Name: Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Erfahren Sie, wie Fluoreszenz-Mikroskopie und Next-Generation-Sequencing zur Identifizierung von Genen für die Integrität pflanzlicher Organellen eingesetzt werden. Diese Methode nutzt Mutagenese und bildgebende Verfahren.

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Wir danken für die Unterstützung von der Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (Vergabe-Nummer DE-FG02-91ER20021) und der National Science Foundation (MCB 0948584) (FB). Wir sind dankbar, dass Frau Karen Vogel für die Bearbeitung des Manuskripts.

1. EMS-Behandlung Arabidopsis thaliana Samen werden mit mutagenisiert als Mutagen Ethylmethansulfonat Mittel (EMS) 3,4, die in das Genom C-zu-T-Änderungen, die sich in C / G, T / A-Mutationen 5-7 induziert. <ol><li> 0,8 g wiegen Arabidopsis Samen (~ 40.000 Samen), die den fluoreszierenden Marker Organellen (insbesondere die in dieser Studie ssGFPHDEL (Signalsequenz-GFP-Tetrapeptid HDEL) wurde als ein ER-Marker verwendet wurden). </li><li> Übertragen Sie die Samen in einem 50-ml-Falcon-Röhrchen, dann 25 ml destilliertem Wasser. </li><li> 0,2% (v / v) Ethylmethansulfonat. </li><li> Inkubieren Sie für 16 Stunden auf Taumelmischer bei niedrigen Drehzahlen. </li><li> Absaugen der Flüssigkeit und verwerfen in einen Kolben mit 1,0 M NaOH, um den EMS zu inaktivieren. </li><li> 25 ml Wasser auf das Falcon-Röhrchen mit den Samen, in der Nähe, und 5 Mal umdrehen, um die Samen zu waschen; warten, bis alle Samen niedergelassen haben, dann saugen das Wasser und in der 1,0 M Na verwerfen<html> OH-Kolben. </li><li> Wiederholen der Wasch-Schritt bis zu 10 mal. </li><li> Nach dem letzten Waschen, erneut zu suspendieren die Samen in einer minimalen Menge Wasser. </li><li> Gehen Sie zur Sterilisation Samen Zugabe von 25 ml 10% Bleichmittel, kräftig schütteln, 30 s. Lassen Samen zu Boden absetzen, dann abgießen Bleichmittel und spülen mit 25 ml sterilem Wasser. Abgießen, sterilem Wasser und 25 ml 70% Ethanol. Schütteln Röhrchen für 30 s. Lassen Samen zu Boden absetzen. Abgießen und Ethanol spülen mit 25 ml sterilem Wasser. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal mit sterilem Wasser, dann gießen Samen auf einer Kunststoff-Petrischale mit 3 MM Filterpapier und lassen unter der Haube trocknen. Lagerung bei 4 ° C für 2 Tage. </li><li> Tafel die Samen auf S MS Phytagel (halbe Konzentration von Murashige und Skoog-Medium), 150-mm-Petrischale (~ 250-300 Samen für die Platte). </li><li> Wachsen M1 Samen auf Platte für 2 Wochen, dann in den Boden zu verpflanzen. </li><li> Sammle M2 Samen von einzelnen Pflanzen M1 bis M2 Linien (1000 unabhängige Linien) zu generieren. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 2. Konfokale Screening von M2 und M3 Populationen In diesem Abschnitt beschreiben wir die Beobachtung von Sämlingen mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop oder wie oben beschrieben 8. <ol><li> Sechzig Samen aus jeder Linie M2 sind für 7 bis 10 Tagen auf Kunststoff-Petrischalen, ½ MS Phytagel gewachsen, auf der gleichen Platte sind auch 5 Sämlinge gewachsen EMS-unbehandelten (Kontrolle). </li><li> Fünf bis zehn Cotyledonen mit der unterseitigen Seite in Richtung der Linse (40X) auf einem Objektträger montiert und mit einem Deckglas eingeschlossen. </li><li> Jedes Keimblatt beobachtet wird, von der kortikalen zu medialen Bereich, unter Fluoreszenz für jede veränderte subzelluläre Verteilung der Organellen-Marker. </li><li> Positiv Pflanzen werden in Erde und ihre Samen werden gesammelt und erneut, um den mutierten Phänotyp in der M3-Generation bestätigen gescreent. </li><li> Entfernen Sie die verunreinigende Hintergrund Mutationen durch Rückkreuzung mindestens dreimal zu einem Wildtyp-Genom gegebenenfalls COntaining die gewünschte Organelle fluoreszierenden Marker. <ol><li> Von der Mutterpflanze, mit einer feinen Schere oder Zange entfernen reifen Schoten und offenen Blüten. </li><li> Entfernen Sie die Knospen, die zu klein sind aus dem Meristem. </li><li> Legen Sie die Spitze von einem Pinzette zwischen Kelch-und Blütenblätter auf eine Knospe öffnen und entfernen Sie alle Antheren. </li><li> Mit einem Zange nehmen eine offene reifen Blume aus dem Vater-Anlage und reiben Sie die Antheren auf die Narbe der Pflanze entmannt. </li></ol></li></ol> 3. Mapping Dieser Abschnitt beschreibt, wie man Wesentlichen eine rezessive Mutation unter Verwendung eines modifizierten Protokolls von Borevitz 9 schneller, wenn die traditionellen Mapping-Verfahren im Vergleich 10,11 abzubilden. Dieser Ansatz verwenden high-density Oligonukleotid-Arrays mit der Fähigkeit, zahlreiche Einzel-Merkmal-Polymorphismen (SFP) in einem einzigen Assay 12 zu erfassen. Mit dem Affymetrix GeneChip Arabidopsis ATH1 Array ist möglich,analysieren rund 24.000 Gene. Ein Pool von F 2-Individuen, welche die Mutation wird auf einen Pool von Wildtyp-F 2-Pflanzen innerhalb der gleichen Trennung Bevölkerung gesammelt verglichen. Dann wird die Mutation in dem Bereich, wo die Mutanten-Pool für mutierten Genotyp Allele angereichert zugeordnet wird, und folglich in der gleichen Region der Wildtyp-Pool wird führen angereichert für die Wildtyp-Eltern-Allele 13. <ol><li> Genomische DNA (3 ug) von der Columbia homozygoten mutanten (M3) unter Verwendung eines Qiagen DNeasy Plant Mini Kit extrahiert und für Illumina Genome Analyzer II (GA II) 14 Sequenzierung unterzogen. </li><li> Der homozygote Mutante Columbia (M3) mit Landsberg erecta gekreuzt, um eine Zuordnung Bevölkerung zu schaffen. </li><li> Die Darstellung wird auf 70 bis 100 F2 Individuen mit dem aberranten Phänotyp und die gleiche Anzahl von F 2-Pflanzen mit einem Wildtyp-Phänotyp durchgeführt. </li><li> Sammle von jeder Pflanze ein Blatt Disc (0,60 mm) mit einem Locher. DieBlattscheiben sollte aus den Blättern des gleichen Alters gesammelt werden, um sicher sein, ähnliche Mengen an DNA zu haben. Die Proben können für die genomische Extraktion einzeln oder in Gruppen bearbeitet werden. In diesem Fall ist es möglich, zu 5-10 Proben für jede Eppendorf-Röhrchen zu sammeln, um am Ende wird es weniger Eppendorf-Röhrchen aus dem genomischen DNA extrahiert werden muss haben. </li><li> MasterPure Pflanze Blatt DNA Purification Kit (Epicentre) verwendet wird, um die genomische DNA zu extrahieren. Die genomische DNA von jeder Probe erhalten wird mit einem Nano-Drop quantifiziert. </li><li> Die gleiche Menge an genomischer DNA aus jeder Probe wird dann zusammen bis zu einem Gesamtbetrag von 300 ng (~ 30 ul) von Pflanzen-DNA; mit 60 ul 2,5 X zufälliger Primer-Lösung [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM 2-Mercaptoethanol, 750 ug / ml Oligodesoxyribonukleotid Primer (random Octamere)] (BioPrime Kit) und 42 ul Wasser (Endvolumen 132 ul). </li><li> Denaturieren DNAs bei&gt; 95 ° C für 5 bis 10 min. </li><li> Auf Eis abgekühlt. </li><li> Zu jedem Denaturierungroten DNA hinzuzufügen 15 ul 10X dNTPs Mischung mit Biotin dCTP [1 mM Biotin-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, dTTP 2 mM in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (BioPrime Kit), und mit 3 ul Klenow-Polymerase (BioPrime Kit) abzuschließen. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 25 ° C. </li><li> Am folgenden Tag, fügen Sie 15 ul 3 M NaOAc und 400 ul kaltem 100% EtOH und mischt. </li><li> Inkubation bei -80 ° C für 1 Stunde, dann bei 20.500 xg für 15 min zu spinnen, zu entfernen Überstand und wäscht mit 500 ul kaltem 75% EtOH. </li><li> Zentrifugieren bei 20.500 xg für 10 min. </li><li> Chemische DNA-Pellets bei 37 ° C für 10 min und Resuspension in 100 ul Wasser. </li><li> Verwenden Sie 5 ul auf Ertrag und Qualität auf einem Gel (Abbildung 2) zu überprüfen. </li><li> Senden Sie 95 ul der Kennzeichnung Reaktion für die Wildtyp und Mutante für GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array-Hybridisierung. </li><li> Die Arrays werden gescannt und die. CEL-Dateien erhalten werden mittels R-Software ( <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.o</a>rg /). </li><li> Installieren Sie R-Software, dann öffnen Sie das Programm und fügen Sie die folgende Zeichenfolge ein: Quelle (&quot; <a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a> &quot;) biocLite () Drücken Sie dann die Return-Taste-das wird die Standard-Pakete Bioconductor (installieren <a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a> ). </li><li> In einem neuen Ordner auf Ihrem Desktop, von der folgenden Website (Download <a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a> ) die Dateien: readcel.R SFP.R Map.R ath1V5.RData ColLerCEL.zip Die Datei ColLerCEL.zip sollten ausgepackt und die resultierenden Dateien in Ihrem neuen Ordner eingefügt. </li><li> Benennen Sie die Daten aus Ihrer GeneChip Experiment in wildtype.CEL und mutant.CEL erhalten. </li><li> Kopieren Sie nun Ihre Daten GeneChip (wildtype.CEL undmutant.CEL) in Ihrem Ordner. </li><li> Open-R, a) für Mac: Klicken Sie auf &quot;Misc&quot;, und klicken Sie dann auf &quot;Change Arbeitsverzeichnis.&quot; b) für PC: Klicken Sie auf &quot;Datei&quot; dann &quot;Verzeichnis wechseln&quot; </li><li> a) für Mac: Wählen Sie den Ordner mit den Dateien. Klicken Sie auf &quot;Workspace&quot;, &quot;Load Workspace-Datei&quot; und wählen Sie ath1V5.RData, b) für PC: Wählen Sie den Ordner mit den Dateien, die oben, klicken Sie auf &quot;Datei&quot;, dann &quot;Load Workspace&quot; und wählen Sie ath1V5.RData. </li><li> Offene readCEL.R mit dem Editor und kopiere den gesamten Text zu R. </li><li> Offene SFP.R mit dem Editor und kopiere den gesamten Text zu R. </li><li> Offene Map.R mit dem Editor und kopiere den gesamten Text zu R. </li><li> In der Console-Fenster sehen Sie die folgende Meldung: Chromosom X begrenzt Mb yz Suche Gene bei TAIR in diesem Link fügen 3 <a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y</a>&amp; End = z </li><li> Kopieren und fügen Sie den Link in Ihren Internet-Browser. Ein Fenster erscheint und fragen Sie zu öffnen oder speichern Sie die Datei, und Sie sollten wählen Sie Speichern. Wählen Sie einen Dateinamen ein und befestigen Sie die Erweiterung &quot;. Xls&quot;, klicken Sie auf Speichern. </li><li> Öffnen Sie die Datei &quot;. Xls&quot;, wo Sie die Koordinaten für Ihr Mutante (das Ergebnis wird grafisch in Abbildung 3 dargestellt) finden können. </li><li> Innerhalb des kartierten Gebietes im zusammengebauten Illumina liest der Mutantengenom identifizieren spezifische EMS Übergänge zwischen den vier Einzel-Nukleotid-Polymorphismen. Ergänzen das Mutantenphänotyps durch Transformation mit Wildtyp-Gen (e) unter Verwendung von Standardverfahren 15. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse 1 zeigt den Ansatz zur Identifizierung einer Mutante von den sekretorischen Weg mittels konfokaler Mikroskopie Screening verwendet. 2 zeigt eine typische Herstellung der markierten genomischen DNA für Array-Hybridisierung. In Abbildung 3 ist ein typisches Ergebnis nach Analyse der Daten aus dem GeneChip Arabidopsis Genome Array erhalten ATH1 präsentiert wird erwartet. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" /> Abbildung 1. Arabidopsis transgene Pflanzen, die ssGFPHDEL (ER-Marker) (1) wurden gezüchtet, um genügend Saatgut für die EMS-Behandlung (2) zu produzieren. Samen mit EMS behandelt wurden dann gesät, um M1 Pflanzen (3) zu generieren. Jeder M1 Pflanze stellt eine andere Linie, und Samen wurden getrennt von jeder von ihnen gesammelt. M2-Samen wurden auf S MS Substrat (4) plattiert wird und dann für Mängel ER Morphologie durch konfokale Mikroskopie (5) abgeschirmt ist. Während der Screening fanden wir, dass Pflanzen konserviert die Wildtyp-ER Morphologie (6) und Pflanzen, die defekte ER Phänotypen (7) zu zeigen. Diese Pflanzen wurden gezüchtet, um den M3-Generation zu erhalten und den Phänotyp (8) zu bestätigen. Genomische DNA von M3-Anlage wurde für Solexa Illumina Sequenzierung (a) verwendet wird. Die gleiche Pflanzewurde auch für Kreuzungen mit Ler-wt verwendet, um den F2-Mapping Bevölkerung (b) zu erhalten. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" /> Abbildung 2. BioPrime zufällig Markierungsreaktionen (5 ul 100 ul) wurden auf Agarosegel 1% geladen. Spur a ist aus einem Pool von Wildtyp-F2-Pflanzen, und die Spur b aus einem Pool von Mutante F2-Pflanzen. (Markierung ist 1 kb DNA-Leiter-N3232, von NEB). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Abbildung stellt ein Beispiel der Abbildung von Col-0-Mutation mit GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array-Hybridisierung. Die Mutation in diesem Beispiel befindet sich auf Chromosom 1, durch vertikale Balken befindet. Die horizontalen Balken stellen die Schwellenwerte für die Erkennung.

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Hier beschreibt eine konfokale Mikroskopie-Screening zur Identifizierung von Mutanten Endomembransystem. Dies kann leicht zu einer anderen Organellen der Zelle, für die spezifische fluoreszierende Protein-Marker zur Verfügung verlängert werden. Der Bildschirm wird auf die Identifizierung von Mutanten, die eine anomale Verteilung der fluoreszierenden Marker, entweder in der Zielorganelle oder Organellen, die nicht dazu bestimmt sind, um den Marker enthalten, die zeigen. Jeweils stellen diese Mutanten untersucht, bei dene...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Ethylmethansulfonat </td><td> Sigma </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Murashige Skoog Basalmedium w Gamborg Vitamine </td><td> Phyto technolog laboratorie </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> Sigma </td><td> P8169-1 kg </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Meister reinen Pflanzenblatt DNA Purification Kit </td><td> Epicentre </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> BioPrime DNA-Kennzeichnungssystem </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> Alcohol 200 Proof </td><td> Dekan Laboratories Inc. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT Baker </td><td></td></tr><tr><td> Gen-Chip-Arabidopsis ATH1Genom Array </td><td> Affymetrix </td><td> 900385 </td></tr><tr><td> Falcon-Röhrchen 50 ml </td><td> Corning </td><td> 430290 </td></tr><tr><td> Eppendorf-Röhrchen 1,5 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filterpapier 90mm </td><td> Whatman </td><td> 1001090 </td></tr><tr><td> Analysenwaage </td><td> Mettler Toledo AB54-S </td><td> na </td></tr><tr><td> Taumelscheibe (Welle) Schüttler </td><td> Heidolph Polymax 1040 </td><td> na </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf 5417-R </td><td> na </td></tr></tbody></table>

fluoreszenz-mikroskopie screening und next-generation-sequencing: nützliche tools für die identifizierung von genen in den organellen integrität beteiligt

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Dieses Protokoll beschreibt ein Fluoreszenzmikroskop-basierte Screening von Arabidopsis-Keimlinge und beschreibt, wie rezessive Mutationen, die die subzelluläre Verteilung eines spezifischen fluoreszierenden Marker markiert in den sekretorischen Weg verändern zu kartieren. Arabidopsis ist ein leistungsfähiges biologisches Modell für genetische Studien wegen seiner Genomgröße, Generationszeit, und die Erhaltung der molekularen Mechanismen unter Königreiche. Die Array-Genotypisierung als ein Ansatz, um die Mutation in Alternative zu den traditionellen Verfahren auf der Basis molekularer Marker zugeordnet ist vorteilhaft, weil es relativ schneller ist und kann die Zuordnung von mehreren Mutanten in wirklich kurzer Zeit ermöglichen. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Proteinen, die die Integrität einer Organelle in Pflanzen beeinflussen können. Hier, als Beispiel, schlagen wir einen Bildschirm zur Karte Gene, die für die Integrität des endoplasmatischen Retikulum (ER). Unser Ansatz kann aber leicht auf andere Pflanzen Zellorganellen erweitert werden(Siehe zum Beispiel 1,2), und stellt daher einen wichtigen Schritt zum Verständnis der molekularen Grundlagen für die anderen subzellulären Strukturen.

Eine grundlegende Aufgabe in der Zellbiologie ist es, die Mechanismen, die die Identität der Organellen, die eukaryotischen Zellen machen zu Grunde liegen zu definieren. Hier schlagen wir eine Methode, um die Gene verantwortlich für die morphologische und funktionelle Integrität der Anlage Organellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Next-Generation-Sequencing-Tools zu identifizieren.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

Dieses Protokoll beschreibt ein auf einem Fluoreszenzmikroskop basierendes Screening von Arabidopsis-Keimlingen und erläutert, wie rezessive Mutationen kartiert werden, die die ...

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, das oder die Gene zu identifizieren, die für die morphologische und funktionelle Integrität pflanzlicher Organellen verantwortlich sind. Dies wird erreicht, indem zunächst Ethylmethansulfonat als chemisches Mutagenisierungsmittel zu Mutagenseeds hinzugefügt wird, die einen fluoreszierenden Marker für die Organellen enthalten. Der zweite Schritt besteht darin, Samen von einzelnen Pflanzen der ersten mutagenen Generation zu sammeln, um Linien der nachfolgenden mutierten Generation M2 zu ziehen.Anschließend werden die mutagenisierten Eliana-Samen mithilfe eines konfokalen oder fluoreszierenden Mikroskops untersucht, um den abweichenden organellen Phänotyp zu identifizieren. Der letzte Schritt besteht darin, die dritte Mutagen-Generation zu erzeugen und das Vorhandensein des mutanten Phänotyps zu bestätigen. Letztendlich kann die rezessive Mutation mithilfe von Sequenzierwerkzeugen der nächsten Generation kartiert werden.Sobald die Lage des mutierten Gens identifiziert ist, sollte die Transformation mit dem Wildtyp-Gen das abweichende Organellenphänotyp wiederherstellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Aufrechterhaltung der morphologischen und funktionellen Integrität pflanzlicher Organellen zu beantworten. Atilmethane, Sulfonatbehandlung von atop sta Samen induzieren genomische Cytosin-Timings-Änderungen, die zu einer Umwandlung von Cytosin-Gwan in Timing führen.Hinzufügen von Mutationen. Die EMS-Behandlung ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll, um eine optimale Mutationsrate in M2-Individuen zu gewährleisten. Zunächst werden Arabidopsis-Samen des wilden Typs der Columbia-Ekotypen beschafft, die zuvor gentechnisch so verändert wurden, dass sie einen geeigneten fluoreszierenden Marker für Organellen tragen.Überführen Sie 0,8 Gramm oder etwa 40.000 Samen in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Geben Sie anschließend 25 Milliliter destilliertes Wasser und 0,2 % Ethylmethansulfonat hinzu. Inkubieren Sie die Mischung 16 Stunden lang auf einem Mutagenisierungs-Mischer bei niedriger Geschwindigkeit. Nach der Inkubation saugen Sie die Flüssigkeit ab und entsorgen Sie sie in ein Gefäß mit einer molaren Natriumhydroxidlösung.Um das EMS zu inaktivieren, 25 Milliliter Wasser in das Falcon-Röhrchen mit den Samen geben. Das Röhrchen verschließen und fünfmal umdrehen, um die Samen zu waschen. Nachdem sich alle Samen abgesetzt haben, das Wasser abziehen und in die Flasche mit einmolarer Natronlauge entsorgen.Wiederholen Sie diesen Waschschritt nach dem letzten Waschgang bis zu 10 Mal, wobei die Samen in einer minimalen Menge Wasser suspendiert werden. Fahren Sie mit der Sterilisierung der Samen fort, indem Sie 25 Milliliter 10 %ige Bleichlösung hinzufügen und kräftig 30 Sekunden lang schütteln. Sobald sich die Samen am Boden abgesetzt haben, gießen Sie die Bleichlösung ab und spülen Sie mit 25 Milliliter steriler Wasser nach.Nachdem das sterile Wasser entfernt wurde, 25 Milliliter 70 % Ethanol hinzufügen. Die Röhrchen 30 Sekunden lang schütteln und die Samen anschließend auf den Boden absinken lassen. Den Ethanol abgießen und mit 25 Milliliter steriler Wasser nachspülen.Wiederholen Sie die sterile Wasserwäsche zweimal. Gießen Sie dann die Samen auf eine Plastikpetrischale, die ein drei mm Filterpapier enthält. Lassen Sie die Samen unter der Haube trocknen, nachdem Sie die Samen zwei Tage bei vier Grad Celsius inkubiert haben.Legen Sie die Samen in eine 150 Millimeter große Petrischale mit etwa 250 bis 300 Samen pro Platte in halbem Magi- und Scoog-Medium, das Fighter-Gel als Geliermittel enthält. Kultivieren Sie die Samen der M1-Generation zwei Wochen lang auf den Platten. Pflanzen Sie die Keimlinge in Erde um und lassen Sie die Pflanzen weiterwachsen.Nach 30 bis 45 Tagen erreichen die Pflanzen das reife Stadium, in dem reife, also sichtbare Lecks eindeutig zu erkennen sind. Zu diesem Zeitpunkt sammeln Sie jeweils zwei Samen von einzelnen M1-Pflanzen, um 1000 unabhängige M2-Linien zu erzeugen. Um die Keimlinge mit einem konfokalen oder Fluoreszenzmikroskop beobachten zu können, ziehen Sie 60 Samen jeder M2-Linie sieben bis zehn Tage lang in halben Plastik-Petri-Schalen heran.Moreish- und Scoog-Medium, das Fighter-Gel enthält, züchtet außerdem fünf Keimlinge der EMS-unbehandelten Kontrolle auf derselben Platte. Sobald die Keimlinge gewachsen sind, montieren Sie fünf bis zehn Cos-Vorführungen mit der ABAC-Dichtungsseite in Richtung des 40-fachen Objektivs auf einem Objektträger und verschließen Sie diese mit einem Deckglas. Unter Fluoreszenz beobachten Sie jedes Olein vom kortikalen bis zum medialen Bereich auf veränderte subzelluläre Verteilung des Organellenmarkers. Nach der Transplantation positiver Pflanzen in Erde und Anzucht der Keimlinge wie zuvor beschrieben, bestätigen Sie, dass das mutante Phänotyp in der M3-Generation vorliegt.Entfernen Sie die störenden Hintergrundmutationen durch mindestens dreimaliges Rückkreuzen mit einem Wildtyp-Genom, das den gewünschten organellen fluoreszierenden Marker enthält, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Beginnen Sie die Kartierung, indem Sie mit dem cogen DN Easy Z Plant Mini Kit etwa drei Mikrogramm genomische DNA aus M drei extrahieren, das die homozygote mutante Columbia-DNA darstellt. Reichen Sie diese DNA zur Sequenzierung am Illumina Genome Analyzer 2 14 ein.Der nächste Schritt besteht darin, das zago-Mutanten-Colombia mit Las Berger zu kreuzen, um die Nachkommenschaft zu erzeugen, bei der nach Selbstbestäubung die gewünschte Kombination auftreten kann. Die entstehende doppelrecessive Generation wird letztendlich als Kartierungspopulation dienen, die das Gen der Interesse enthält, welches die Mutation verursacht. Durch den Vergleich der genomischen DNA dieser Population mit der genomischen DNA von Wildtyp-Pflanzen kann die Position der Mutation im Genom identifiziert werden.Nach dem Wachstum der F2-Pflanzen sammeln Sie zwischen 70 und 100 F2-Individuen mit aberrantem Phänotyp sowie die gleiche Anzahl an F2-Pflanzen mit Wildtyp-Phänotyp und entnehmen Sie von jeder Pflanze eine Blattscheibe mithilfe eines Lochstanzers. Die Blattscheibe sollte von Blättern gleichen Alters stammen. Um ähnliche DNA-Mengen sicherzustellen, können die Proben getrennt oder in Gruppen für die genomische DNA-Extraktion aufgearbeitet werden.In diesem Fall können fünf bis 10 Proben pro Eppendorf-Röhrchen gesammelt werden, sodass weniger Röhrchen vorliegen, aus denen genomische DNA extrahiert werden muss. Verwenden Sie das Master Pure Plant Leaf DNA-Reinigungs-Kit, um die genomische DNA zu extrahieren. Die aus jeder Probe gewonnene genomische DNA kann anschließend mit einem NanoDrop quantifiziert werden.Danach gleiche Mengen DNA von jeder Probe zu insgesamt 300 Nanogramm kombinieren, wobei mutante und Wildtyp-Proben getrennt gehalten werden, um zunächst die Markierungsreaktion vorzubereiten. Fügen Sie 60 Mikroliter einer 2,5 x Zufallsprimerlösung und 42 Mikroliter Wasser hinzu. Nach dem Denaturieren der DNA bei über 95 Grad Celsius für fünf bis zehn Minuten kühlen Sie die Proben auf Eis, um die DNA zu denaturieren. Geben Sie 15 Mikroliter einer 10 X DN tps-Lösung hinzu.Vermischen Sie mit Biotin-DCTP und ergänzen Sie auf drei Mikroliter mit Glen-Polymerase. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 25 Grad Celsius.Am folgenden Tag 15 Mikroliter dreimolares Natriumacetat und 400 Mikroliter kalten 100%igen Ethanol hinzufügen. Die gemischten Proben nach einer Zentrifugation bei 20.500 ×g für 15 Minuten eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius inkubieren. Das Pellet nach einem zweiten Zentrifugationsschritt mit 500 Mikrolitern kaltem 75%igen Ethanol waschen.Trocknen Sie die DNA-Pellets bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Suspendieren Sie die Pellets in 100 µL Wasser und verwenden Sie 5 µL, um Ausbeute und Qualität auf einem Gel-Bio zu überprüfen. Primer-Random-Labeling-Reaktionen wurden aus einem Pool von Wildtyp-F2-Pflanzen und aus einem Pool von mutierten F2-Pflanzen auf ein 1%-Agarose-Gel aufgetragen.Als letzten Schritt werden 95&nbsp;Mikroliter der Markierungsreaktion des Wildtyps und des Mutanten für die Hybridisierung auf einem Genchip Arabidopsis ATH1-Genomarray versandt. Nach dem Abtasten mit dem Abtaster werden die erhaltenen Dot-CL-Dateien mithilfe unserer Software analysiert. Nach der Installation unserer Software starten Sie das Programm und fügen die im schriftlichen Verfahren angegebene Bioconductor-Zeichenkette ein.Dann drücken Sie die Eingabetaste, wodurch die standardmäßigen BIOCONDUCTOR-Pakete von der Array-, Genotypisierungs- und Kartierungswebsite installiert werden. Laden Sie die im Text aufgeführten Dateien herunter und entpacken Sie sie in einen neuen Ordner auf dem Desktop. Behalten Sie die aus dem Gen-Chip-Experiment erhaltenen Daten für den Wildtyp C, L und den Mutanten C bei. Kopieren Sie nun die Gen-Chip-Daten für den Wildtyp C und den Mutanten C in den Ordner.Als Nächstes öffnen Sie R für einen PC. Klicken Sie auf Datei und dann auf Verzeichnis wechseln. Wählen Sie den Ordner aus, der die Dateien enthält, klicken Sie auf Datei – Arbeitsbereich laden und wählen Sie dann A one V five R data open read C do R mit Editor aus. Kopieren Sie den gesamten Text nach R. Für einen Mac klicken Sie auf Mis und dann auf Arbeitsverzeichnis wechseln.Wählen Sie den Ordner aus, der die Dateien enth&auml;lt. Klicken Sie auf Arbeitsbereich, laden Sie die Arbeitsbereichsdatei und w&auml;hlen Sie ATH one V five R data aus. &Ouml;ffnen Sie auf die gleiche Weise sowohl SFP R als auch MAP R mit Text, bearbeiten Sie den Text und kopieren Sie ihn in die R-Konsole.Es erscheint eine Nachricht, um Gene in der Arabidopsis-Information Resource oder TAIR zu suchen. Kopieren Sie den im Text gefundenen Link in den Internetbrowser. Ein Fenster erscheint und fragt, ob die Datei geöffnet oder gespeichert werden soll.Wählen Sie „Speichern“. Geben Sie einen Dateinamen an und fügen Sie die Erweiterung hinzu. Führen Sie x ls aus.Dann auf „Speichern“ klicken. Gezeigt ist ein typisches erwartetes Ergebnis. Nach der Analyse der Daten, die vom Gen-Chip Arabidopsis H1-Genom-Array erhalten wurden, stellt diese Abbildung ein Beispiel der Kartierung der Columbia-0-Mutation mittels Gen-Chip Arabidopsis dar, einer H1-Genom-Hybridisierung, wobei die horizontalen Balken die Schwellenwerte für die Detektion darstellen.Die Mutation in diesem Beispiel befindet sich auf Chromosom eins, begrenzt durch vertikale Striche. Öffnen Sie die Datei dot XLS, um die Koordinate der Mutation innerhalb des kartierten Bereichs zu finden. Identifizieren Sie in den zusammengesetzten Illumina-Lesungen des Mutantengenoms spezifische EMS-Übergänge unter den einzelnen Nukleotid-Polymorphismen.Nach Beherrschung der Methode kann der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz verwendet werden, um Gene in einem deutlich kürzeren Zeitrahmen im Vergleich zur klassischen Kartierungsmethode zu kartieren.

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