Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Musterbildung von Embryonen während der pflanzlichen Embryogenese mit Hilfe des Modellorganismus zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Pflanzensubstanz zu beantworten, wie z.B. die Embryogenese bei Arabidopsis. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Embryonalmusterbildung in der Modellpflanze Arabidopsis durch die empfohlene Operation charakterisiert werden kann.

Das Verfahren wird von Jinlin Feng, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Um diesen Vorgang zu starten, gib 100 Samen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Füge einen Milliliter Natriumhypochlorit hinzu, um die Samen zu sterilisieren.

Drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um sicherzustellen, dass das Saatgut und die Lösung gut vermischt sind. Nach fünf Minuten zentrifugieren Sie das Röhrchen 30 Sekunden lang bei 1200 g. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Samen viermal mit sterilem Wasser, um alle Reste von Natriumhypochlorit zu entfernen.

Als nächstes fügen Sie 4,4 Gramm MS-Basalsalzmischung und 10 Gramm Saccharose zu einem Liter Reinstwasser hinzu. Rühren, um das Salz und die Saccharose aufzulösen. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit Kaliumhydroxid in einer Dosis von einem mol auf 5,8 ein.

Fügen Sie dann drei Gramm Geliermittel hinzu und sterilisieren Sie die Lösung 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius. Gießen Sie 30 Milliliter des resultierenden MS-Mediums in eine 12 Zentimeter große Kulturschale. Legen Sie die sterilisierten Samen auf die MS-Platte.

Stellen Sie die Platte in den Kühlschrank und halten Sie sie drei Tage lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln, um die Samen zu schichten. Bewahren Sie die Platte anschließend acht Tage lang unter Langzeitbedingungen in einer Wachstumskammer auf. Setze die Pflanzen dann in einer Schale in Erde um.

Decken Sie das Tablett mit einem transparenten weißen Deckel ab, um Wasserverlust zu vermeiden. Lassen Sie einen kleinen Spalt, um eine Verglasung der Pflanzen zu vermeiden. Nach fünf Tagen nimmst Du den Deckel ab und kultivierst die Pflanzen in einer begehbaren Kammer unter Langzeitbedingungen.

Nach etwa 20 Tagen Wachstum markierst Du mit einem Faden 10 bis 15 Blütenknospen an der Position der Samenstiele und des Blütenstandes um 20:00 Uhr. Definiere den Beginn der Bestäubung der Eizelle, wenn sich die markierten Knospen zur Blüte öffnen, als 8:00 Uhr am nächsten Morgen. Um mit der Zubereitung der Hoyer-Lösung zu beginnen, geben Sie 24 Gramm Chlorhydrat in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Wickeln Sie das Rohr vollständig in Alufolie ein und achten Sie darauf, dass die Folie jegliches Licht abdichtet.

Fügen Sie neun Milliliter ultrareines Wasser und drei Milliliter Glycerin hinzu. Schütteln Sie die Tube, um das Chlorhydrat aufzulösen. Lassen Sie die vorbereitete Hoyer-Lösung dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen, um Blasen zu entfernen.

Befestigen Sie zunächst ein Stück doppelseitiges Klebeband an einem Objektträger aus Mikroskop. Legen Sie eine Silique, die für die gewünschte Anzahl von Tagen nach der Bestäubung gewachsen ist, auf die Seite mit dem Pseudoseptum senkrecht zur Oberfläche. Spalten Sie mit einer Spritzennadel die Handwurzeln auf beiden Seiten des Pseudoseptums.

Befestigen Sie als Nächstes die beiden präparierten Handwurzeln an dem Objektträger, so dass die Eizellen und die Silique unter einem Stereoskop sichtbar sind. Geben Sie 70 Mikroliter Hoyer's Lösung auf den Objektträger. Tauche dann eine Pinzette mit feiner Spitze in die Lösung, um die Spitze zu befeuchten.

Bewegen Sie die Eizellen mit dem Stereoskop und der Pinzette in die Hoyer-Lösung, um die Embryonen zu reinigen. Bringen Sie danach vorsichtig einen Deckglas auf die Folie an und achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen. Legen Sie die fertige Folie für zwei bis 12 Stunden bei Raumtemperatur in eine Schachtel in einem dunklen Raum.

Nachdem die notwendige Zeit verstrichen ist, verwenden Sie die DIC-Funktion des Mikroskops, um die gereinigten Eizellen zu untersuchen. Lokalisieren Sie die Embryonen unter einem Feld mit geringer Leistung und wechseln Sie dann zu einem Feld mit hoher Leistung, um das Zellmuster in den entwickelten Embryonen zu beobachten. Untersuchen Sie dann die Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien.

Bereiten Sie zunächst das DR5-GFP-Plasmid vor und führen Sie es durch Agrobacterium in die Wildtyp-Pflanzen ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Selektieren Sie die T1-Pflanzen mit hydrolysinhaltigen MS-Mediumplatten. Übertragen und kultivieren Sie dann die Pflanzen, wie im Textprotokoll beschrieben, um T3-Pflanzen zu erhalten.

Markieren Sie mit einem Faden die Blütenknospen der homozygoten T3-Pflanze an der Position der Samenstiele am Blütenstand um 20:00 Uhr. Mischen Sie danach drei Milliliter Glycerin mit 47 Millilitern Reinstwasser, um eine 6%ige Glycerinlösung zu erhalten. Befestigen Sie dann ein Stück doppelseitiges Klebeband an einem Objektträger aus Mikroskop. Lege die Silique einer T3-Pflanze mit dem Pseudoseptum senkrecht zur Oberfläche auf den Objektträger.

Spalten Sie mit einer Spritzennadel die Handwurzeln auf beiden Seiten des Pseudoseptums. Befestigen Sie die beiden präparierten Handwurzeln so an der Objektträger, dass die Samenanlagen und die Silique unter einem Stereoskop sichtbar sind. Geben Sie anschließend 30 Mikroliter 6%iges Glycerin auf den Objektträger.

Tauche eine Pinzette mit feiner Spitze in die Lösung, um die Spitze zu befeuchten. Bewegen Sie die Eizellen mit dem Stereoskop und der Pinzette in die Glycerinlösung. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf die Folie.

Tippen Sie dann schnell und vorsichtig auf den Objektträger, um den Embryo aus der Eizelle zu extrudieren. Danach untersuchen Sie den Objektträger mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie auf grün fluoreszierende Proteinfluoreszenz. Finden Sie die isolierten Embryonen unter einem Feld mit geringer Leistung und notieren Sie ihre Position.

Wechseln Sie zu einem Hochleistungsfeld und stellen Sie die Anregungslichtquelle auf 488 Nanometer ein, um die GR5-GFP-Expression in den Embryonen zu beobachten. Erkennen Sie dann die GFP-Expression und charakterisieren Sie die Bildung des Embryomusters, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wird die Embryogenese bei Arabidopsis über die Clearance der Eizellen beobachtet, wie zu sehen ist.

Nach der Beseitigung der Eizellen können die Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien mit Hilfe der differentiellen Interferenzkontrastmikroskopie unterschieden werden. Das Expressionsmuster von GR5 GFP während der Embryogenese wird dann unter konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie aufgezeichnet. Es wird gesehen, dass DR5 im Wurzelpol der kugelförmigen und herzförmigen Embryonen des Wildtyps exprimiert wird.

DR5 wird in den embryonalen Keimblattspitzen und im Gefäßsystem reifer Wildtyp-Embryonen exprimiert. Danach wird die Rolle von naa10 in Arabidopsis während der Embryogenese untersucht. Die Hypothese erwies sich als abnormal geteilt, mit schiefer und vertikaler Teilung bei naa10 im Vergleich zur quer verlaufenden asymmetrischen Teilung bei Wildtyp-Pflanzen.

Wie hier zu sehen ist, hat der Ochse in den meisten naa10-Embryonen im kugelförmigen Stadium eine nahezu gleichmäßige Verteilung und behält in den Hypothesen im Vergleich zu den Wildtyp-Embryonen ein breiteres Signal bei. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass naa10 für die Embryogenese benötigt wird und dass es über den Ochsen-Signalweg in Arabidopsis induziert werden könnte. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, wie man Arabidopsis als Pflanzenmaterial anbaut.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Maßnahmen wie z.B. die in-situ-Hybridisierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Expression zellspezifischer Gene zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Embryogenese, um den molekularen Mechanismus zu erforschen, durch den bestimmte Gene die Embryogenese in Arabidopsis vermitteln. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Embryogenese in Arabidopsis charakterisiert.