Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, in 3D kultivierte Zellen einer interstitiellen Flüssigkeitsströmung auszusetzen und die durch die Strömung vermittelten Effekte auf die Zellinvasion zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Gel-Lösung aus Typ-I-Kollagen und Matrigel hergestellt wird. Im zweiten Schritt wird eine definierte Zellkonzentration zur Gel-Lösung hinzugefügt.

Anschließend wird die Zellsuspension einer Transwell-Membran mit zwölf Millimetern Durchmesser und acht Mikrometer Porengröße hinzugefügt und bei 37 Grad Celsius inkubiert, bis die Matrix geliert. Der letzte Schritt im Assayaufbau besteht darin, definierte Mengen an Medium zu den Transwells hinzuzufügen, um statische und Flussbedingungen zu erzeugen. 24 Stunden später werden die Transwell-Membranen fixiert, gefärbt und zur Quantifizierung der Anzahl invadierter Zellen untersucht.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie Mikrofluidik oder Interstitialflusskammern, besteht darin, dass sie keine Pumpen oder spezielle Ausrüstung erfordert und es den Forschern ermöglicht, mehrere Bedingungen oder Behandlungen einfach und schnell zu testen. Obwohl diese Methode Einblicke in die zelluläre Migration und Invasion ermöglichen kann, lässt sie sich auch nutzen, um die Auswirkungen des Interstitialflusses auf anderes zelluläres Verhalten zu untersuchen, beispielsweise die Proteinausprägung, die Zellproliferation und Veränderungen in der zellulären Signalübertragung. Diese Prozedur wird durchgeführt von einem LIMA two chaa.

Ein Doktorand in meinem Labor beginnt dieses Verfahren, indem er eine kleine Aliquot von Matrigel auf Eis bei vier Grad Celsius legt. Als Nächstes bereitet man die Gel-Zusammensetzung mit PBS, steriler Wasser, Natriumhydroxid, Matrigel und Typ-I-Kollagen aus Rattenschwanz vor. Anschließend mischt man die Bestandteile des Gels auf Eis in der gleichen Reihenfolge und inkubiert die endgültige Lösung eine Stunde lang bei vier Grad Celsius.

Platzieren Sie nun eine 12 mm Durchmesser große, acht Mikro-Po-Zellkultur-Einlage mit einer sterilen Pinzette in eine 12-Loch-Platte. Zählen Sie anschließend die Zellen und resuspendieren Sie sie in serumfreiem Medium bei einer Konzentration von fünf mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter. Geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension zu 900 Mikroliter Gel-Lösung hinzu. Anschließend mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gründlich.

Fügen Sie anschließend 150 Mikroliter der Endmischung zu jedem Insert hinzu. Danach überführen Sie die Inserts in einen 37 °C warmen, mit 5 % Kohlendioxid versetzten Inkubator und lassen das Gel 30 Minuten lang polymerisieren. Für die statische Bedingung geben Sie 100 Mikroliter des serumfreien Mediums auf das Gel und 1.200 Mikroliter unter den Insert.

Die Flüssigkeitsstände innerhalb und außerhalb des Inserts im Well sollten annähernd gleich sein, sodass eine minimale Druckdifferenz über das Gel hinweg besteht und kein interstitieller Fluss auftritt. Für die Flussbedingung geben Sie 100 µL serumfreies Medium unter das Insert und 650 µL über das Gel. Gleichzeitig sollten Sie vermeiden, Luftblasen unterhalb des Inserts zu erzeugen, da diese die Zellen daran hindern würden, an diesen Stellen durch die Membran zu migrieren.

Danach die Platte 24 Stunden lang in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid stellen. In diesem Schritt 500 Mikroliter frisch zubereiteter 1×-PBS pro Vertiefung in eine neue 24-Loch-Platte geben, um die Einsätze zu waschen. Anschließend das im oberen Bereich der Flow-Trends-Vertiefungen verbliebene Medium entfernen.

Verwenden Sie anschließend Wattestäbchen, um das Gel aus den Einsätzen zu entfernen. Wischen Sie die Oberfläche der Membran ab, um nicht-VA-Zellen zu entfernen. Spülen Sie die Einsätze dann, indem Sie sie für 15 Sekunden in die 24-Loch-Platte geben, die einmalig PBS enthält.

Danach das PBS entfernen und unter jeden Insert 500 Mikroliter 4 % Paraformaldehyd hinzufügen. Die Proben zur Fixierung der transmigrierten Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend das PFA entfernen und die Proben einmal mit 500 Mikrolitern PBS spülen, um das restliche Fixativ zu entfernen.

Fügen Sie anschließend 500 Mikroliter einer 0,5 %igen Triton X-100-Lösung unterhalb der Inserts hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Um die Zellen zu permeabilisieren, schneiden Sie die Membranen mit einer Rasierklinge aus dem Insert heraus. Anschließend geben Sie sie in 100 Mikroliter einer Lösung aus zwei Mikrogramm pro Milliliter DAPI in 1× PBS.

Dabei darauf achten, dass die Unterseite der Membran nach unten zeigt. Die DPI-Lösung muss einige Minuten vor der Verwendung vorbereitet und im Dunkeln aufbewahrt werden. Wickeln Sie die Platte nun in Aluminiumfolie ein.

Platzieren Sie es auf einem Schüttler bei 150 U/min für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend waschen Sie die Membranen einmal mit 500 µL PBS und stellen sie für 10 Minuten erneut auf den Schüttler. Um freies Jy zu entfernen, wiederholen Sie den Waschschritt weitere zwei Mal.

Der nächste Schritt besteht darin, die Membranen auf Objektträger so zu platzieren, dass die transmigrierten Zellen nach oben zeigen. Fügen Sie Eindeckmedium zu den Membranen hinzu und decken Sie sie anschließend mit Deckgläsern ab.

Anschließend die Anzahl der DAPI-färbenden Kerne zählen und die Zahl der invadierten Zellen gemäß der beigefügten Anleitung berechnen. Diese Abbildung zeigt die transmigrierten MDA-MB-435-s-Zellen auf der Membran. Die invadierten Zellen wurden nach dem Invasionstest unter Einfluss interstitieller Flüssigkeitsströmung fixiert und mit DAPI sowie mit Alexa Fluor 488 konjugiertem Foidin gefärbt, um die Zählung der invadierten Zellen zu erleichtern.

Dies ist die Membran im Hellfeld und hier sind die Kerne mit DAPI-Färbung. Die mit Alexa Fluor 488 markierten F-Aktin-Fasern sind hier dargestellt. Dieses Diagramm zeigt, dass die Invasion metastasierender MDA-MB-435-Melanomzellen durch interstitiellen Fluss signifikant verstärkt wurde.

Nach 24 Stunden werden die Ergebnisse auf den Mittelwert der statischen Invasionssituation normalisiert, und der Mittelwert aus sechs Zellkultur-Einheiten wird dargestellt. Der Unterschied zwischen den Bedingungen ist statistisch signifikant mit einem P-Wert von 0,003. Sobald die Methode beherrscht ist, kann der Interstitialflüssigkeitsstrom-Test innerhalb von zwei Stunden aufgebaut werden, gefolgt von einer 24-stündigen Inkubation und anschließend zwei Stunden für das Fixieren und Färben der Transwell-Membranen.

Nach dieser Methode können Zellen, Proteine oder Nukleinsäuren leicht extrahiert werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise wie sich die Gen- und Proteinexpression als Reaktion auf Interstitialfluss verändern. Seit ihrer Entwicklung ist diese Methode zu einem unverzichtbaren Assay für Forscher geworden, die die Auswirkungen des Interstitialflusses auf Krebszellen untersuchen.