beispielsweise die magnetkraftbasierte mikrofluidische Technik5 relativ kostengünstig ist, müssen die Auswirkungen starker Magnetfelder auf lebende Zellen sorgfältig geprüft werden. Die Vorteile der Sphäroidkultur, insbesondere bei der Untersuchung der mesenchymalen Stammzelldifferenzierung und -proliferation, wurden in mehreren Studien7,8,9berichtet.
Das zentrifugale mikrofluidische System, auch Lab-on-a-CD (Compact Disc) genannt, ist nützlich, um die Flüssigkeit im Inneren leicht zu steuern und die Rotation des Substrats zu nutzen und wurde daher in biomedizinischen Anwendungen wie Immunoassays10eingesetzt. kolorimetrische Assays zum Nachweis biochemischer Marker11, Nukleinsäure-Amplifikation (PCR) Assays, automatisierte Blutanalysesysteme12und All-in-One-Zentrifugal-Mikrofluidika13. Die treibende Kraft, die die Flüssigkeit steuert, ist die Zentripetalkraft, die durch Rotation entsteht. Darüber hinaus können mehrere Funktionen des Mischens, Valvings und Sample-Splittings einfach in dieser einzigen CD-Plattform durchgeführt werden. Im Vergleich zu den oben genannten biochemischen Analysemethoden gab es jedoch weniger Versuche, CD-Plattformen auf Kulturzellen anzuwenden, insbesondere Sphäroide14.
In dieser Studie zeigen wir die Leistungsfähigkeit des zentrifugalen mikrofluidischen Sphäroid-basierten Sphäroid-Systems (CMS) durch Monokultur oder Kokultur von humanen Adipose-abgeleiteten Stammzellen (hASC) und menschlichen Lungenfibroblasten (MRC-5). In diesem Beitrag wird die Forschungsmethodik unserer Gruppe ausführlich beschrieben15. So kann die Sphäroid-Kultur-Lab-on-a-CD-Plattform einfach reproduziert werden. Ein CMS-Erzeugungssystem bestehend aus einem CMS-Kulturchip, einem Chiphalter, einem Gleichstrommotor, einer Motorhalterung und einer rotierenden Plattform wird vorgestellt. Die Motorhalterung ist 3D mit Acrylnitril Butadien-Styrol (ABS) bedruckt. Der Chiphalter und die rotierende Plattform sind CNC (Computer numerische Steuerung) mit dem PC (Polycarbonat) bearbeitet. Die Drehzahl des Motors wird von 200 bis 4.500 Umdrehungen pro Minute durch Kodierung eines PID-Algorithmus (proportional-integral-derivative) auf Basis der Pulsweitenmodulation gesteuert. Seine Abmessungen sind 100 mm x 100 mm x 150 mm und wiegt 860 g, so dass es einfach zu handhaben. Mit dem CMS-System können Sphäroide unter verschiedenen Schwerkraftbedingungen von 1 x g bis 521 x gerzeugt werden, so dass die Untersuchung der Zelldifferenzierungsförderung unter hoher Schwerkraft von den 2D-Zellen16,17 bis 3D erweitert werden kann. Sphäroid. Kokultur verschiedener Zelltypen ist auch eine Schlüsseltechnologie, um die in vivo-Umgebung effektiv nachzuahmen18. Das CMS-System kann problemlos Monokultur-Sphäroide sowie Cokultur-Sphäroide verschiedener Strukturtypen (z. B. konzentrisch, Janus und Sandwich) erzeugen. Das CMS-System kann nicht nur in einfachen Sphäroidstudien, sondern auch in 3D-Organoidstudien genutzt werden, um menschliche Organstrukturen zu berücksichtigen.

<table><tbody><tr><td>3D-Drucker</td><td>Cubicon</td><td>3DP-210F</td><td></td></tr> Aus <tr><td>Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen (hASC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-011</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Enthält 1% des fertigen Mediums und</td></tr><tr><td>Puffer CellTracker Grün CMFDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>CellTracker Rot CMTPX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34552</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Computer numerische Steuerung (CNC) Rotationsgravierer</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>Gleichstrommotor</td><td>Nurielectricity Inc.</td><td>MB-4385E</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos modifiziertes Eaggle-Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>Enthält 10 % fertige mittlere</td></tr><tr><td>menschliche Lungenfibroblasten (MRC-5)</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Inventor 2019</td><td>Autodesk</td><td></td><td>3D computergestütztes Designprogramm</td></tr><tr><td>Petrischale & Phi; 150 mm</td><td>JetBiofill</td><td>CAD010150</td><td>Oberflächenbehandelter</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11/6/9003</td><td>Verdünnen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 4% (w/v) Lösung</td></tr><tr><td>Polycarbonat (PC)</td><td>Acrylmall</td><td>AC15PC</td><td>200 x 200 x 15 mm</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr></tbody></table>

lab-on-a-cd-plattform zur generierung mehrzelliger dreidimensionaler sphäriden

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Eine dreidimensionale sphäroide Zellkultur kann in Zellexperimenten nützlichere Ergebnisse erzielen, da sie Zellmikroumgebungen des lebenden Körpers besser simulieren kann als zweidimensionale Zellkulturen. In dieser Studie haben wir eine elektrische motorgesteuerte Lab-on-a-CD-Plattform (Compact Disc) hergestellt, ein so genanntes zentrifugales mikrofluidisches Sphäroid-basiertesphärisches Sphäroid (CMS)-Kultursystem, um dreidimensionale (3D) Zellsphäride zu erstellen, die eine hohe Zentrifugalkraft implementieren. Dieses Gerät kann die Drehzahlen variieren, um Schwerkraftbedingungen von 1 x g bis 521 x gzu erzeugen. Das CMS-System hat einen Durchmesser von 6 cm, hat hundert 400 m Mikroschäbe und wird durch Formen mit Polydimethylsiloxan in einer Polycarbonatform hergestellt, die von einer numerischen Computersteuerungsmaschine vorgefertigt wurde. Eine Barrierewand am Kanaleingang des CMS-Systems nutzt Fliehkraft, um Zellen gleichmäßig im Chip zu verteilen. Am Ende des Kanals befindet sich ein Diabereich, der es den Zellen ermöglicht, in die Mikrobrunnen einzudringen. Als Demonstration wurden Sphäroide durch Monokultur und Kokultur menschlicher, aus Fettgewonnener Stammzellen und menschlicher Lungenfibroblasten unter Hochgravitationsbedingungen mit Hilfe des Systems erzeugt. Das CMS-System verwendete ein einfaches Betriebsschema, um Cokultur-Sphäroide verschiedener Strukturen von Konzentrisch, Janus und Sandwich zu produzieren. Das CMS-System wird in Zellbiologie- und Gewebe-Engineering-Studien nützlich sein, die Sphäroide und organoide Kultur von einzelnen oder mehreren Zelltypen erfordern.

Der CMS-Kulturchip mit einem Durchmesser von 6 cm (Abbildung 2) wurde erfolgreich nach dem obigen Protokoll hergestellt. Zunächst wurde der Chip getrennt von einer oberen und einer unteren Schicht hergestellt und dann durch Plasmabindung miteinander verbunden. Die resultierenden Sphäroide können leicht durch Lösen des Chips gesammelt werden. Der Kanal des CMS-Kulturchips besteht aus einem Einlassanschluss und zentralen, gleitenden und Microwell-Regionen (Abbildung 3</str...

Wir präsentieren ein motorbetriebenes zentrifugales mikrofluidisches Gerät, das Zellsphäride kultivieren kann. Mit diesem Gerät können Sphäroide von einzelnen oder mehreren Zelltypen leicht unter hohen Schwerkraftbedingungen kokultiviert werden.

Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Diese Technik kann verwendet werden, um Zellsphäride aus einzelnen und mehreren Zelltypen mit einer Lab-on-a-CD-Plattform zu erzeugen, einem wegweisenden System für die schnelle Erzeugung von Sphäroiden. Die Technik verwendet Zentrifugalkraft, um Zellen in ausgewiesenen Mikrobrunnen abzulagern, was die sequentielle Elation mehrerer Zelltypen für die Produktion verschiedener Sphäroide ermöglicht. Für die CMS-Kulturchip-Herstellung, machen sie zuerst Polycarbonat-Formen für die obere und untere Schicht des Kulturchips durch Computer-Numerische Steuerungsbearbeitung.Nächste Mischen PDMS-Basis und PDMS-Härtungsmittel in einem Verhältnis von 10 zu 1 für fünf Minuten, bevor Sie die Mischung in einem Trockengerät für eine Stunde, um Luftblasen zu entfernen. Gießen Sie die entgaste PDMS-Mischung in die CMS-Kultur-Chip-Formen, und legen Sie die Formen in den Trockenbau für eine weitere Stunde, um alle Luftblasen zu entfernen. Am Ende der zweiten Entgasung das Gemisch in einer Wärmekammer bei 80 Grad Celsius zwei Stunden lang aushärten, bevor die Späne in einen vakuumierten Plasmareiniger mit den zu verklebenden Oberflächen nach oben gegeben werden.Setzen Sie die Kulturchips 30 Sekunden lang

lab-on-cd-platform-for-generating-multicellular-three-dimensional

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben eine einfache, schnelle Methode zur Erzeugung von 3D-Gewebe-like Sphäroide und ihre mögliche Anwendung auf Unterschiede in der Zell-Zell-Interaktionen zu quantifizieren.

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Sphäroide sind eine Art von 3D-Zellkulturmodell, das verwendet wird, um die Umgebung einer Zelle im Vergleich zu 2D-Zellkultur-Monolayer-Modellen genauer darzustellen. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie Wissenschaftler Sphäroide aus einer Darmkrebszelllinie erzeugen und Lebendzell-Imaging anwenden, um das Wachstum der Sphäroide zu verfolgen.

Sphäroiderzeugung aus Zelllinien: Eine dreidimensionale (3D) Zellkulturmethode

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Hier beschreiben wir die großtechnische Produktion von aus Fett gewonnenen Stroma-/Stammzell-Sphäroiden (ASC) unter Verwendung eines automatisierten Pipettiersystems zur Aussaat der Zellsuspension, wodurch die Homogenität der Sphäroidgröße und -form sichergestellt wird. Diese ASC-Sphäroide können als Bausteine für 3D-Bioprinting-Ansätze verwendet werden.

Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von drei verschiedenen Arten von Sphäroiden in einer Weise, die sie für ein groß angelegtes High-Content-Screening und -Analyse geeignet macht. Darüber hinaus werden Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie sie auf Sphäroid- und Einzelzellebene analysiert werden können.

Eine robuste Methode für die großtechnische Produktion von Sphäroiden für High-Content-Screening- und Analyseanwendungen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur kostengünstigen Herstellung von Gewebesphäroiden in großem Maßstab unter Verwendung eines 3D-gedruckten stempelähnlichen Geräts.

Erzeugung von Gewebesphäroiden über ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät

Wir stellen ein Protokoll für die Züchtung hochreproduzierbarer Sphäroide und deren phänotypische Charakterisierung mittels Bilderfassung und Proteomik vor.

Halbautomatische phänotypische Analyse funktioneller 3D-Sphäroidzellkulturen

In diesem Artikel beschreiben wir verschiedene Methoden zur Bildung von multizellulären Sphäroiden, um eine anschließende Multiparameter-Lebendzellmikroskopie durchzuführen. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM), zellulärer Autofluoreszenz, Färbefarbstoffen und Nanopartikeln wird der Ansatz zur Analyse des Zellstoffwechsels, der Hypoxie und des Zelltods bei lebenden dreidimensionalen (3D) Krebs- und Stammzell-abgeleiteten Sphäroiden demonstriert.

Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden

In dieser Studie wird eine kostengünstige und effiziente Methodik zur Generierung von 3D-Zellstrukturen unter Verwendung eines stempelbasierten Systems zur Erstellung von Mikrovertiefungen in Agaroseformen vorgestellt. Das System fördert die Bildung einheitlicher Sphäroide/Organoide und verbessert so die Zellinteraktionen. Dieser Ansatz reduziert die experimentelle Variabilität und unterstützt Anwendungen in der Wirkstoffdiagnostik und im Tissue Engineering.

Erzeugung von dreidimensionalen Sphäroiden/Organoiden aus zweidimensionalen Zellkulturen mit Hilfe eines neuartigen Stempelgeräts

Es besteht ein dringender Bedarf an 3D-Krebsmodellen, die heterozelluläre Wechselwirkungen erfassen, um Krebsmetastasen zu untersuchen. Unsere Studie stellt die Erzeugung von heteromultizellulären Stroma-Epithel-Epithelen in einer gerüstfreien und gerüstfreien Umgebung vor, die zur Untersuchung der Invasion und der zellulären räumlichen Verteilungen verwendet werden kann.

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Erfahren Sie die Generierung von mehrlagigen Zellsphäroiden mit einer zentrifugalen Lab-on-a-CD-Plattform. Diese Methode nutzt Zentrifugalkraft zur effizienten Zellablagerung in Mikrowells für Gewebeengineering.

Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

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