Standardisierte Methode für Hochdurchsatz-Sterilisation von Arabidopsis Samen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, standardisierte Bedingungen für eine erfolgreiche Saatgutsterilisation einer großen Anzahl von Arabidopsis-Genotypen zu schaffen und gleichzeitig das mikrobielle Wachstum zu verhindern. Diese Methode ermöglicht es Ihnen, Hunderte von Saatgutproben gleichzeitig zu sterilisieren und so einen kritischen Schritt bei der Vorbereitung von Pflanzenmaterial in den Bereichen Genomik, Proteomik, Metabolomik und anderen Hochdurchsatzstudien zu vereinfachen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Bedingungen bietet, unter denen eine effiziente Sterilisation mit einer hohen Keimrate für eine große Anzahl von Saatgutproben kombiniert wird.

Bereiten Sie zunächst eine 50%ige Bleichlösung mit destilliertem Wasser vor. Füge zu je 200 Millilitern Bleichlösung 50 Mikroliter TWEEN 20 Waschmittel hinzu. Die Bleichlösung kann bis zu einem Monat gelagert werden, solange sie nur unter sterilen Bedingungen geöffnet wird.

Als nächstes aliquotieren Sie 100 Samen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Dies kann manuell oder mit Hilfe eines speziell angefertigten Säroboters erfolgen. Geben Sie nun in einer Laminar-Flow-Haube 500 Mikroliter der 50%igen Bleichlösung zu den Samen.

Übertragen Sie dann die Röhrchen in einen Rotator und inkubieren Sie die Samen 10 Minuten lang unter leichtem Rühren im Bleichmittel. Saugen Sie nach 10 Minuten die Bleichlösung aus den Röhrchen ab und entfernen Sie so viel wie möglich. Fügen Sie dann 500 Mikroliter steriles destilliertes Wasser hinzu und drehen Sie die Röhrchen um, um sie zu mischen.

Lassen Sie die Samen absetzen, saugen Sie dann das Wasser ab und ersetzen Sie es durch ein anderes Aliquot, um die Samen erneut zu waschen. Führen Sie insgesamt sechs solcher Wäschen mit sterilisiertem destilliertem Wasser durch. Sobald die Samen gründlich mit Wasser gewaschen wurden, suspendieren Sie sie in einem Milliliter Wasser, bevor Sie sie anrichten.

Berechnen Sie vor Beginn des Sterilisationsprozesses die Mengen an Bleichmittel und Salzsäure, die zur Herstellung von Chlorgas erforderlich sind. Verwenden Sie die angegebene Gleichung, um das empfohlene Chlorgas von 6 % zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass Sie das HCl-Volumen genau berechnen, das erforderlich ist, um eine erfolgreiche Sterilisation zu gewährleisten und Spritzer zu vermeiden.

Achten Sie darauf, während dieses Protokolls Handschuhe und einen Laborkittel zu tragen, und wechseln Sie die Handschuhe, wenn sie mit Säure oder Bleichmittel benetzt werden. Schieben Sie die Samenfläschchen unter einem Abzug mit offenem Deckel in ein Gitter. Stellen Sie dann das Gestell in einen Kunststoffbehälter, in dem die Sterilisation stattfinden kann, und bereiten Sie Paraffinfolienstreifen vor, um den Deckel mit dem Behälter abzudichten.

Befülle nun das Becherglas mit 100 Millilitern Bleiche und setze dann ein 250-Milliliter-Becherglas hinein. Die Verwendung eines Überschusses an Bleichmittel ist ein Sicherheitsmerkmal und das Becherglas sollte mindestens das doppelte Volumen der darin enthaltenen Lösung haben. Gehen Sie auch immer getrennt mit dem Bleichmittel und den Säuren um.

Geben Sie dann drei Milliliter Salzsäure in das Becherglas, verschließen Sie dann sofort den Behälter und verschließen Sie ihn mit Parafilm. Überwachen Sie den Behälter eine Stunde lang, um sicherzustellen, dass sich das Gas während der Sterilisation ansammelt. Chlorgas sollte entweder als schwacher gelber Schleier im Inneren des Behälters sichtbar sein oder die Lösung kann auf Gelbfärbung überprüft werden.

Überprüfen Sie regelmäßig die Dichtung am Behälter. Wenn sich der Deckel löst oder sich die Paraffindichtung zu lösen beginnt, verschließen Sie den Deckel wieder fest mit einer zusätzlichen Schicht Paraffinfolie. Öffnen Sie nach der einstündigen Sterilisation eine Ecke des Behälters, um das Gas über einen Zeitraum von drei Stunden abzulassen.

Verschließen Sie nach drei Stunden Entlüftung alle Röhrchen und lagern Sie die sterilisierten Samen unter trockenen Bedingungen, bis sie plattiert sind. Neutralisieren Sie nun die Reaktion, indem Sie langsam 1,5 Gramm Natriumbicarbonatpulver hinzufügen und dabei mit einem Glasstab umrühren, um die Feststoffe aufzulösen. Fügen Sie so lange Natriumbicarbonat hinzu, bis sich die Kohlendioxid-Gasblasen nicht mehr bilden.

Messen Sie dann den pH-Wert der Lösung und fügen Sie bei Bedarf zusätzliches Natriumbicarbonat hinzu, bis der pH-Wert neutral ist. Sofern die Lösung nicht stinkt, kann sie entsorgt werden. Andernfalls warten Sie, bis sich alle Gerüche verflüchtigt haben.

Geben Sie 500 Mikroliter sterilisiertes destilliertes Wasser in jedes Röhrchen mit gassterilisiertem Saatgut. Gießen Sie dann die Samen auf eine MS-Platte und verteilen Sie sie gleichmäßig mit einer sterilen Einweg-Impfschlaufe oder einer sterilen Pipettenspitze. Nach drei Tagen Samenschichtung bei vier Grad Celsius werden die Platten auf 23 Grad Celsius mit 16 Stunden täglicher Lichteinwirkung übertragen.

Halten Sie die Deckel oben, so dass die Wurzeln in das Medium hineinwachsen. Nach acht Tagen Wachstum bewerte Du den Anteil der Samen, die gekeimt sind. Die Keimung wird gezählt, wenn das Radikal aus der Samenschale herausragt und die beiden Keimblätter sichtbar sind.

Zählen Sie auch die Anzahl der von Schimmel befallenen Samen, um die Wirksamkeit der Sterilisationsbedingungen zu bestimmen. Vier verschiedene Konzentrationen von Bleichmittel bei fünf verschiedenen Expositionszeiten wurden an Columbia-Wildtyp-Saatgut getestet. Hohe Bleichkonzentrationen beeinträchtigten die Keimung bei zu viel Exposition.

Es wurden jedoch hohe Keimraten mit 40 und 50 % Bleiche zu allen Expositionszeiten beobachtet. Saatgut, das mit hohen Bleichkonzentrationen sterilisiert wurde, hatte eine hohe Mortalität und wies oft Wachstumsfehler auf, war aber in der Regel völlig schimmelfrei. Es wurde festgestellt, dass die Sterilisation mit 50 % Bleiche für 10 Minuten das optimale Gleichgewicht zwischen Schimmelpilzhemmung und gesunder Keimung aufweist.

Um die Bedingungen für die Sterilisation von Chlorgas zu optimieren, wurden drei verschiedene Konzentrationen von Chlorgas verwendet, um Columbia-Wildtyp-Saatgut über zwei verschiedene Zeiträume zu sterilisieren. Es gab eine signifikante Wechselwirkung zwischen Zeit und Gaskonzentration. Nach einer Stunde gab es keine Auswirkungen auf die Keimung, während die höchste Gaskonzentration nach drei Stunden nachteilig war.

Daher wurde eine einstündige Sterilisationszeit gewählt. Das Schimmelwachstum wurde wirksam durch dreistündige Gasexpositionen oder durch einstündige Expositionen mit sechs oder 17 % Gas gehemmt. So wurde eine Gaskonzentration von 6 % für eine Stunde als optimal für die Keimung und Schimmelpilzhemmung bestimmt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um Hunderte von Samenlinien pro Tag erfolgreich zu sterilisieren, wenn sie richtig durchgeführt wird. Gassterilisiertes Saatgut kann auch über einen längeren Zeitraum unter trockenen Bedingungen gelagert werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die bereitgestellten Gleichungen zu verwenden, um die erforderlichen Mengen an HCl und Bleiche zu berechnen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie genomweite Assoziationsstudien durchgeführt werden, um eine Vielzahl verschiedener Genotypen und die interessierenden Phänotypen zu verknüpfen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.