Name: Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Erfahren Sie, wie interstitielle Flüssigkeitsströmung die Invasion von Tumorzellen in 3D-Kollagen-Matrigel-Matrizen beeinflusst. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung zellulärer Invasion ohne spezialisierte Pumpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Assay Set-up <ol><li> Auftauen einer kleinen aliquoten (&lt;500 ul) von Matrigel auf Eis bei 4 ° C (etwa 2 Stunden). </li><li> Bereiten Sie Gel-Rezeptur (siehe Beispiel Volumina in Tabelle unten): 10x PBS (1x im Gesamtvolumen), 1 N Natronlauge (entspricht 0,023 Bände hinzugefügt Kollagen, respektive dem Kollagen den Empfehlungen des Herstellers, soweit erforderlich), geben Sie Matrigel und Kollagen I zu Endkonzentrationen von 1 mg / ml und 1,3 mg / ml (andere Matrix-Formulierungen verwendet werden, je nach Zelltyp und Experiment werden). </li></ol> Beispiel Gel-Rezeptur <table border="1"><tbody><tr><td> Komponenten </td><td> Stoffkonzentration </td><td> Endkonzentration </td><td> Fügen Volumen </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 10X </td><td> 1X </td><td> 0,090 ml </td></tr><tr><td> Steriles Wasser </td><td></td><td></td><td> 0,346 ml </td></tr><tr><td> 1 N NaOH </td><td></td><td></td><td> 0,008 ml </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 9,90 mg / ml </td><td> 1 mg / ml </td><td> 0,101 ml </td></tr><tr><td> Rattenschwanz Kollagen Typ I </td><td> 3,66 mg / ml </td><td> 1,3 mg / ml </td><td> 0,355 ml </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Mischen Komponenten des Gels auf Eis in der gleichen Reihenfolge wie oben und inkubieren endgültige Lösung für 1 Stunde bei 4 ° C Nach unserer Erfahrung, eine 1-stündigen Inkubation vor dem Aussähen der Zellen führt zu einer gleichmäßigeren Gelierung des Kollagens. Achten Sie darauf, Matrigel und Kollagen auf Eis halten zu allen Zeiten und an so schnell wie möglich arbeiten, um die Gelierung zu verhindern. </li><li> Platz 12 mm Durchmesser 8 um Pore Zellkultur-Inserts in eine 12-Well-Platte mit einer sterilisierten Pinzette. </li><li> Zählen von Zellen und Resuspendieren in serumfreiem Medium bei 5 × 10 6 Zellen / ml (Gesamtvolumen sollte 10% des Gel-Lösung). </li><li> Geben Sie 100 ul Zell-suspension zu 900 ul Gel-Lösung (Endzellkonzentration 5 x 10 5 Zellen / ml) mischen und gründlich durch Pipettieren vorsichtig nach oben und unten. </li><li> Fügen Sie 150 ul der fertigen Mischung für jeden Einsatz und Transfer zu einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für 30 Minuten, bis Gel polymerisiert. </li><li> Mit Serum-freien Medien, </li></ol><ul><li> Geben Sie 100 ul oben auf dem Gel und 1200 ul unter dem Einsatz für den statischen Zustand. Die Flüssigkeitsstand im Inneren des Einsatzes und außen in der auch etwa gleich sein sollte, was zu einer minimalen Druckdifferenz über dem Gel und ohne interstitielle Strömung. </li><li> Geben Sie 100 ul unter dem Einsatz und 650 ul oben Gel für den Strömungszustand. Seien Sie vorsichtig, um mögliche Luftblasen unterhalb des Einsatzes zu vermeiden, da diese Zellen, die aus der Migration durch die Membran an diesen Standorten zu verhindern. Die Druckdifferenz, die dieses Volumen erzeugt wird, ungefähr 1,3 cm H 2 O (oder 1 mm Hg). </li></ul><ol start="9"><li> Legen Sie die Platte in einem 37° C, 5% CO 2-Inkubator für 24 Stunden. </li></ol> 2. Zellfärbung und Zählen <ol><li> Fügen Sie 500 ul 1X PBS pro Vertiefung in neue 24-Well-Platte, das wird benutzt, um die Einsätze zu waschen. </li><li> Entfernen des Mediums restlichen in dem oberen Abschnitt der Strömung Transwells und die Lautstärke festzulegen. Berechnen Sie insgesamt eluierten Volumen durch Subtraktion des verbleibenden Volumens aus dem Gesamtvolumen ursprünglich aufgenommen, 650 ul (dies wird für Durchfluss Berechnungen verwendet werden, siehe unten). Wattestäbchen, um das Gel aus den Einsätzen zu entfernen und um die obere Oberfläche der Membran Wischtuch nicht befallenen Zellen zu entfernen. Legen Sie die Einsätze in den 24-Well-Platte mit 1X PBS für 15 s, um Einsätze zu waschen. </li><li> PBS entfernen und hinzufügen 500 ul von 4% Paraformaldehyd (PFA) unter jedem Einsatz, Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die transmigrierten Zellen zu fixieren. </li><li> Entfernen Sie die PFA und spülen Sie einmal mit 500 ul 1X PBS, um restliches Fixativ entfernen. </li><li> Fügen Sie 500 ul of 0,5% Triton X-100-Lösung unter den Einsätzen und inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu permeabilisieren. </li><li> Schneiden Sie aus Membranen des Einsatzes mit einer Rasierklinge und Ort in 100 ul 2 pg / ml DAPI in 1X PBS-Lösung, wobei darauf geachtet, um die Unterseite der Membran der Vorderseite nach unten platzieren (transmigrierten Zellen nach unten). </li><li> Wrap Platte in Alufolie nehmen und auf einem Schüttler bei 150 rpm für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie Membranen in 500 ul 1X PBS auf Schüttler (3 Mal wiederholen für jeweils 10 Minuten), um freie DAPI zu entfernen. </li><li> Ort Membranen auf Glasplättchen mit transmigrierten Zellen nach oben, fügen Montagelösung und Deckglas. </li></ol> 3. Datenanalyse <ol><li> Count DAPI-gefärbten Zellkernen auf 5 zufällig ausgewählten Standorten jeder Membran (bleiben Sie weg von den Rändern und verwenden Sie einen 10x-oder 20x Objektiv). </li><li> Berechnen des Durchschnitts-Zellen und erhalten die prozentuale Invasion durch Verwendung der folgenden Formel: Invasion Prozent = 100% x (durchschnittliche Zellzahl x Membranfläche) / (Fläche des mikroskopischen Bildes x Anzahl der Zellen seeded) Die Invasion Prozent bis zu einem gewissen Kontrollbedingung (in der Regel der statische Zustand) um einen Vergleich zwischen unabhängigen Experimenten ermöglichen normalisiert werden. </li><li> Berechnen der durchschnittlichen Fließgeschwindigkeit: Die Gesamthöhe eluierte Volumen in der Strömungszustand von der Inkubationszeit (z. B. 24 Stunden). </li><li> Berechnen Sie die mittlere Fließgeschwindigkeit: Teilen Sie die mittlere Strömungsgeschwindigkeit durch die Querschnittsfläche des Gels / Membran (in diesem Fall 60 mm 2). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Um Tumorzellinvasion unter interstitielle Strömung zu messen, führten wir unsere 3-D-Flow Invasion Assay unter Verwendung von MDA-MB-435S metastasierendem Melanom-Zellen. Diese Zellen haben früher gezeigt, dass in Reaktion auf interstitielle Fluidströmung 13-14 einzudringen. Die Zellen wurden in einer Matrix von 1,3 mg / ml Ratten-tai aus eingebettetenl Sehne Kollagen Typ I und 1 mg / ml Matrigel Basalmembran-Matrix in einer endgültigen Zellkonzentration von 5 x 10 5 Zellen / ml. Zwei verschiedene Bedingungen wurden verglichen: (1) Durchschnitt interstitielle flow = 0,1 &amp;mgr; s -1 und (2) statischen Zustand = keine messbare Durchfluss (Abbildung 1). Nach 24 Stunden wurden die Zellen, die durch die Poren der Membran eingedrungen mit DAPI gefärbt die Zellzählung erleichtern. 2 zeigt ein repräsentatives Bild der befallenen Zellen. Unter Hellfeld, sind nur die Poren der Membran sichtbar. Fluoreszenz-, die DAPI-gefärbten Nuklei wurden zum Zählen von Zellen und die Phalloidin gefärbt F-Aktin-Strukturen wurden verwendet, um die Zellkörper (optional) zu visualisieren. Mit Hilfe eines Student-t-Test unter Annahme gleicher Varianzen haben wir gezeigt, dass interstitielle Flow signifikant erhöht MDA-MB-435S Zellinvasion von 2,3-fache gegenüber der statischen Bedingungen (p = 0,003) (Abbildung 3). Diese corroborates zu ähnlichen Ergebnissen (aber mit unterschiedlichen Matrix-Bedingungen und sind daher Strömungsgeschwindigkeiten) mit dieser Zelllinie 13-14. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig1.jpg" /> 1. Schematische Darstellung der 3-D-interstitiellen Fluidströmung Invasionshemmtest. Bereiten Sie zuerst Gel-Lösung unter Verwendung von geeigneten Konzentrationen und Volumina. Dann fügen Sie Zellen auf Gel-Lösung und Transfer zum Zellkultur-Inserts. Schließlich fügen Sie entsprechende Volumen von Medien auf jede Bedingung und inkubieren. Interstitielle Flüssigkeit fließt durch einen Fluiddruck Kopf getrieben. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig2.jpg" /> 2. Transmigrierten MDA-MB-435S-Zellen auf der Membran. A) Bild von der Membran unter Hellfeld;; befallenen Zellen wurden nach unserer interstitiellen Flüssigkeit fließen Invasion Assay und mit DAPI gefärbt und Alexa Fluor 488-Phalloidin zu erleichtern Zählen der befallenen Zellen fixiert B) DAPI staINED Zellkerne (blau); C) Alexa Fluor 488-Phalloidin angefärbt F-Aktin (in grün). Maßstabsbalken repräsentiert 50 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig3.jpg" /> Abbildung 3. Erhöhte Invasion von MDA-MB-435S-Zellen unter Strom. Zellinvasion nach 24 Stunden deutlich durch interstitielle flow (p = 0,003) verbessert. Die Ergebnisse sind der Durchschnitt statischen Zustand normalisiert und Werte repräsentieren den Mittelwert ± SEM von 6 Zellkultur-Inserts.

<ol><li>Cichon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+influences+that+drive+progression+from+benign+breast+disease+to+invasive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mammary+Gland.+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer.</a> J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).</li>
<li>Proia, D. A., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma%3A+tumor+agonist+or+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Stroma: tumor agonist or antagonist.</a> Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+.Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment and progression.</a> J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).</li>
<li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li>
<li>Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+transfer+of+fluid+in+the+interstitial+compartment+of+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors.</a> Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).</li>
<li>Dafni, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+165+drives+peritumor+interstitial+convection+and+induces+lymphatic+drain%3A+magnetic+resonance+imaging%2C+confocal+microscopy%2C+and+histological+tracking+of+triple-labeled+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin.</a> Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).</li>
<li>Chary, S. R., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+interstitial+convection+and+diffusion+of+albumin+in+normal+and+neoplastic+tissues+by+fluorescence+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).</li>
<li>Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).</li>
<li>Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microvasculature+and+microenvironment%3A+novel+insights+through+intravital+imaging+in+pre-clinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models.</a> Microcirculation. 17, 206-225 (2010).</li>
<li>Shields, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chemotaxis+as+a+mechanism+of+tumor+cell+homing+to+lymphatics+via+interstitial+flow+and+autocrine+CCR7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling.</a> Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).</li>
<li>Shieh, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+invasion+is+promoted+by+interstitial+flow-induced+matrix+priming+by+stromal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts.</a> Cancer Res. 71, 790-800 (2011).</li>
<li>Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+interstitial+flow+mechanotransduction+regulating+MMP-13+expression+and+cell+motility+via+FAK-ERK+in+3D+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen.</a> PLoS One. 6, e15956(2011).</li>
<li>Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+morphogen+gradients+by+subtle+interstitial+flow+and+matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions.</a> Biophys J. 91, 113-121 (2006).</li>
<li>Miteva, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmural+flow+modulates+cell+and+fluid+transport+functions+of+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium.</a> Circ. Res. 106, 920-931 (2010).</li>
<li>Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+flow+induces+myofibroblast+differentiation+and+collagen+alignment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro.</a> J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).</li>
<li>Kunder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-derived+particles+deliver+peripheral+signals+to+remote+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).</li>
<li>Helm, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+interstitial+flow+and+VEGF+directs+capillary+morphogenesis+in+vitro+through+a+gradient+amplification+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).</li>
<li>McGuire, P. G., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+plasminogen+activator+with+a+reconstituted+basement+membrane+matrix+and+extracellular+macromolecules+produced+by+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells.</a> J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).</li>
<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).</li>
<li>Haessler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+dynamics+of+breast+cancer+cells+in+a+tunable+3D+interstitial+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber.</a> Integr. Biol. (Camb). , (2011).</li>
<li>Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+flow+influences+direction+of+tumor+cell+migration+through+competing+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Hier haben wir eine Methodik zur Quantifizierung der Wirkung der Strömung auf interstitielle Tumorzellinvasion, unter Verwendung von Zellen in einem 3-D-Matrix in einer Zellkultureinsatzes eingebetteten beschrieben. Diese und ähnliche Verfahren sind verwendet worden, um die Wirkung der interstitiellen Strömung auf einer Vielzahl von Zelltypen 13-15, 17 studierst. Unser Ansatz teilweise imitiert die Matrix Mikroumgebung des Tumors mit Kollagen Typ I und Matrigel, die Proteine ​​in der Basalmembran von Epithelg...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Collagen (Rattenschwanz) </td><td> BD </td><td> 354236 </td><td> Halten sterilen </td></tr><tr><td> Millicell Zellkultureinsatzes </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td> 8 mu m Porendurchmesser, Polycarbonat-Membran </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td> 354234 </td><td> Halten sterilen </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 100M-8202 </td><td> 10x für die Vorbereitung Gel-Lösung, 1x für Waschschritte </td></tr><tr><td> Natriumhydroxid, 1,0 N-Lösung </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S2770 </td><td> Halten sterilen </td></tr><tr><td> DMEM 1X </td><td> CellGro </td><td> 10 bis 013-CV </td><td> Halten sterilen </td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> 511150 </td><td> Halten sterilen </td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin </td><td> CellGro </td><td> 30002CI </td><td> Halten sterilen </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> X100-500 ml </td><td> 0,5% in PBS </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Fisher Scientific </td><td> 04042-500 </td><td> 4% in PBS </td></tr><tr><td> Deionisiertes Wasser </td><td></td><td></td><td> Halten sterilen </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diaminido-2-phenylindol (DAPI) </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215757401 </td><td> 1 mg / ml Stammlösung </td></tr><tr><td> Montage-Lösung </td><td> Thermo Scientific </td><td> TA-030-FM </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> CellGro </td><td> 25-052-CI </td><td> Halten sterilen </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

dreidimensionale zellkultur-modell zur messung der auswirkungen der interstitiellen flüssigkeit flow auf tumorzellinvasion

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Das Wachstum und die Progression der meisten soliden Tumoren sind abhängig von der anfänglichen Transformation der Krebszellen und ihre Reaktion auf Stroma-assoziierten Signalmoleküle in der Tumor-Mikroumgebung 1. Bisher hat die Forschung auf die Tumor-Mikroumgebung in erster Linie auf die Tumor-Stroma-Interaktionen 2.1 konzentriert. Allerdings ist die Tumor-Mikroumgebung auch eine Vielzahl von biophysikalischen Kräfte, deren Wirkungen noch wenig verstanden. Diese Kräfte sind biomechanischen Folgen des Tumorwachstums, die zu Veränderungen in der Genexpression, Zellteilung, Differenzierung und Invasion 3 führen. Dichte-Matrix 4, Steifigkeit 5-6, 6-7 und Struktur, interstitielle Flüssigkeitsdruck 8, und der interstitiellen Flüssigkeit fließen 8 sind alle während der Tumorprogression verändert. Interstitielle Fluidströmung insbesondere eine höhere Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe 8-10. Die geschätzte interstitiellen Flüssigkeit flow Geschwindigkeiten wurden gemessen und in dem Bereich von 0,1-3 um s -1, je nach Größe des Tumors und Differenzierung 9, 11. Dies ist aufgrund des erhöhten interstitiellen Druckes mit Tumor-induzierte Angiogenese und erhöhte Gefäßpermeabilität 12 hervorgerufen wird. Interstitielle Fluidströmung hat sich gezeigt, um das Eindringen von Krebszellen 13-14, vaskulären Fibroblasten und glatten Muskelzellen 15 erhöht wird. Dieses Eindringen kann auf autologen chemotaktische Gradienten um Zellen in 3-D 16 erzeugt oder erhöht Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Expression 15, Chemokin Sekretion und Expression Zelladhäsionsmolekül 17. Jedoch ist der Mechanismus, durch den Zellen zu erfassen Fluidströmung nicht gut verstanden. Zusätzlich zu verändern Tumorzelle Verhalten moduliert interstitiellen Flüssigkeit fließen die Aktivität anderer Zellen in der Tumor-Mikroumgebung. Es ist mit (a) Fahren Differenzierung von Fibroblasten in tumorpromovierenden myofibr verbundenoblasts 18, (b) Transportieren von Antigenen und anderen löslichen Faktoren in Lymphknoten 19, und (c) Modulieren lymphatischen Endothelzellen Morphogenese 20. Die hier vorgestellte Technik auferlegt interstitiellen Flüssigkeit fließen auf Zellen in vitro und quantifiziert deren Auswirkungen auf Invasion (Abbildung 1). Diese Methode wurde in mehreren Studien veröffentlicht worden, um die Auswirkungen der Strömung auf Stroma und die Invasion von Krebszellen 13-15, 17 zu messen. Durch Ändern der Matrix-Zusammensetzung, dem Zelltyp, und Zellkonzentration, kann dieses Verfahren auf andere Krankheiten und physiologische Systeme angewendet werden, um die Auswirkungen der interstitiellen Strömung auf zellulärer Prozesse, wie Invasion, Differenzierung, Proliferation und die Genexpression zu untersuchen.

Interstitielle Fluidstrom wird in soliden Tumoren erhöht und modulieren kann Tumorzellinvasion. Hier beschreiben wir eine Technik, um interstitielle Flüssigkeit fließen, um Zellen in einer Matrix eingebettet zu bringen und dann die seine Auswirkungen auf Zellinvasion. Diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Systeme zu studieren.

Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion

Das Wachstum und die Progression der meisten soliden Tumoren hängen von der initialen Transformation der Krebszellen und deren Reaktion auf stromaassoziierte Signalwege ab ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, in 3D kultivierte Zellen einer interstitiellen Flüssigkeitsströmung auszusetzen und die durch die Strömung vermittelten Effekte auf die Zellinvasion zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Gel-Lösung aus Typ-I-Kollagen und Matrigel hergestellt wird. Im zweiten Schritt wird eine definierte Zellkonzentration zur Gel-Lösung hinzugefügt.Anschließend wird die Zellsuspension einer Transwell-Membran mit zwölf Millimetern Durchmesser und acht Mikrometer Porengröße hinzugefügt und bei 37 Grad Celsius inkubiert, bis die Matrix geliert. Der letzte Schritt im Assayaufbau besteht darin, definierte Mengen an Medium zu den Transwells hinzuzufügen, um statische und Flussbedingungen zu erzeugen. 24 Stunden später werden die Transwell-Membranen fixiert, gefärbt und zur Quantifizierung der Anzahl invadierter Zellen untersucht.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie Mikrofluidik oder Interstitialflusskammern, besteht darin, dass sie keine Pumpen oder spezielle Ausrüstung erfordert und es den Forschern ermöglicht, mehrere Bedingungen oder Behandlungen einfach und schnell zu testen. Obwohl diese Methode Einblicke in

three-dimensional-cell-culture-model-for-measuring-effects

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Models of Tumorzellinvasion in dreidimensionale extrazelluläre Matrix besser...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Etablierung einer dreidimensionalen Co-Kultur von Tumor-Sphäroid und T-Zell. Es wird ein Agarose-Abguss mit Mikrovertiefungen hergestellt, die Tumor-Sphäroide enthalten, gefolgt von der Zugabe von T-Zellen. Nach der Inkubation ermöglicht dieser Aufbau die Untersuchung der Interaktion von T-Zellen mit Tumorsphäroiden in einer kontrollierten dreidimensionalen Umgebung.

Ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell der Infiltration von T-Zellen in Tumor-Sphäroiden

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden für die Verwendung von dreidimensionalen (3D-) Assays auf Brustkrebszellinvasion zu quantifizieren. Insbesondere diskutieren wir die Verfahren erforderlich, um solche Tests einrichten, Quantifizierung und Datenanalyse, sowie Methoden, um den Verlust der Membranintegrität, die bei Zellen eindringen tritt zu untersuchen.

Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Co-Kultur in drei Dimensionen, das nützlich ist, um multizelluläre Interaktionen und extrazelluläre Matrix-abhängige Modulation des Verhaltens von Krebszellen zu untersuchen. In diesem experimentellen Modell werden Krebszellen auf Kollagengelen kultiviert, die in humane krebsassoziierte Fibroblasten eingebettet sind.

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Diese Methode bewertet die Invasion von Krebszellen von Sphäroiden in eine umgebende 3D-Matrix.  Sphäroide werden über die Methode der hängenden Tropfenkultur erzeugt und dann in eine Matrix eingebettet, die aus Basalmembranmaterialien und Kollagen vom Typ I besteht.  Die Invasion aus den Sphäroiden wird anschließend überwacht.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Krebszellen werden in ein Kollagengel eingebettet und dann in ein azelluläres Fibringel eingebettet, um ein 3D-Kultursystem zu erzeugen, in dem die Invasivität und Bildung von Satellitentumoren überwacht werden kann.

Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden

Die Prozesse für die Blase Krebs Invasion darstellen Biomarker und therapeutische Entwicklungsmöglichkeiten. Hier präsentieren wir eine Blase Krebs Invasion Modell mit 3-d-Kultur der Tumor Sphäroide, Time-Lapse Bildgebung und konfokalen Mikroskopie. Diese Technik ist nützlich für die Definition der Merkmale des invasiven Verfahrens und für das screening von Therapeutika.

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

Ziel dieses Protokolls ist es, ein 3D-In-vitro-Modell zu etablieren, um die Differenzierung krebsassoziierter Fibroblasten (CAFs) in einer tumormassenähnlichen Umgebung zu untersuchen, die in verschiedenen Analysesystemen wie Immunfluoreszenz, Transkription behandelt werden kann. Analyse und Lebenszellbildung.

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Der vorgestellte Ansatz bewertet gleichzeitig die Krebszellinvasion in 3D-Sphäroid-Assays und t-Zell-Zytotoxizität. Sphäroide werden in einem gerüstfreien Agarose-Multi-Mikrowell-Guss erzeugt. Co-Kultur und Einbettung in Typ I Kollagenmatrix werden innerhalb des gleichen Geräts durchgeführt, das Krebszellinvasion und T-Zell vermittelte Zytotoxizität zu überwachen ermöglicht.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Die Invasion ist ein wichtiges biologisches Phänomen bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs. Dieser Prozess wird durch nicht-neoplastische Zellen und Bestandteile der Tumormikroumgebung beeinflusst. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine alternative Methode zur Analyse der Tumorzellinvasion in vitro mit Hilfe von dreidimensionalen (3D) Kulturen zu beschreiben.

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Erfahren Sie, wie interstitielle Flüssigkeitsströmung die Invasion von Tumorzellen in 3D-Kollagen-Matrigel-Matrizen beeinflusst. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung zellulärer Invasion ohne spezialisierte Pumpen.

Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion

Weitere Videos entdecken