Name: Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Erfahren Sie eine mikroskopiebasierte Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse von Musterbildung, Zellmorphologie und Genexpression in Pflanzenembryonen.

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Wir danken Dr. Jessica Habashi kritisch Lesen des Manuskripts. Wir danken Dr. Xianyong Sheng des Imaging Center, Hochschule für Life Sciences, Capital Normal University (Beijing, China), für die Durchführung der Lokalisierung des DR5-GLP Assay. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der Beijing Municipal Regierung Science Foundation (CIT &#38; TCD20150102) und von der National Natural Science Foundation of China (31600248).

Hinweis: Dieses Protokoll besteht aus drei Teilen: 1) beobachten die Musterbildung in Wildtyp Arabidopsis Embryonen mit DIC Mikroskopie; (2) Charakterisierung der Embryo Muster Bildung über die Beobachtung der Marker Proteinexpression mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie; und 3) Ermittlung der Rolle eines bestimmten Gens in der Embryogenese (mit den naa10 -Mutanten als Beispiel).
(1) Ovulum Clearing
<ol>
	<li>Vorbereitung des pflanzlichen Materials Hinweis: Die hier beschriebene Protokoll ist ein Beispiel wie man gesunde Pflanzen wachsen; andere Möglichkeiten, um gesunde Pflanzen wachsen auch funktionieren.<ol>
		<li>Ein 1,5 mL-Tube 100 Samen hinzu, und fügen Sie dann 1 mL 1,5 % Natriumhypochlorit (Mix 15 mL 10 % Chlor mit 85 mL Wasser), um den Samen für 5 min. invertieren das Rohr mehrmals sterilisieren, um sicherzustellen, dass die Samen und die Lösung gut gemischt, um die Oberfläche Samen vollständig zu sterilisieren.</li>
		<li>Zwingen Sie die Samen auf den Boden des Rohres durch Zentrifugation für 30 s bei 1.200 x g, den Überstand zu entfernen und waschen die Samen mit sterilem Wasser viermal bei einer Bank, die restlichen Natriumhypochlorit zu entfernen.</li>
		<li>1 Liter Reinstwasser 4,4 g Murashige und Skoog (MS) basale Salzgemisch und 10 g Saccharose hinzufügen. Rühren Sie die Mischung der Salze und Saccharose zu lösen. Die Lösung auf pH 5.8 mit 1 M KOH, passen Sie die MS-Saccharose-Lösung 3 g Geliermittel, wie Phytagel, hinzu, und sterilisieren Sie die Lösung bei 121 ° C für 15 min, MS Medium zu machen.</li>
		<li>Gießen Sie 30 mL des Mediums MS in der 12-cm-Kulturschale MS mittlere Platten zu generieren.</li>
		<li>Legen Sie die sterilisierten Samen auf der MS-Platte. Übertragen Sie die Platte zu einer Kammer, Wachstum und halten Sie die Platte unter langen Tage Bedingungen (22 ° C 16 h im Licht und 18 ° C für 8 h im Dunkeln) nach Samen Schichtung (3 Tage bei 4 ° C im Dunkeln).</li>
		<li>Übertragen Sie nach 8 Tagen des Wachstums die Pflanzen auf Böden (Mischung nährstoffreichen Boden und Vermiculit im Verhältnis 1:1) in einer Schale, das Fach mit einem weißen, transparenten Deckel für 5 Tage, um den Wasserverlust zu vermeiden, und lassen Sie einen Abstand zur Verglasung der Pflanzen zu vermeiden.</li>
		<li>Nehmen Sie den Deckel von der Ablage und pflegen Sie die Pflanzen in einer begehbaren Kammer unter langen Tage Bedingungen (siehe 1.1.5). Schalten Sie das Licht auf 06:00 und ab auf 22:00. Nach ca. 20 Tagen des Wachstums in der begehbaren Kammer werden die Pflanzen geblüht und Siliques produziert haben.</li>
		<li>Die Blütenknospen mit einem Faden an der Position des Samens Stiele in dem Blütenstand um 20:00 Mark (verwenden Sie nicht die erste, die dritte Blütenknospen; die Siliques erzeugt in der Regel von diesen Blütenknospen entwickeln ein paar abgebrochene Samen, und kann dies zu ändern, des Anteils der normal, abnorme Eizellen). Beginn der Befruchtung der Eizelle als zu definieren, wenn die markierten Knospe öffnet um 08:00 am nächsten Morgen zu blühen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung der Hoyer Lösung
	<ol>
		<li>24 g Chloral Hydrate, ein 50-mL-Tube und wickeln Sie das Rohr komplett mit Alu-Folie (Lösungen von Chloral Hydrate sind nicht stabil unter Licht).</li>
		<li>Als nächstes die obige Lösung 9 mL Reinstwasser und 3 mL Glycerin hinzu und schütteln Sie das Rohr Chloral Hydrate zu lösen. Hoyers Lösung zu machen, lassen Sie das Röhrchen über Nacht bei Raumtemperatur, Luftblasen zu beseitigen stehen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ovulum Trennung und Abfertigung
	<ol>
		<li>Legen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen Glas-Objektträger. Legen Sie eine Schote für die gewünschte Anzahl der Tage nach der Bestäubung (DAP) auf der Folie mit der Pseudoseptum senkrecht zur Fläche angebaut; Diese erleichtern die Fruchtblätter (Abbildungen 1A und 1 b) aufgeteilt.</li>
		<li>Die Fruchtblätter auf beiden Seiten der Pseudoseptum mit einer Spritzennadel aufgeteilt und die beiden seziert Fruchtblätter zur Folie so befestigen, dass die Eizellen in der Schote unter ein Stereoskop (Zahlen 1 und 1 D) sichtbar sind.</li>
		<li>Verzichten Sie 70 µL Hoyers Lösung auf den Objektträger zu, und befeuchten Sie die Spitze des feinen Spitzen Pinzette mit Hoyers Lösung durch Eintauchen. Bewegen Sie das Stereoskop mit die Eizellen in der Hoyer-Lösung auf der Folie mit der Pinzette um die Embryonen zu reinigen. Die Folie sanft zu vermeiden, Luftblasen erzeugen zuweisen Sie ein Deckglas.</li>
		<li>Setzen Sie die fertigen Folie in eine Box in einem dunklen Raum für 2 bis 12 h (je reifer ein Ovulum ist, desto mehr Zeit benötigt wird) bei Raumtemperatur. Embryonen im 2/4-Zell-Stadium (1-2 DAP) können mikroskopisch nach 2 h, beobachtet werden, während Embryonen zwischen der Oktant und kugelige Anfangsphase (3 DAP) nach 4 h beobachtet werden können. Reifere Embryonen (4-8 DAP) können nach 12 h beobachtet werden.</li>
		<li>Geräumte Ovula mit der DIC-Funktion eines Mikroskops zu untersuchen. Suchen Sie die Embryonen unter einem Niedrigenergie-Feld (10 X) und ändern Sie dann zu einem Hochleistungs-Feld (100 X Öl Immersion Objektiv) zu das zelluläre Muster in den entwickelten Embryonen zu beobachten.</li>
		<li>Prüfen Sie die Embryonen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterisierung der Embryo Musterung und Zelle Identität über die Beobachtung der Marker Protein-Expression
<ol>
	<li>Vorbereitung von Pflanzenmaterial
	<ol>
		<li>Klonen der Projektträger und Codierung Abfolge von der Marker-gen oder Hormon-Response-Element und dann verschmelzen mit einem fluoreszierenden Protein (z. B. GFP); als nächstes fügen Sie das Konstrukt in der binären Vektor (z. B. pCambia1300). Hier ist die Auxin Response-Element als ein Beispiel10 DR5 präsentiert.</li>
		<li>Die daraus resultierende DR5-GFP -Plasmid in Wildtyp Pflanzen durch Agrobacterium Tumefacienseinführen-vermittelten Umwandlung11. Wählen Sie unter Verwendung der MS mittlere Platten mit Hygromycin T1-Pflanzen (50 mg/mL Mutterlauge, verdünnt 1:1, 000). Die transgenen Pflanzen werden weisen lange Wurzeln und zwei Blätter der Rosette nach 8 Tagen unter den beschriebenen Bedingungen in 1.1.5 Wachstum zu generieren.</li>
		<li>Die transgenen Pflanzen auf Boden übertragen und gemäß 1.1.6 und 1.1.7 kultivieren.</li>
		<li>Sammle die T2-Samen von der unabhängigen T1-Leitungen. Die Saat auf MS-Hygromycin Platten, wählen Sie die Pflanzen tragen eine Kopie der DR5-GFP -Einfügung (das Verhältnis von resistenten Pflanzen zu empfindlichen Pflanzen werden etwa 3:1), und übertragen Sie sie auf den Boden.</li>
		<li>Die T2-Pflanzen zu kultivieren, gemäß 1.1.6 und 1.1.7.</li>
		<li>Die T3-Samen aus den T2-Pflanzen zu sammeln. Die Saat auf MS-Hygromycin Platten, wählen Sie die homozygoten transgenen Pflanzen (alle Pflanzen aus einer einzigen Zeile wird Hygromycin-Resistenz aufweisen), und übertragen Sie sie auf den Boden.</li>
		<li>Markieren Sie die Blütenknospen der homozygoten T3 Pflanzen wie in 1.1.8 angegeben.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP-Signal-Beobachtung
	<ol>
		<li>Mischen Sie 3 mL des Glycerins mit 47 mL Reinstwasser, eine 6 %-Glycerin-Lösung zu generieren.</li>
		<li>Legen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen Glas-Objektträger und beheben Sie eine Schote zu, wie in 1.3.1 angegeben.</li>
		<li>Die Fruchtblätter auf beiden Seiten der Pseudoseptum mit einer Spritzennadel aufgeteilt und die Folie unter ein Stereoskop zwei seziert Fruchtblätter beimessen, gemäß 1.3.2.</li>
		<li>Verzichten Sie 30 µL 6 % Glycerin auf den Objektträger zu, und platzieren Sie alle Ovula aus seziert Fruchtblätter in die Lösung mit einer feinen Spitze Pinzette. Platzieren Sie ein Deckglas vorsichtig auf der Folie.</li>
		<li>Da die Samenschale und Endosperm in jedem Ovulum die Beobachtung der GFP Signale des Embryos verhindern können, entziehen des Embryos das Ovulum. Tippen Sie auf die Folie, schnell und schonend zu den Embryo aus das Ovulum Extrudieren (je reifer ein Ovulum ist, die weniger Kraft auf der Folie angewendet werden sollten).</li>
		<li>Untersuchen Sie die Folie für GFP Fluoreszenz mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie. Finden die isolierte Embryonen unter einem Niedrigenergie-Feld (10 X) und notieren Sie den Speicherort, dann ändern Sie in einem Hochleistungs-Feld (100 X Öl Immersion Objektiv), DR5-GFP Ausdruck in der Embryonen zu beobachten, indem Sie die Erregung Lichtquelle auf 488 nm für die Erkennung des GFP-Signals.</li>
		<li>Erkennen Sie den GFP-Ausdruck in die Embryonen, die geeignete T3-Linie zur weiteren Analyse auszuwählen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterisierung der Embryo Musterbildung in einem Embryo-tödliche Mutant über Ovulum Clearance und Marker Protein Beobachtung: Naa10 als Beispiel
<ol>
	<li>Embryo-Musterung in naa10 mutierte Pflanzen
	<ol>
		<li>Bereiten Sie die pflanzlichen Rohstoffen, wie in 1.1.1-1.1.7 angegeben.</li>
		<li>Identifizieren der naa10+ / − Pflanzen mittels PCR mit Gen-spezifische Primer5, und markieren Sie dann die Blütenknospen der Naa10+ / − Pflanzen wie in 1.1.8 angegeben.</li>
		<li>Ausführen Ovulum Clearance und die mikroskopische Untersuchung von Naa10+ / − Embryonen wie in 1.2 und 1.3 angegeben.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Marker-Protein-Analyse mit naa10 Embryonen
	<ol>
		<li>Erhalten Sie geeignete DR5-GFP transgene Linien in 2.1-2.2 beschriebene Verfahren verwenden.</li>
		<li>Überqueren eine homozygote DR5-GFP transgene Linie mit einem Naa10+ / − Pflanze, Naa10 zu erhalten+ / − Pflanzen, die homozygot für die GLP-Fluoreszenz-Markierung an der F2-Generation (gekennzeichnet durch Gen-spezifische PCR) zur Charakterisierung von naa10+ / −5 und beobachten das GFP-Signal unter dem Mikroskop mit einer homozygot DR5-GFP -Linie.</li>
		<li>Markieren Sie die Blütenknospen der Naa10+ / − Pflanzen, die homozygot für DR5-GFP wie in 2.1.7 angegeben sind.</li>
		<li>Suchen Sie nach den GFP-Signal im naa10 Embryonen, die homozygot für DR5-GFP wie in 2.2 angegeben sind.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li>
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<li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li>
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<li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li>
<li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Ovulum Abstand ist eine nützliche Methode für die Erkennung der Zellteilung und Beurteilung der Morphologie in der Embryogenese in Arabidopsis; mit dieser Technik können Embryonen direkt unter DIC Mikroskopie5,12beobachtet werden. Der entscheidende Schritt zur Abfertigung ein Ovulum ist Schritt 1.3.4. Der Zeitaufwand zur Abfertigung ein Ovulum im Schritt 1.3.4 ist variabel. Embryonen im 2/4-Zell-Stadium können klar nach 2 h in der Hoyer-Lösung beobachtet...

Embryogenese ist das früheste Ereignis höherer Pflanzenentwicklung. Ein Reifen Embryo bildet sich aus einer Zygote durch Zellteilung und Differenzierung unter strengen genetischen Kontrolle1,2. Arabidopsis Embryos sind ein nützliches Modell für die Kontrolle der Morphogenese zu studieren, weil die Reihenfolge der Zellteilungen in der Embryogenese eine erwartete Muster3,4 folgt. Embryo Arabidopsis , enthält ein bis mehreren Zellen ist jedoch zu klein, um beobachtet und analysiert werden. Darüber hinaus kann die Mutation bestimmter Gene Embryo Letalität5, zeigt die wichtige Rolle der Gene in der Embryogenese verursachen. Die Charakterisierung der Musterbildung in der Embryo-letale Mutanten bietet eine Grundlage für das Verständnis der molekularen Mechanismus, wobei wesentlichen Gene, Entwicklung des Embryos regulieren.
Eine detaillierte Methode wird hier für die Charakterisierung der Embryo Musterbildung in der Modellpflanze Arabidopsis durch direkte mikroskopische Beobachtung beschrieben. Die Methode beinhaltet Ovulum Abstand gefolgt von der mikroskopischen Beobachtung eines Embryos. Die Charakterisierung von einem Embryo-tödliche Mutant wird ebenfalls beschrieben.
Die Morphologie der Embryonen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien kann direkt durch Mikroskopie mit den Eizellen die freigemachte mit Hoyers Lösung6,7bestimmt werden. Diese Eizellen weisen einen hohen Brechungsindex. Somit ist das Ovulum clearing-Methode besonders vorteilhaft für Exemplare, die von differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie beachtet werden müssen.
Darüber hinaus können die Gene, die in einer bestimmten Zelle oder eine begrenzte Anzahl von Zellen in der Embryogenese exprimiert werden als Marker verwendet werden, um die Zellen in einem Embryo zu identifizieren. Daher kann die Zelle-Identität-Spezifikation in der Embryogenese durch Überwachung des Ausdrucks der GFP-Tags Markerproteine konfokale Laser-scanning-Mikroskopie mit annotiert werden. Umgekehrt kann beobachten das Expressionsmuster von einer unbekannten funktionale gen -GFP Fusion in der Embryogenese eine Verbindung zwischen Embryo Musterung und der Ausdruck dieses Gens und erleichtern die Identifizierung neuer Gene, die für die Embryogenese in Arabidopsiserforderlich sind.
Die hier beschriebene Methode kann auch verwendet werden, um den Phänotyp der eine Embryo-letale Mutanten zu charakterisieren und die Auswirkungen des betroffenen Gens auf Embryogenese auf zellulärer Ebene zu ermitteln. Darüber hinaus kann die Methode in Kombination mit einem Vergleich der Expressionsmuster von Markergenen in der Embryogenese zwischen Wildtyp und mutierte Pflanzen, Hinweise über die molekularen Mechanismen und Signalwege beteiligt Embryogenese8,9ergeben. In der Tat die Methode auf naa10 Pflanzen angewendet wurde, und festgestellt wurde, dass die abnorme Arbeitsteilung der Hypophyse in den Mutanten durch eine Veränderung der Auxin-Verteilung während der Embryogenese5verursacht werden kann.

<table><tbody><tr><td>Chloralhydrat</td><td>Sigma</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Murashige und Skoog Basalmedium</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumskammer</td><td>Percival</td><td>CU36L5</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss Image M2</td><td>Kamera: AxioCam 506 Farbe</td></tr><tr><td>Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss LSM 5</td><td>Filter: BP 495 - 555 nm</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Axio Zoom V16</td><td>Kamera: AxioCam MRc5</td></tr><tr><td>nährstoffreicher Boden</td><td>KLASMANN, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50-mL Tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5-ml-Röhrchen</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% Natriumhypochloritlösung</td><td></td><td></td><td>Inländisches Analysereagenz</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td></td><td>Inländisches Analysereagenz</td></tr><tr><td>KOH</td><td></td><td></td><td>Haushaltsanalytisches Reagenz</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td></td><td></td><td>Inländisches analytisches Reagenzienkulturschale Inländisches analytisches Reagenzienkulturglas</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Haushaltszubehör</td></tr><tr><td>Vermiculit</td><td></td><td></td><td>Haushaltszubehör</td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td></td><td></td><td>Haushaltszubehör</td></tr><tr><td>Spritzennadel</td><td></td><td></td><td>Haushaltszubehör</td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td></td><td></td> mit feiner Spitze <td>Haushaltszubehör</td></tr><tr><td>Super-Reinbank</td><td></td><td></td> für <td>Haushaltsgeräte Haushaltsgeräte</td></tr></tbody></table>

eine methode zur charakterisierung der embryogenese in arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Angesichts der sehr vorhersehbare Art ihrer Entwicklung, haben Arabidopsis Embryonen als Modell für Studien der Morphogenese in Pflanzen verwendet. Jedoch frühe Werk Embryonen sind klein und enthalten nur wenige Zellen, wodurch sie schwer zu beobachten und zu analysieren. Eine Methode wird hier beschrieben, zur Charakterisierung der Musterbildung im Werk Embryonen unter dem Mikroskop mit Hilfe der Modellorganismus Arabidopsis. Nach der Freigabe von frischen Eizellen mit Hoyer Lösung die Zellzahl in und Morphologie der Embryonen konnten beobachtet werden, und ihre Entwicklungsstufe konnte vom differential Interferenz Kontrast Mikroskopie mit 100 X Öl Immersion Objektiv festgestellt werden. Darüber hinaus war der Ausdruck der spezifischen Markerproteine getaggt mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) überwacht, um Zelle Identität Spezifikation beim Embryo Musterung mit Anmerkungen versehen durch konfokale Laser-scanning-Mikroskopie. Somit kann diese Methode, Musterbildung in Wildtyp Pflanze Embryonen auf zellulärer und molekularer Ebene zu beobachten und um die Rolle bestimmter Gene im Embryo Musterung zu charakterisieren, durch den Vergleich der Musterbildung in Embryonen aus Embryo-letale Mutanten und Wildtyp Pflanzen verwendet werden. Daher kann die Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsisverwendet werden.

In diesem Artikel beschriebene Methode kann verwendet werden, Embryogenese direkt unter dem Mikroskop zu beobachten, kommentieren die Zelle-Identität-Spezifikation in der Embryogenese mit spezifischer Marker und charakterisieren die Rolle eines bestimmten Gens in der Embryogenese.
Repräsentative Ergebnisse aus der Analyse des Embryos (von der länglichen Zygote-Bühne auf der walking-Stick Reifestadium) in Wildtyp Arabidopsis<...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beobachtung der Embryogenese in Arabidopsis über Ovulum Abstand gefolgt von der Inspektion der Embryo Musterbildung unter dem Mikroskop.

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, die Musterbildung von Embryonen während der pflanzlichen Embryogenese unter Verwendung des Modellorganismus zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Pflanzenforschung zu beantworten, beispielsweise zur Embryogenese in Arabidopsis. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Embryomusterbildung in der Modellpflanze Arabidopsis durch die empfohlene Vorgehensweise charakterisiert werden kann.Den Ablauf demonstriert Jinlin Feng, eine Doktorandin aus meinem Labor. Um mit dem Verfahren zu beginnen, geben Sie 100 Samen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie ein Milliliter Natriumhypochlorit hinzu, um die Samen zu sterilisieren.Drehen Sie das Gefäß mehrmals um, um sicherzustellen, dass die Samen und die Lösung gut vermischt sind. Nach fünf Minuten zentrifugieren Sie das Gefäß bei 1200 Gs für 30 Sekunden. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Samen viermal mit steriler Wasser, um eventuell verbliebenes Natriumhypochlorit zu entfernen.Fügen Sie anschließend 4,4 Gramm MS-Basalsalzgemisch und 10 Gramm Saccharose zu einem Liter ultrareinem Wasser hinzu. Rühren Sie, bis das Salz und die Saccharose vollständig gelöst sind. Stellen Sie mit Hilfe von Kaliumhydroxid (1 mol) den pH-Wert der Lösung auf 5,8 ein.Gegeben Sie dann drei Gramm Geliermittel hinzu und sterilisieren Sie die Lösung bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Gießen Sie 30 Milliliter des resultierenden MS-Mediums in eine 12 cm große Kulturschale. Legen Sie die sterilisierten Samen auf die MS-Platte.Überführen Sie die Platte in einen Kühlschrank und lagern Sie sie drei Tage lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln, um die Samen zu stratifizieren. Danach halten Sie die Platte acht Tage lang in einer Wachstumskammer unter Langtagbedingungen. Anschließend überführen Sie die Pflanzen in eine Schale mit Erde.Bedecken Sie die Schale mit einem durchsichtigen weißen Deckel, um Wasserverlust zu verhindern. Lassen Sie eine kleine Lücke, um eine Verglasung der Pflanzen zu vermeiden. Entfernen Sie nach fünf Tagen den Deckel und kultivieren Sie die Pflanzen in einer Begehbar-Kammer unter Langtagbedingungen.Nach etwa 20 Tagen Wachstum mit einem Faden 10 bis 15 Blütenknospen an der Position der Samenstiele und des Blütenstandes um 20:00 Uhr markieren. Den Beginn der Befruchtung des Samenanlage definieren, wenn sich die markierten Knospen am nächsten Morgen um 8:00 Uhr zur Blüte öffnen. Um mit der Vorbereitung der Hoyer-Lösung zu beginnen, 24 Gramm Chlorhydrat in ein 50-Milliliter-Gefäß geben. Das Gefäß vollständig mit Aluminiumfolie umwickeln und sicherstellen, dass die Folie das gesamte Licht abschirmt.Geben Sie neun Milliliter ultrareines Wasser und drei Milliliter Glycerin hinzu. Schütteln Sie das Gefäß, um das Chlorhydrat aufzulösen. Anschließend lassen Sie die hergestellte Hoyer-Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehen, um eventuelle Bläschen zu entfernen.Befestigen Sie zunächst ein Stück doppelseitiges Klebeband an einem mikroskopischen Objektträger. Legen Sie eine Schote, die die gewünschte Anzahl an Tagen nach der Bestäubung gewachsen ist, so auf, dass das Pseudoseptum senkrecht zur Oberfläche steht. Teilen Sie mit einer Spritzennadel die Fruchtblätter auf beiden Seiten des Pseudoseptums.Befestigen Sie anschließend die beiden präparierten Fruchtknoten auf dem Objektträger, sodass die Samenanlagen und die Schote unter dem Stereomikroskop sichtbar sind. Geben Sie 70 Mikroliter Hoyer’sche Lösung auf den Objektträger. Tauchen Sie dann ein Paar feine Pinzette in die Lösung, um die Spitze anzufeuchten.Unter Verwendung des Stereomikroskops und einer Pinzette die Samenanlagen in die Hoyer-Lösung überführen, um die Embryonen zu reinigen. Danach vorsichtig ein Deckglas auf den Objektträger auflegen und sicherstellen, dass keine Blasen entstehen. Den fertigen Objektträger für zwei bis zwölf Stunden bei Raumtemperatur in eine Box in einem dunklen Raum stellen.Nachdem die erforderliche Zeit verstrichen ist, verwenden Sie die DIC-Funktion des Mikroskops, um die geklärten Samenanlagen zu untersuchen. Suchen Sie die Embryonen im Niedrigvergrößerungsbereich und wechseln Sie dann zum Hochleistungsobjektiv, um das zelluläre Muster in den entwickelten Embryonen zu beobachten. Untersuchen Sie anschließend die Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien.Bereiten Sie zunächst das DR5 GFP-Plasmid vor und führen Sie es mittels Agrobakterium-vermittelter Transformation in Wildtyp-Pflanzen ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Selektieren Sie die T1-Pflanzen mithilfe von MS-Medium-Platten, die Hydrolysin enthalten. Überführen und kultivieren Sie anschließend die Pflanzen gemäß dem Textprotokoll, um T3-Pflanzen zu erhalten.Markieren Sie mithilfe eines Fadens die Blütenknospen der homozygoten T3-Pflanze am Standort der Samenstiele am Blütenstand um 20:00 Uhr. Danach mischen Sie drei Milliliter Glycerin mit 47 Millilitern ultrareinem Wasser, um eine 6 %ige Glycerinlösung herzustellen. Befestigen Sie anschließend ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einem Objektträger. Legen Sie eine Schote der T3-Pflanze mit dem Pseudoseptum senkrecht zur Oberfläche auf den Objektträger.Spalten Sie mit einer Spritzennadel die Karpellen auf beiden Seiten des Pseudoseptums. Befestigen Sie die beiden präparierten Karpellen auf dem Objektträger, sodass die Samenanlagen und die Schote unter dem Stereomikroskop sichtbar sind. Geben Sie anschließend 30 Mikroliter 6 % Glycerin auf den Objektträger.Tauchen Sie ein Paar feine Pinzette in die Lösung, um die Spitze anzufeuchten. Bewegen Sie mit Hilfe des Stereomikroskops und der Pinzette die Samenanlagen in die Glycerinlösung. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf die Probe. Danach tippen Sie schnell und vorsichtig auf den Objektträger, um das Embryo aus der Samenanlage herauszudrücken. Verwenden Sie danach die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie, um den Objektträger auf grünes Fluoreszenzprotein zu untersuchen. Suchen Sie die isolierten Embryonen im schwachen Vergrößerungsbereich und notieren Sie deren Position.Wechseln Sie zu einem hochvergrößernden Objektivfeld und stellen Sie die Anregungslichtquelle auf 488 Nanometer ein, um die GR5-GFP-Expression in den Embryonen zu beobachten. Anschließend detektieren Sie die GFP-Expression und charakterisieren Sie die Musterbildung der Embryonen gemäß dem schriftlichen Protokoll. In dieser Studie wird die Embryogenese bei Arabidopsis über eine Samenanlagenklarstellung beobachtet, wie zu sehen ist.Nach der Befruchtungskammerreinigung sind die Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien mittels differentieller Interferenzkontrastmikroskopie unterscheidbar. Das Expressionsmuster von GR5 GFP während der Embryogenese wird anschließend mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie aufgezeichnet. DR5 zeigt sich in der Wurzelpole der globulären und herzförmigen Wildtyp-Embryonen exprimiert.DR5 wird an den Spitzen der embryonalen Keimblätter sowie im Gefäßsystem ausgereifter Wildtyp-Embryonen exprimiert. Danach wird die Rolle von naa10 in Arabidopsis während der Embryogenese untersucht. Die beobachtete Hypothese zeigt eine abnormale Teilung, mit schräger und vertikaler Teilung in naa10 im Vergleich zur transversen asymmetrischen Teilung in Wildtyp-Pflanzen.Wie hier zu sehen ist, weist oxen in den meisten naa10-Embryonen im globulären Stadium eine nahezu gleichmäßige Verteilung auf und zeigt im Vergleich zu Wildtyp-Embryonen ein breiteres Signal in den Hypothesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass naa10 für die Embryogenese erforderlich ist und möglicherweise über den oxen-Signalweg in Arabidopsis beteiligt ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, wie Arabidopsis als Pflanzenmaterial kultiviert wird.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die In-situ-Hybridisierung angewendet werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich der Expression zellspezifischer Gene zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Embryogenese den Weg, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, durch die spezifische Gene die Embryogenese in Arabidopsis vermitteln. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Embryogenese in Arabidopsis charakterisieren kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschreiben ein Protokoll mit Kammer-Objektträgern und Medien zu pflanzen Keimblätter für die konfokale Bildgebung der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung immobilisieren, zu dokumentieren stomatal Differenzierung. Fluorophor-markierte Proteine ​​können dynamisch durch Expression und subzelluläre Lokalisation verfolgt werden, das Verständnis ihrer möglichen Rollen bei der Zellteilung und Zelltyp-Differenzierung.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Wir berichten über eine effiziente und einfache Methode, um Embryonen in frühen Stadien der Entwicklung Isolat...

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Wir präsentieren die Prozedur, um eine Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer) aus Arabidopsis thaliana Samen zusammenzubauen. Der Pressluftatmer wurde gezeigt, dass ein leistungsfähiges Werkzeug, um genetisch und in vitro zu erforschen, wie die Kontrollen Endosperm die Keimung der Samen in ruhenden Samen und in Reaktion auf Licht Cues. Das Atemschutzgerät ist prinzipiell anwendbar unter jeder Situation, in der Mehlkörper wird vermutet, um embryonale Wachstum beeinflussen.

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden<em&gt; In-vitro-</em&gt; Wie das Endosperm Kontrollen Keimung der Samen in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

Das Ziel ist es, zu veranschaulichen, dass das Modell-Legumino Medicago truncatula leicht verwendet werden kann, um die Regulation der frühen Pflanzenembryogenese zu untersuchen, um das Nicht-Leguminosen-Modell von Arabidopsis zu ergänzen. Die Pod-Morphologie ist mit den Stadien der zygotischen Embryogenese verknüpft, und es wird auch ein Protokoll zur Entnahme von Embryonen mittels Gewebekultur zur Verfügung gestellt.

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