Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion

Ziel dieses Verfahrens ist es, in 3D kultivierte Zellen einer interstitiellen Flüssigkeitsströmung auszusetzen und die strömungsvermittelten Effekte auf die Zellinvasion zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Gellösung hergestellt wird, die aus Kollagen Typ 1 und Matrigel besteht. Der zweite Schritt besteht darin, der Gellösung eine bestimmte Konzentration von Zellen zuzusetzen.

Als nächstes wird die Zellsuspension in ein Transwell mit einem Durchmesser von 12 Millimetern und einer Porengröße von acht Mikrometern gegeben und bei 37 Grad Celsius inkubiert, bis die Matrix geliert. Der letzte Schritt im Assay-Setup besteht darin, den Transwells bestimmte Mengen an Medien zuzugeben, um statische und Fließbedingungen zu schaffen. 24 Stunden später werden die Transwell-Membranen fixiert, gefärbt und visualisiert, um die Anzahl der befallenen Zellen zu quantifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. mikrofluidischen, interstitiellen Strömungskammern, besteht darin, dass sie keine Pumpen oder spezielle Geräte benötigt und es den Forschern ermöglicht, mehrere Erkrankungen oder Behandlungen einfach und schnell zu testen. Obwohl diese Methode Einblicke in die zelluläre Migration und Invasion geben kann, kann sie auch verwendet oder angewendet werden, um die Wirkung der interstitiellen Flüssigkeitsströmung auf anderes relevantes zelluläres Verhalten zu untersuchen, wie z. B. Proteinexpression, Zellproliferation und Veränderungen in der Zellsignalisierung. Demonstriert wird dieses Verfahren mit einem LIMA two chaa.

Ein Doktorand in meinem Labor: Beginnen Sie diese Prozedur, indem Sie ein kleines Aliquot Matri-Gel bei vier Grad Celsius auf Eis werfen. Bereiten Sie als Nächstes das Gelrezept mit sterilem PBS-Wasser, Natriumhydroxid, Matrigel und Kollagen vom Typ 1 des Rattenschwanzes vor. Mischen Sie dann die Bestandteile des Gels in der gleichen Reihenfolge auf Eis und inkubieren Sie die endgültige Lösung eine Stunde lang bei vier Grad Celsius.

Setzen Sie nun acht Micro-Po-Zellkultureinsätze mit einem Durchmesser von 12 Millimetern mit einer sterilisierten Pinzette in eine 12-Well-Platte ein. Zählen Sie dann die Zellen und resuspendieren Sie sie in serumfreien Medien bei fünfmal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter, fügen Sie 100 Mikroliter Zellsuspension zu 900 Mikrolitern Gellösung hinzu. Mischen Sie sie danach gründlich, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.

Geben Sie anschließend 150 Mikroliter der Endmischung zu jedem Einsatz. Übertragen Sie dann die Einsätze für 30 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator, bis das Gel polymerisiert. Für den statischen Zustand geben Sie 100 Mikroliter des serumfreien Mediums auf das Gel und 1.200 Mikroliter Mikroliter unter den Einsatz.

Die Flüssigkeitsstände innerhalb und außerhalb des Einsatzes in der Vertiefung sollten ungefähr gleich sein, was zu einem minimalen Druckunterschied über das Gel und keinem interstitiellen Fluss führt. Für die Fließbedingung fügen Sie 100 Mikroliter des serumfreien Mediums unter dem Einsatz und 650 Mikroliter über dem Gel hinzu. Versuchen Sie gleichzeitig, Luftblasen unter dem Einsatz zu vermeiden, da diese verhindern, dass Zellen an diesen Stellen durch die Membran wandern

Legen Sie die Platte dann für 24 Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Geben Sie in diesem Schritt 500 Mikroliter einmaliges PBS pro Vertiefung in eine neue 24-Well-Platte zum Waschen der Einsätze. Entfernen Sie dann das Medium, das im oberen Teil der Strömungsvertiefungen verbleibt.

Verwenden Sie anschließend Wattestäbchen, um das Gel von den Einsätzen zu entfernen. Wischen Sie die Oberseite der Oberfläche der Membran ab, um Nicht-VA-Zellen zu entfernen. Waschen Sie dann die Einsätze, indem Sie sie 15 Sekunden lang in die 24-Well-Platte legen, die einmal PBS enthält.

Entfernen Sie danach das PBS und fügen Sie 500 Mikroliter 4%para Formaldehyd unter jede Einlage hinzu. Inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die transmigrierten Zellen zu fixieren. Entfernen Sie dann das PFA und spülen Sie sie einmal mit 500 Mikrolitern einmal PBS aus, um das restliche Fixiermittel zu entfernen.

Geben Sie anschließend 500 Mikroliter 0,5%ige Triton X 100 Lösung unter die Einsätze und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Zellen zu permieren, schneiden Sie die Membranen mit einer Rasierklinge aus dem Einsatz heraus. Geben Sie sie dann in 100 Mikroliter von zwei Mikrogramm pro Milliliter DPI in einer einmal PBS-Lösung.

Achten Sie darauf, die Unterseite der Membran nach unten zu legen. Die DPI-Lösung muss einige Minuten vor der Verwendung zubereitet und im Dunkeln aufbewahrt werden. Wickeln Sie die Platte nun in Alufolie ein.

Stellen Sie es bei 150 U/min für 30 Minuten Raumtemperatur auf einen Shaker. Waschen Sie dann die Membranen in 500 Mikrolitern einmal PBS und legen Sie sie für 10 Minuten wieder auf den Shaker. Um den freien Jy zu entfernen, wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male.

Der nächste Schritt besteht darin, die Membranen mit den transmigrierten Zellen nach oben auf Objektträger zu legen. Fügen Sie den Membranen eine Montagelösung hinzu. Decken Sie diese dann mit Deckgläsern ab.

Zählen Sie anschließend den Fleck zu den Zellkernen und berechnen Sie die Anzahl der befallenen Zellen gemäß dem beigefügten Manuskript. Diese Abbildung zeigt die transmigrierten MDA MB 4 35 s-Zellen auf der Membran. Die invadierten Zellen wurden nach dem interstitiellen Fluid-Flow-Invasions-Assay fixiert und mit DPI und Alexa Fluor 4 88 konjugiertem Foid ingefärbt, um die Zählung der eingedrungenen Zellen zu erleichtern.

Dies ist die Membran unter dem Hellfeld und hier sind die Dappy Stain-Kerne. Die Alexa Fluor 4 88 Foid in gefärbt mit F-Aktin sind hier zu sehen. Diese Grafik zeigt, dass die Invasion von metastasierten Melanomzellen von MDA MB 4 35 s durch den interstitiellen Fluss signifikant verstärkt wurde.

Nach 24 Stunden werden die Ergebnisse auf den Durchschnitt der statischen Invasionsbedingung normalisiert und der Mittelwert von sechs Zellkultureinsätzen dargestellt. Die Differenz zwischen den Bedingungen ist mit einem P-Wert von 0,003 statistisch signifikant. Sobald der interstitielle Fluid-Flow-Assay gemeistert ist, kann er in zwei Stunden eingerichtet werden, gefolgt von einer 24-stündigen Inkubation und dann zwei Stunden zum Fixieren und Färben der Transformationsmembranen.

Nach diesem Verfahren können Zellen, Proteine oder Nukleinsäuren leicht extrahiert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie sich die Gen- und Proteinexpression als Reaktion auf die interstitielle Flüssigkeitsströmung verändert. Seit seiner Entwicklung ist dies zu einem unverzichtbaren Assay für Forscher geworden, die die Auswirkungen des interstitiellen Flusses auf Krebszellen untersuchen.