Ein arbeitssparendes und wiederholbares Touch-Force Signaling Mutant Screen Protocol zur Untersuchung der Thigmomorphogenese einer Modellpflanze Arabidopsis thaliana
August 6th, 2019
Eine sanfte Touch-Force-Lademaschine wird aus menschlichen Haarbürsten, Roboterarmen und einem Controller gebaut. Die Haarbürsten werden von Roboterarmen angetrieben, die auf der Maschine installiert sind, und bewegen sich periodisch, um Berührungskraft auf Pflanzen anzuwenden. Die Stärke maschinengetriebener Haarberührungen ist vergleichbar mit der von manuell aufgetragenen Berührungen.
Wir bauen eine automatische Touch-Force-Maschine, um die Pflanzensignalmorphogenese zu beobachten. Die Roboterarme, die ich mit menschlichen Haarbürsten installiert habe, um sanfte Berührungskraft auf Pflanzen anzuwenden. Im Vergleich zur menschlichen Fingerberührung bietet die automatische Mensch-Haar-Touch-Maschine mehr Arbeitsersparnis, eine gleichmäßige Touchkraftbelastung.
Die für eine Kraftladung benötigte Zeit kann innerhalb weniger Minuten begrenzt werden. Im Vergleich zu einer mehrstündigen Fingerberührung und einer Wattestäbchenberührung kann die Robotermaschine die Forschung an der pflanzlichen Kaufverhalten weitgehend verbessern. Durch die Steigerung der Effizienz und der Population der behandelten Anlagen gehen wir davon aus, dass die automatische Touch-Maschine in vier signalierenden Mutantenundbäunern und den Handelsreaktionsstudien sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren angewendet wird.
Testen Sie zunächst die Keimrate jedes Genotyps, nachdem sie sieben Tage lang Samen auf einer 8%agar-Platte mit MS-Medium genährt hat. Nach der Keimrate, bereiten Samen vier- bis fünfmal mehr als die gewünschte Anzahl von Pflanzen produziert werden. Tauchen Sie Samen in kaltes Wasser in 1,5 Milliliter Kunststoffrohre und Decken mit Aluminiumfolie, um im Dunkeln zu halten.
Bei vier Grad Celsius für Samenimbibition aufbewahren. Fünf bis sieben Tage nach der Imbibition den geeigneten Boden für das Pflanzenwachstum auswählen. Vermeiden Sie große Klumpen und verwenden Sie eine Gabel, um sie homogen zu mischen.
Bereiten Sie 24 207 Milliliter Plastikbecher mit einem oberen Felgendurchmesser von 7,4 Zentimetern vor. Bohren Sie drei runde Löcher an der Unterseite der Becher für Bewässerungszwecke. Füllen Sie diese Plastikbecher mit gemischtem Boden.
Lassen Sie den Boden bis zu etwa einem Zentimeter höher als der Becherrand stapeln und verwenden Sie ein Lineal, um die Oberfläche des gestapelten Bodens sanft abzuflachen. 24 Tassen in eine Kunststoffschale geben. Stellen Sie die Lichtintensität der Wachstumskammer zwischen 180 und 240 Mikroeinsteins pro Sekunde pro Quadratmeter ein, was höher ist als die photosynthetische aktive Strahlung für ein schnelles Wachstum der Pflanzen.
Stellen Sie den Lichtzustand auf 24 Stunden konstant ein. Stellen Sie die Temperatur der Wachstumskammer auf 23,5 plus oder minus 1,5 Grad Celsius und eine Luftfeuchtigkeit zwischen 35 und 45 % ein, fügen Sie 2,5 Liter Wasser in jedes Tablett. Lassen Sie den Boden das Wasser aus den Löchern am Boden der Becher absorbieren und warten, bis die Oberfläche des Bodens auf den Becherrandspiegel fällt.
Zwei Stunden später säen Sie drei bis vier Samen zu einem einzigen Fleck und vier gleichmäßig verteilte Stellen innerhalb einer Tasse. Legen Sie eine transparente Kunststoffabdeckung über jedes Tablett und lassen Sie die Samen für eine Woche keimen. Entfernen Sie dann die Abdeckung und lassen Sie sämlinge für eine weitere Woche wachsen.
Pflanzen mit 1,5 LiterWasser jeden zweiten Tag nach dem Keimen der Samen bewässern. Neun bis 10 Tage nach der Aussaat des Samens zusätzliche Triebe durch Ausdünnung entfernen. Verwenden Sie eine kleine Schere, um die Rutschen zu schneiden und vermeiden Sie, die gesamte Pflanze direkt aus dem Boden zu ziehen.
Drei bis vier Pflanzenindividuen ähnlicher Größe in jeder Tasse. Um Touch-Haarbürsten auf die Roboterarme zu installieren, verwenden Sie zuerst Kleber, um eine Schicht menschlichen Haares gleichmäßig auf einem 330 Millimeter langen Stahllineal zu fixieren. Die Länge des Haares beträgt 126 Millimeter.
Mit zwei Metallklemmen, befestigen Sie diese Stahllineale auf den Roboterarmen. Legen Sie im Bedienfeld die Höhe der Maschinenarme entlang der vertikalen Dimension fest, indem Sie Jog F plus drücken, um sie anzuheben, und Jog R minus, um die Roboterarme und Bürsten zu senken. Halten Sie die Spitze der Haarbürsten 5 Zentimeter niedriger als die Tassenfelge.
Drücken Sie die Inc F plus oder R minus, um die Maschine ein bis zwei Zyklen vorzulaufen, um sicherzustellen, dass alle Pflanzenpersonen berührt werden. Verwenden Sie vor dem offiziellen Experiment eine elektronische Waage, um die Berührungskraft zu messen. Passen Sie die Höhe der Maschinenarme an, um die Berührungskraft zwischen ein bis zwei Millinewton nzutellzu halten.
Legen Sie als Nächstes die Startposition der Maschinenarme entlang der horizontalen Bemaßung manuell fest. Lassen Sie die Haarbürsten am Rand jedes Tabletts hängen. Drücken Sie Jog F plus oder Jog R minus, um den Maschinenarm nach und nach horizontal zu bewegen, um sicherzustellen, dass vor Beginn des berührenden Experiments keine Pflanze berührt wird.
Stellen Sie die Reisestrecke der Haarbürste in der horizontalen Dimension auf 365 Millimeter ein, indem Sie die Reisetaste drücken. Drücken Sie Inc F plus oder R minus, um die Maschinenarme zu bewegen, um eine volle Fahrstrecke zu erhalten und sicherzustellen, dass alle behandelten Pflanzen berührt werden. Drücken Sie dann die Auto-Geschwindigkeitstaste, um die Bewegungsgeschwindigkeit entlang der x-Achse der Maschinenarme auf 5000 Millimeter pro Minute einzustellen.
Drücken Sie die Tastentaste für den kleinen Zyklus, um die Touch-Zeit auf 20 Versuche einzustellen, was 40 Berührungen pro Runde entspricht. Stellen Sie das Wiederholungsintervall der Touch-Runde auf 480 Minuten pro Tag ein, indem Sie die Hauptzeittaste drücken, die es Haarbürsten ermöglicht, Pflanzen für drei Runden pro Tag mit einer Intervallzeit von acht Stunden zu berühren. Die Maschine startet automatisch eine neue Touch-Runde, wenn sich der Countdown auf Null dreht.
Stellen Sie den Hauptzyklus auf 12 Versuche ein, damit die Maschine Anlagen für 12 Runden innerhalb von vier Tagen berühren kann. Drücken Sie die Starttaste, um das voreingestellte Programm zu initiieren. Passen Sie die Bürsten und Haarspitzen während der gesamten Berührungszeit jeden Tag auf die gleiche Höhe an und kalibrieren Sie sie.
Um den Bolzentag jeder Pflanze in einem berührenden Experiment zu verfolgen, beobachten Sie jeden Tag den ersten blütenblühenden Stamm jeder Pflanze. Messen Sie die Länge und erfassen Sie die Dauer des Wachstums, wenn es einen Zentimeter erreicht, was bedeutet, dass es von der vegetativen Phase in die Fortpflanzungsphase übergegangen ist. Das Maß für Rosettenradius, fotografieren Sie das ganze Tablett von oben.
Verwenden Sie eine Bildverarbeitungssoftware, um den Abstand vom Rosettenzentrum zur Spitze des längsten Blattes mit dem Becherrand als Lineal zu messen. Um die Rosettefläche zu messen, entfernen Sie zuerst den Blütenstand, ohne den Rest der Rosettenorgane zu beeinträchtigen. Machen Sie Fotos von der Spitze jeder Pflanze zusammen mit einem Maßstab Lineal in der Nähe platziert.
Messen Sie in der Bildverarbeitungssoftware die horizontale zweidimensionale Oberfläche der Rosettenblätter. In diesem Experiment wurde Baumwolle Tupfer manuelle Berührung Behandlung mit maschinell betriebenen Haar-Touch-Behandlung auf Wild-Typ-Steuerung Columbia Null Pflanzen verglichen. Die Verschraubung verzögerte sich 1,7 Tage nach der kontinuierlichen Wattestäbchen-Berührungsbehandlung.
Ebenso wurde bei der maschinell angetriebenen Haarberührung eine verzögerte Verschraubung beobachtet. Die univariate Cox Hazards Analyse zeigt, dass das Verschraubungsrisiko von Pflanzen in der Berührungsgruppe 31% bzw. 52% im Vergleich zu Pflanzen in der Kontrollgruppe beträgt. Diese Verschraubungsverzögerung wurde jedoch bei tDNA-Insertionsmutanten, NKK eins und NKK zwei nicht beobachtet.
Das univariate Cox Proportional Hazards Modell zeigt nur Wildtyp Columbia Zero zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen Kontroll- und Berührungspflanzen mit einem geschätzten HR von 41. Bei morphologischen Veränderungen zeigte die Wildpflanze Columbia Zero nach drei Tagen konstanter und sich wiederholender maschinell gesteuerter Haarberührung deutlich einen deutlich kleineren Rosettenradius und eine kürzere Blattlänge. Die projizierte Rosettefläche wurde nach 13 Tagen Berührung von 20 auf 16 Quadratzentimeter verändert.
Um sicherzustellen, dass die Berührungskraftbelastung nicht zur Verwundung führt, muss die entsprechende Berührungskraft sorgfältig eingestellt werden. Eine Reihe von richtigen Wachstumsbedingungen sind erforderlich, um eine geeignete Arabidopsis-Anlage für Touch-Response-Assay zu produzieren. Zum Beispiel werden 24 Stunden Lichtintensität zwischen 180 und 240 Mikroeinstein pro Quadratmeter pro Sekunde benötigt, um die Signalmorphogenese zu beobachten.
Um sich auf die anderen Formen der mechanischen Kraftbelastung auszudehnen, kann die Maschine auch mit Wassersprühdüse oder Windgebläsen modifiziert werden, um Regen- bzw. Windeffekte in der Zukunft nachzuahmen.
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Überblick
Diese Studie präsentiert eine automatisierte Berührungskraft-Lademaschine, die menschliche Haarbürsten und Roboterarme nutzt, um die Morphogenese von Pflanzensignalen zu erforschen. Das Gerät ermöglicht eine gleichmäßige Anwendung von Berührungskraft auf Pflanzen und steigert die Effizienz im Vergleich zu manuellen Methoden erheblich.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Pflanzensignalisierung und -antwort
- Automatisierung in der biologischen Forschung
- Effiziente Pflanzenbehandlungsmethoden
Hintergrund
- Traditionelle Methoden zur Anwendung von Berührungskräften auf Pflanzen sind arbeitsintensiv und zeitaufwendig.
- Die Entwicklung von Robotersystemen kann die experimentelle Konsistenz und Geschwindigkeit verbessern.
- Diese Studie zielt darauf ab, Pflanzenreaktionen auf mechanische Reize durch Automatisierung zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Entwicklung einer robotergesteuerten Berührungskraftmaschine mit menschlichen Haarbürsten für eine konsistente Kraftanwendung.
- Forschung konzentrierte sich auf Arabidopsis-Pflanzen während ihrer Entwicklungsphasen.
- Technologische Ansätze umfassen automatisierte Berührungszyklen und kontrollierte Umgebungsbedingungen.
Hauptergebnisse
- Das automatisierte System bietet Berührungskräfte, die mit manueller Anwendung vergleichbar sind.
- Effizienzverbesserungen wurden sowohl in der Behandlungszeit als auch in den Pflanzenantwortpopulationen festgestellt.
- Die erfolgreiche Implementierung zeigte Potenzial für breitere Anwendungen in Signalisierungs-Mutant-Screens.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie unterstreicht die Effektivität der Roboterautomatisierung in der Pflanzenphysiologieforschung.
- Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass mechanisierte Berührung die Forschungsprozesse erheblich rationalisieren und bei genetischen und signalisierenden Studien helfen kann.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Automated mechanical stimulation platforms address bottlenecks in phenotypic screening for mechanotransduction pathways, enabling higher throughput and reproducibility in target validation studies. By reducing labor-intensive manual force application, the method supports scalable assessment of genetic mutants in mechanosensitive signaling networks. This positions the technology as a enabling tool for early discovery workflows focused on force-sensing mechanisms in model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of touch-force signaling mutants such as MKK1 and MKK2 to clarify mechanistic roles in mechanotransduction.
- Operational Value: Provides repeatable, quantifiable touch-force application reducing variability from manual handling.
- Predictive Value: Supports phenotypic comparison of wild-type and mutant lines under standardized mechanical stress to de-risk target hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological outputs (e.g., rosette radius, bolting timing) for high-content phenotypic screening.
- Operational Value: Allows unlimited touch rounds with adjustable force strength, enabling dose-response-like experimental designs.
- Assay Readiness: Compatible with alternative touch materials (e.g., animal hair, silk) and environmental simulators (rain, wind) for assay flexibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular mutants to organism-level phenotypic changes under mechanical stress, supporting pathway validation.
- Mechanistic De-risking: Enables statistical evaluation of touch response differences between genotypes, informing target confidence.
- Model Relevance: Uses Arabidopsis thaliana as a genetically tractable system to study conserved mechanosensitive signaling principles.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery pipelines by providing a standardized mechanical stimulus for phenotypic screening of signaling mutants prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of kinase-dependent touch signaling pathways through controlled force application and phenotypic readouts.
- Screening: Enables reproducible, high-throughput touch-force delivery for mutant screening campaigns with measurable growth and developmental outputs.
- Analytics: Facilitates quantitative measurement of bolting delay, rosette area, and leaf length for statistical comparison across genotypes.
- Translational Research: Connects molecular phenotypes (e.g., MKK1/MKK2 mutants) to whole-plant mechanomorphogenic responses, supporting target validation.
- Enterprise Reuse: Platform design allows adaptation to other mechanical stimuli (wind, rain) and model systems, supporting cross-project utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in force-sensing pathways through standardized, repeatable phenotypic assays.
- Operational Value: Increases experimental throughput by reducing touch-force application time from hours to minutes per round.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in target validation by minimizing false positives from manual force variability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanosensitive targets based on reproducible phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant growth conditions, mechanical stimulation protocols, and image-based phenotyping.
- Needs robotic arm system, custom touch-material fixtures, and environmental control chambers for reproducible results.
- Demands standardization of touch force (1–2 mN), timing intervals, and environmental conditions across users and sites.
- Adaptation considerations include exchanging touch materials (hair, silk, cotton) and adding nozzles for rain/wind simulation.
- Practical limitations include dependency on consistent plant size and developmental stage for comparable touch response measurements.
