Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

Ziel dieses Experiments ist es, das Gen oder die Gene zu identifizieren, die für die morphologische und funktionelle Integrität von Pflanzenorganellen verantwortlich sind. Dies wird erreicht, indem zunächst Ethel Methansulfonat als chemisches Mittel zu mutagenen Atopiesamen hinzugefügt wird, die den Fluoreszenzmarker der Organelle tragen. Der zweite Schritt besteht darin, Samen von einzelnen Pflanzen der ersten mutagenen Generation zu sammeln, um Linien der nachfolgenden Mutantengeneration M zwei zu züchten.

Als nächstes werden die mutagenen a Eliana-Samen mit einem konfokalen oder fluoreszierenden Mikroskop beobachtet, um den abweichenden organischen Phänotyp zu identifizieren. Der letzte Schritt besteht darin, die dritte Mutagengeneration zu generieren und das Vorhandensein des mutierten Phänotyps zu bestätigen. Letztendlich kann die rezessive Mutation mit Hilfe von Next Generation Sequencing-Tools kartiert werden.

Sobald die Position des mutierten Gens identifiziert ist, sollte die Transformation mit dem Wildtyp-Gen den aberranten organischen Phänotyp wiederherstellen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Aufrechterhaltung der morphologischen und funktionellen Integrität von Pflanzenorganellen zu beantworten. Bis zu Methanen, Sulfonatbehandlung von A-Sta-Samen induzieren Cytosin-Timing-Änderungen im Genom, was zu Cytosin gwan zum Timing führt.

Hinzufügen von Mutationen. Die EMS-Behandlung ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll, um ein perfektes Verhältnismutation innerhalb von M zwei Individuen zu gewährleisten. Zu Beginn erhalten Sie Arabidopsis-Samen des Wildtyps Columbia Ecotype, die zuvor so verändert wurden, dass sie einen relevanten Organellen-Fluoreszenzmarker tragen.

Gib 0,8 Gramm oder etwa 40.000 Samen in ein 50-Milliliter-Falkenröhrchen. Fügen Sie dann 25 Milliliter destilliertes Wasser und 0,2 % Ethel-Methansulfonat hinzu. Die Mischung wird nach der Inkubation 16 Stunden lang auf einem mutierenden Mischer bei niedriger Geschwindigkeit inkubiert, die Flüssigkeit aspiriert und in eine Blase mit einem molaren Natriumhydroxid abgegeben.

Um das EMS zu inaktivieren, geben Sie 25 Milliliter Wasser in das Falcon-Röhrchen mit den Samen. Schließen Sie die Tube und drehen Sie sie fünfmal um, um die Samen zu waschen. Nachdem sich alle Samen abgesetzt haben, saugen Sie das Wasser ab und werfen Sie es in den einen molaren Natronlaugekolben.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt bis zu 10 Mal nach der letzten Wäsche, Reese geben Sie die Samen in einer minimalen Menge Wasser. Fahren Sie mit der Sterilisation des Saatguts fort, indem Sie 25 Milliliter 10%iges Bleichmittel hinzufügen und 30 Sekunden lang kräftig schütteln. Sobald sich die Samen am Boden abgesetzt haben, gießen Sie das Bleichmittel ab und spülen Sie es mit 25 Millilitern sterilem Wasser ab.

Nach Entnahme des sterilen Wassers 25 Milliliter 70%iges Ethanol hinzufügen. Schütteln Sie die Röhrchen 30 Sekunden lang und lassen Sie die Samen am Boden absetzen. Gießen Sie das Ethanol ab und spülen Sie es mit 25 Millilitern sterilem Wasser ab.

Wiederholen Sie die Wäsche mit sterilem Wasser zweimal. Gießen Sie dann die Samen auf eine Petrischale aus Plastik mit drei mm Filterpapier. Lassen Sie die Samen unter der Haube trocknen, nachdem Sie die Samen zwei Tage lang bei vier Grad Celsius inkubiert haben.

Lege die Samen in eine 150 Millimeter große Petrischale mit etwa 250 bis 300 Samen pro Platte in der Hälfte von Magi und Scoog Medium, das Fighter Gel enthält. Als Geliermittel züchten Sie die Samen der M1-Generation zwei Wochen lang auf Tellern. Verpflanzen Sie die Setzlinge in Erde und lassen Sie die Pflanzen weiter wachsen.

Nach 30 bis 45 Tagen erreichen die Pflanzen das Reifestadium, in dem sie reifen, so dass Undichtigkeiten deutlich zu sehen sind. Sammle an dieser Stelle M zwei Samen von einzelnen M1-Pflanzen, um 1000 unabhängige M zwei Linien zu erzeugen. Um die Sämlinge mit einem Konfokal- oder Fluoreszenzmikroskop zu beobachten, züchten Sie 60 Samen aus jeder M zwei Linien für sieben bis 10 Tage auf Plastik-Petrischalen in der Hälfte.

Moreish und Scoog Medium enthaltendes Fighter Gel wachsen auch fünf Sämlinge der EMS unbehandelten Kontrolle auf derselben Platte. Sobald die Sämlinge gewachsen sind, montieren Sie fünf bis 10 cos Lead-Ins mit der ABAC-Siegelseite in Richtung der 40-fachen Linse auf einem Objektträger und mit einem Deckglas unter Fluoreszenz eingeschlossen, beobachten Sie jedes Olein von der kortikalen bis zur medialen Region auf eine veränderte subzelluläre Verteilung des Organellenmarkers. Nach der Transplantation positiver Pflanzen in den Boden und das Wachstum bestätigen die Sämlinge wie gerade beschrieben, dass der mutierte Phänotyp in der dritten Generation M liegt.

Entfernen Sie die kontaminierenden Hintergrundmutationen durch mindestens dreimalige Rückkreuzung mit einem Wildtyp-Genom, das den gewünschten organischen Fluoreszenzmarker enthält, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Um mit der Kartierung zu beginnen, verwenden Sie das Cogen DN Easy Z Plant Mini Kit, um etwa drei Mikrogramm genomische DNA aus M drei zu extrahieren, das die homozygote mutierte Columbia-DNA darstellt. Reichen Sie diese DNA für die Illumina-Genomanalysator-Sequenzierung mit zwei 14 Sequenzierungen ein.

Der nächste Schritt ist die Kreuzung der Zago-Mutante Colombia will Las Berger, um nach Selbstbestäubung die einzige Nachkommenschaft zu erzeugen, bei der die Kombination auftreten kann. Die Erzeugung tauber Zähne wird das Ergebnis sein und letztendlich als Kartierungspopulation dienen, die das interessierende Gen enthält, das die Mutation verursacht. Durch den Vergleich der genomischen DNA dieser Population mit der genomischen DNA von Pflanzen vom Well-Typ kann der Ort der Mutation im Genom identifiziert werden.

Nach dem Wachstum der F zwei Pflanzen sammeln Sie zwischen 70 und 100 F zwei Individuen, die den abweichenden Phänotyp zeigen, und die gleiche Anzahl von F zwei Pflanzen mit einem Wildtyp-Phänotyp, sammeln Sie von jeder Pflanze eine Blattscheibe mit einem ganzen Stanzer. Die Blattscheibe sollte von Blättern gleichen Alters gesammelt werden. Um ähnliche DNA-Mengen zu gewährleisten, können die Proben separat oder in Gruppen für die genomische Extraktion aufbereitet werden.

In diesem Fall ist es möglich, fünf bis 10 Proben pro eend orph Röhrchen zu entnehmen, so dass weniger Röhrchen übrig bleiben, aus denen genomische DNA extrahiert werden muss. Verwenden Sie das Master-Aufreinigungskit für reine Pflanzenblatt-DNA, um die genomische DNA zu extrahieren. Die aus jeder Probe gewonnene genomische DNA kann dann mit einem NanoDrop quantifiziert werden.

Kombinieren Sie dann die gleiche Menge DNA aus jeder Probe bis zu einer Gesamtmenge von 300 Nanogramm, wobei Mutanten- und Wildtyp-Proben getrennt bleiben, um zuerst die Markierungsreaktion durchzuführen, und fügen Sie 60 Mikroliter 2,5 x zufällige Primerlösung und 42 Mikroliter Wasser hinzu. Nachdem Sie die DNAA fünf bis 10 Minuten lang bei mehr als 95 Grad Celsius denaturiert haben, rufen Sie die Proben auf Eis auf, um die DNA zu denaturieren. Fügen Sie 15 Mikroliter 10 X DN tps hinzu.

Mit Biotin DCTP mischen und mit drei Mikrolitern vervollständigen. Glen-Polymerase. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 25 Grad Celsius.

Am nächsten Tag fügen Sie 15 Mikroliter dreimolares Natriumacetat und 400 Mikroliter kaltes 100%iges Ethanol hinzu. Die gemischten Proben werden nach der Zentrifugation bei 20.500 G für 15 Minuten bei minus 80 Grad Celsius eine Stunde lang inkubiert. Waschen Sie das Pellet nach einer zweiten Schleuderung mit 500 Mikrolitern kaltem, 75%igem Ethanol.

Trocknen Sie die DNA-Kügelchen bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Suspendieren Sie die Pellets erneut in 100 Mikrolitern Wasser und verwenden Sie fünf Mikroliter, um die Ausbeute und Qualität eines Biogels zu überprüfen. Prime-zufällige Markierungsreaktionen wurden auf ein 1%aros-Gel aus einem Pool von Wildtyp-F-Zwei-Pflanzen und aus einem Pool von Mutanten F-Zwei-Pflanzen geladen.

Als letzten Schritt senden Sie 95 Mikroliter der Wildtyp- und Mutantenmarkierungsreaktion für den Genchip Arabidopsis mit einer Ein-Genom-Array-Hybridisierung. Nach dem Scannen des Radiergummis werden die resultierenden Punkt-CL-Dateien mit unserer Software analysiert. Nachdem Sie unsere Software installiert haben, öffnen Sie das Programm und fügen Sie den Bioleiter-String ein, den Sie in der schriftlichen Prozedur gefunden haben.

Drücken Sie dann die Eingabetaste, um die Standard-BIOCONDUCTOR-Pakete von der Array-, Genotypisierungs- und Mapping-Website zu installieren. Laden Sie die im Text aufgelisteten Dateien herunter und entpacken Sie sie in einen neuen Ordner auf dem Desktop. Behalten Sie die Daten aus dem Genchip-Experiment in Wildtyp C, L und Mutante C bei.Kopieren Sie nun die Genchipdaten für Wildtyp C und Mutante C in den Ordner.

Öffnen Sie als Nächstes R für einen PC. Klicken Sie auf Datei und dann auf Verzeichnis ändern. Wählen Sie den Ordner aus, der die Dateien enthält, klicken Sie auf Arbeitsbereich zum Laden von Dateien, und wählen Sie dann A one V five R data open read C do R using editor aus, und kopieren Sie den gesamten Text nach R für einen Mac, klicken Sie auf mis, und klicken Sie dann auf Arbeitsverzeichnis ändern.

Wählen Sie den Ordner aus, der die Dateien enthält. Klicken Sie auf Workspace Load Workspace-Datei und wählen Sie ATH one V five R data aus. Öffnen Sie auf ähnliche Weise sowohl SFP R als auch MAP R mit Text, bearbeiten Sie den Text, und kopieren Sie ihn in R im Konsolenfenster.

Es wird eine Meldung angezeigt, in der nach Genen in der Arabidopsis-Informationsquelle oder TAIR gesucht werden soll. Kopieren Sie den im Text gefundenen Link und fügen Sie ihn in den Internetbrowser ein. Es erscheint ein Fenster, in dem Sie aufgefordert werden, die Datei zu öffnen oder zu speichern.

Wählen Sie Speichern aus. Wählen Sie einen Dateinamen und fügen Sie die Erweiterung hinzu. Do x ls.

Klicken Sie dann auf Speichern. Hier ist ein typisches erwartetes Ergebnis zu sehen. Nach der Analyse der Daten aus dem Genchip Arabidopsis H one Genome Array stellt diese Abbildung ein Beispiel für die Kartierung der Columbia-Null-Mutation mit dem Genchip Arabidopsis dar, einer H-Eins-Genom-Hybridisierung, bei der die horizontalen Balken die Schwellenwerte für den Nachweis darstellen.

Die Mutation in diesem Beispiel befindet sich auf Chromosom eins, begrenzt durch vertikale Balken. Öffnen Sie die Datei dot XLS, um die Koordinate für die Mutante innerhalb des kartierten Bereichs zu finden. Identifizieren Sie in den assemblierten Illumina-Reads des mutierten Genoms spezifische EMS-Übergänge zwischen den Einzelnukleotid-Polymorphismen.

Sobald der Ansatz, der dieses Protokoll beschreibt, gemeistert wird, kann er verwendet werden, um Gene in einem drei kurzen Zeitrahmen im Vergleich zur klassischen Kartierungsmethode zu kartieren.