Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, das oder die Gene zu identifizieren, die für die morphologische und funktionelle Integrität pflanzlicher Organellen verantwortlich sind. Dies wird erreicht, indem zunächst Ethylmethansulfonat als chemisches Mutagenisierungsmittel zu Mutagenseeds hinzugefügt wird, die einen fluoreszierenden Marker für die Organellen enthalten. Der zweite Schritt besteht darin, Samen von einzelnen Pflanzen der ersten mutagenen Generation zu sammeln, um Linien der nachfolgenden mutierten Generation M2 zu ziehen.

Anschließend werden die mutagenisierten Eliana-Samen mithilfe eines konfokalen oder fluoreszierenden Mikroskops untersucht, um den abweichenden organellen Phänotyp zu identifizieren. Der letzte Schritt besteht darin, die dritte Mutagen-Generation zu erzeugen und das Vorhandensein des mutanten Phänotyps zu bestätigen. Letztendlich kann die rezessive Mutation mithilfe von Sequenzierwerkzeugen der nächsten Generation kartiert werden.

Sobald die Lage des mutierten Gens identifiziert ist, sollte die Transformation mit dem Wildtyp-Gen das abweichende Organellenphänotyp wiederherstellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Aufrechterhaltung der morphologischen und funktionellen Integrität pflanzlicher Organellen zu beantworten. Atilmethane, Sulfonatbehandlung von atop sta Samen induzieren genomische Cytosin-Timings-Änderungen, die zu einer Umwandlung von Cytosin-Gwan in Timing führen.

Hinzufügen von Mutationen. Die EMS-Behandlung ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll, um eine optimale Mutationsrate in M2-Individuen zu gewährleisten. Zunächst werden Arabidopsis-Samen des wilden Typs der Columbia-Ekotypen beschafft, die zuvor gentechnisch so verändert wurden, dass sie einen geeigneten fluoreszierenden Marker für Organellen tragen.

Überführen Sie 0,8 Gramm oder etwa 40.000 Samen in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Geben Sie anschließend 25 Milliliter destilliertes Wasser und 0,2 % Ethylmethansulfonat hinzu. Inkubieren Sie die Mischung 16 Stunden lang auf einem Mutagenisierungs-Mischer bei niedriger Geschwindigkeit. Nach der Inkubation saugen Sie die Flüssigkeit ab und entsorgen Sie sie in ein Gefäß mit einer molaren Natriumhydroxidlösung.

Um das EMS zu inaktivieren, 25 Milliliter Wasser in das Falcon-Röhrchen mit den Samen geben. Das Röhrchen verschließen und fünfmal umdrehen, um die Samen zu waschen. Nachdem sich alle Samen abgesetzt haben, das Wasser abziehen und in die Flasche mit einmolarer Natronlauge entsorgen.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt nach dem letzten Waschgang bis zu 10 Mal, wobei die Samen in einer minimalen Menge Wasser suspendiert werden. Fahren Sie mit der Sterilisierung der Samen fort, indem Sie 25 Milliliter 10 %ige Bleichlösung hinzufügen und kräftig 30 Sekunden lang schütteln. Sobald sich die Samen am Boden abgesetzt haben, gießen Sie die Bleichlösung ab und spülen Sie mit 25 Milliliter steriler Wasser nach.

Nachdem das sterile Wasser entfernt wurde, 25 Milliliter 70 % Ethanol hinzufügen. Die Röhrchen 30 Sekunden lang schütteln und die Samen anschließend auf den Boden absinken lassen. Den Ethanol abgießen und mit 25 Milliliter steriler Wasser nachspülen.

Wiederholen Sie die sterile Wasserwäsche zweimal. Gießen Sie dann die Samen auf eine Plastikpetrischale, die ein drei mm Filterpapier enthält. Lassen Sie die Samen unter der Haube trocknen, nachdem Sie die Samen zwei Tage bei vier Grad Celsius inkubiert haben.

Legen Sie die Samen in eine 150 Millimeter große Petrischale mit etwa 250 bis 300 Samen pro Platte in halbem Magi- und Scoog-Medium, das Fighter-Gel als Geliermittel enthält. Kultivieren Sie die Samen der M1-Generation zwei Wochen lang auf den Platten. Pflanzen Sie die Keimlinge in Erde um und lassen Sie die Pflanzen weiterwachsen.

Nach 30 bis 45 Tagen erreichen die Pflanzen das reife Stadium, in dem reife, also sichtbare Lecks eindeutig zu erkennen sind. Zu diesem Zeitpunkt sammeln Sie jeweils zwei Samen von einzelnen M1-Pflanzen, um 1000 unabhängige M2-Linien zu erzeugen. Um die Keimlinge mit einem konfokalen oder Fluoreszenzmikroskop beobachten zu können, ziehen Sie 60 Samen jeder M2-Linie sieben bis zehn Tage lang in halben Plastik-Petri-Schalen heran.

Moreish- und Scoog-Medium, das Fighter-Gel enthält, züchtet außerdem fünf Keimlinge der EMS-unbehandelten Kontrolle auf derselben Platte. Sobald die Keimlinge gewachsen sind, montieren Sie fünf bis zehn Cos-Vorführungen mit der ABAC-Dichtungsseite in Richtung des 40-fachen Objektivs auf einem Objektträger und verschließen Sie diese mit einem Deckglas. Unter Fluoreszenz beobachten Sie jedes Olein vom kortikalen bis zum medialen Bereich auf veränderte subzelluläre Verteilung des Organellenmarkers. Nach der Transplantation positiver Pflanzen in Erde und Anzucht der Keimlinge wie zuvor beschrieben, bestätigen Sie, dass das mutante Phänotyp in der M3-Generation vorliegt.

Entfernen Sie die störenden Hintergrundmutationen durch mindestens dreimaliges Rückkreuzen mit einem Wildtyp-Genom, das den gewünschten organellen fluoreszierenden Marker enthält, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Beginnen Sie die Kartierung, indem Sie mit dem cogen DN Easy Z Plant Mini Kit etwa drei Mikrogramm genomische DNA aus M drei extrahieren, das die homozygote mutante Columbia-DNA darstellt. Reichen Sie diese DNA zur Sequenzierung am Illumina Genome Analyzer 2 14 ein.

Der nächste Schritt besteht darin, das zago-Mutanten-Colombia mit Las Berger zu kreuzen, um die Nachkommenschaft zu erzeugen, bei der nach Selbstbestäubung die gewünschte Kombination auftreten kann. Die entstehende doppelrecessive Generation wird letztendlich als Kartierungspopulation dienen, die das Gen der Interesse enthält, welches die Mutation verursacht. Durch den Vergleich der genomischen DNA dieser Population mit der genomischen DNA von Wildtyp-Pflanzen kann die Position der Mutation im Genom identifiziert werden.

Nach dem Wachstum der F2-Pflanzen sammeln Sie zwischen 70 und 100 F2-Individuen mit aberrantem Phänotyp sowie die gleiche Anzahl an F2-Pflanzen mit Wildtyp-Phänotyp und entnehmen Sie von jeder Pflanze eine Blattscheibe mithilfe eines Lochstanzers. Die Blattscheibe sollte von Blättern gleichen Alters stammen. Um ähnliche DNA-Mengen sicherzustellen, können die Proben getrennt oder in Gruppen für die genomische DNA-Extraktion aufgearbeitet werden.

In diesem Fall können fünf bis 10 Proben pro Eppendorf-Röhrchen gesammelt werden, sodass weniger Röhrchen vorliegen, aus denen genomische DNA extrahiert werden muss. Verwenden Sie das Master Pure Plant Leaf DNA-Reinigungs-Kit, um die genomische DNA zu extrahieren. Die aus jeder Probe gewonnene genomische DNA kann anschließend mit einem NanoDrop quantifiziert werden.

Danach gleiche Mengen DNA von jeder Probe zu insgesamt 300 Nanogramm kombinieren, wobei mutante und Wildtyp-Proben getrennt gehalten werden, um zunächst die Markierungsreaktion vorzubereiten. Fügen Sie 60 Mikroliter einer 2,5 x Zufallsprimerlösung und 42 Mikroliter Wasser hinzu. Nach dem Denaturieren der DNA bei über 95 Grad Celsius für fünf bis zehn Minuten kühlen Sie die Proben auf Eis, um die DNA zu denaturieren. Geben Sie 15 Mikroliter einer 10 X DN tps-Lösung hinzu.

Vermischen Sie mit Biotin-DCTP und ergänzen Sie auf drei Mikroliter mit Glen-Polymerase. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 25 Grad Celsius.

Am folgenden Tag 15 Mikroliter dreimolares Natriumacetat und 400 Mikroliter kalten 100%igen Ethanol hinzufügen. Die gemischten Proben nach einer Zentrifugation bei 20.500 ×g für 15 Minuten eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius inkubieren. Das Pellet nach einem zweiten Zentrifugationsschritt mit 500 Mikrolitern kaltem 75%igen Ethanol waschen.

Trocknen Sie die DNA-Pellets bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Suspendieren Sie die Pellets in 100 µL Wasser und verwenden Sie 5 µL, um Ausbeute und Qualität auf einem Gel-Bio zu überprüfen. Primer-Random-Labeling-Reaktionen wurden aus einem Pool von Wildtyp-F2-Pflanzen und aus einem Pool von mutierten F2-Pflanzen auf ein 1%-Agarose-Gel aufgetragen.

Als letzten Schritt werden 95 Mikroliter der Markierungsreaktion des Wildtyps und des Mutanten für die Hybridisierung auf einem Genchip Arabidopsis ATH1-Genomarray versandt. Nach dem Abtasten mit dem Abtaster werden die erhaltenen Dot-CL-Dateien mithilfe unserer Software analysiert. Nach der Installation unserer Software starten Sie das Programm und fügen die im schriftlichen Verfahren angegebene Bioconductor-Zeichenkette ein.

Dann drücken Sie die Eingabetaste, wodurch die standardmäßigen BIOCONDUCTOR-Pakete von der Array-, Genotypisierungs- und Kartierungswebsite installiert werden. Laden Sie die im Text aufgeführten Dateien herunter und entpacken Sie sie in einen neuen Ordner auf dem Desktop. Behalten Sie die aus dem Gen-Chip-Experiment erhaltenen Daten für den Wildtyp C, L und den Mutanten C bei. Kopieren Sie nun die Gen-Chip-Daten für den Wildtyp C und den Mutanten C in den Ordner.

Als Nächstes öffnen Sie R für einen PC. Klicken Sie auf Datei und dann auf Verzeichnis wechseln. Wählen Sie den Ordner aus, der die Dateien enthält, klicken Sie auf Datei – Arbeitsbereich laden und wählen Sie dann A one V five R data open read C do R mit Editor aus. Kopieren Sie den gesamten Text nach R. Für einen Mac klicken Sie auf Mis und dann auf Arbeitsverzeichnis wechseln.

Wählen Sie den Ordner aus, der die Dateien enthält. Klicken Sie auf Arbeitsbereich, laden Sie die Arbeitsbereichsdatei und wählen Sie ATH one V five R data aus. Öffnen Sie auf die gleiche Weise sowohl SFP R als auch MAP R mit Text, bearbeiten Sie den Text und kopieren Sie ihn in die R-Konsole.

Es erscheint eine Nachricht, um Gene in der Arabidopsis-Information Resource oder TAIR zu suchen. Kopieren Sie den im Text gefundenen Link in den Internetbrowser. Ein Fenster erscheint und fragt, ob die Datei geöffnet oder gespeichert werden soll.

Wählen Sie „Speichern“. Geben Sie einen Dateinamen an und fügen Sie die Erweiterung hinzu. Führen Sie x ls aus.

Dann auf „Speichern“ klicken. Gezeigt ist ein typisches erwartetes Ergebnis. Nach der Analyse der Daten, die vom Gen-Chip Arabidopsis H1-Genom-Array erhalten wurden, stellt diese Abbildung ein Beispiel der Kartierung der Columbia-0-Mutation mittels Gen-Chip Arabidopsis dar, einer H1-Genom-Hybridisierung, wobei die horizontalen Balken die Schwellenwerte für die Detektion darstellen.

Die Mutation in diesem Beispiel befindet sich auf Chromosom eins, begrenzt durch vertikale Striche. Öffnen Sie die Datei dot XLS, um die Koordinate der Mutation innerhalb des kartierten Bereichs zu finden. Identifizieren Sie in den zusammengesetzten Illumina-Lesungen des Mutantengenoms spezifische EMS-Übergänge unter den einzelnen Nukleotid-Polymorphismen.

Nach Beherrschung der Methode kann der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz verwendet werden, um Gene in einem deutlich kürzeren Zeitrahmen im Vergleich zur klassischen Kartierungsmethode zu kartieren.