Untersuchung von Veränderungen in Caecum Microbiota nach traumatischen Hirnverletzungen bei Mäusen
19. September 2019
Präsentiert hier ist ein Protokoll, um diffuse traumatische Hirnverletzungen mit einem lateralen Fluid Percussion-Gerät gefolgt von der Sammlung des Caecum-Gehalts für Darm-Mikrobiom-Analyse induzieren.
Gleichzeitigkeit und die Linien Interaktionen zwischen dem Gehirn und der Darm-Mikrobiota bleibt unbekannt. Verwenden Sie diese Technik, Veränderungen in der Darmmikrobiota nach traumatischen Hirnverletzungen bei Mäusen können untersucht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie relativ einfach und effizient ist.
Demonstriert das Verfahren wird Wendong You, ein Student aus meinem Labor. Für traumatische Hirnverletzung Induktion, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in einer anästhesierten Maus, und tragen Salbe auf die Augen des Tieres. Nach der Rasur, desinfizieren Sie die exponierte Kopfhaut mit 70% Ethanol, bevor Sie die Kopfhaut in einer sagittalen Ebene einschneiden.
Mit Zangen, ziehen Sie den Schnitt auf beiden Seiten, und trennen Sie das Periost leicht. Verwenden Sie einen Marker, um einen Kreis mit drei Millimetern Durchmesser auf dem rechten Parietalbereich des Schädels zwei Millimeter von der Mittellinie entfernt zu zeichnen. Verwenden Sie einen elektrischen Bohrer, um vorsichtig den Schädel zu durchdringen, ohne die Dura zu beschädigen.
Entfernen Sie die Knochenklappe, um ein Drei-Millimeter-Knochenfenster freizulegen, und legen Sie eine Plastikverletzungskanüle über die Kraniotomie. Nach der Zementierung der Kanüle zum Schädel mit Zahnacryl, verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, um die Kanüle mit sterilen 0,9%normaler Saline zu füllen, wobei darauf zu achten ist, Blasen zu vermeiden. Schalten Sie das Oszilloskop und den Verstärker ein.
Bestätigen Sie, dass das Hochdruckrohr der seitlichen Fluid-Percussion-Verletzungsvorrichtung frei von Luftblasen ist, und liefern Sie etwa 10 Testimpulse, bis das Gerät ein stabiles Signal aussendet. Stellen Sie den Winkel der Pendelstartposition so ein, dass eine Pulsintensität von etwa zwei Standardatmosphären erreicht wird, und verbinden Sie die Verletzungskanüle mit der seitlichen Fluid-Percussion-Verletzungsvorrichtung. Ziehen Sie den Auslöser, um das Pendel freizugeben, was die Hirnverletzung induzieren.
Dann erhalten und übertragen Sie einen Impuls an die Dura durch das gesamte geschlossene, flüssigkeitsgefüllte Schlauchsystem. Nach der Induktion einer Hirnverletzung entfernen Sie die Kanüle und vernähten den Schnitt. Legen Sie dann die Maus auf ein Heizkissen mit Überwachung, bis es ambulant ist, bevor Sie das Tier in seinen Hauskäfig mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser zurück.
An den angegebenen experimentellen Zeitpunkten, setzen Sie den Darm nach Standardprotokollen und verwenden Atraumatische Zangen, um das Ekzum sanft von den anderen Darmtrakten zu trennen. Wenn das Gewebe gefunden wurde, schneiden Sie das Caecum mit einer scharfen Schere und extrahieren Sie den Caecum-Inhalt manuell auf einen sterilen Verband. Dann übertragen Sie den Inhalt auf ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, für minus 80 Grad Celsius Lagerung bis zur Mikrobiom-Analyse.
16S rekombinante DNA-Sequenzierung zeigt eine reduzierte Vielfalt der Caecum-Mikrobiota bei Mäusen drei Tage nach traumatischen Hirnverletzungen, wobei die am häufigsten vorkommende Taxa innerhalb des Caecum-Inhalts der Schein- und traumatischen Hirnverletzungsgruppen in der Abbildung gezeigt wird. Darüber hinaus zeigt die nicht-metrische, multidimensionale Skalierung Veränderungen in der Zusammensetzung der Caecum-Mikrobiota nach traumatischen Hirnverletzungen. Denken Sie daran, Dura intakt zu halten, wenn Sie den Schädel bohren, und sanft zu sein, wenn Sie das Caecum von anderen Darmtrakten lokalisieren und trennen.
Nach diesem Verfahren, Hämatoxylin und Eosin Färbung und analyse kann durchgeführt werden, um die histologische Veränderung und Entzündungsreaktion in Darmtrakt nach traumatischen Hirnverletzungen zu untersuchen.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Induktion einer diffusen traumatischen Hirnverletzung (TBI) mittels einer lateralen Fluidpercussion-Vorrichtung bei Mäusen vor. Nach der Verletzung werden Veränderungen der Darmmikrobiota durch Sammlung von Inhalten aus dem Caecum zur Analyse untersucht. Der Ansatz zielt darauf ab, die Wechselwirkungen zwischen Hirnverletzung und Zusammensetzung der Darmmikrobiota aufzuklären.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Mikrobiom-Analyse
- Forschung zur traumatischen Hirnverletzung
Hintergrund
- Das Verständnis der Beziehungen zwischen Gehirn und Darmmikrobiota ist entscheidend für die TBI-Forschung.
- Die derzeitigen Erkenntnisse darüber, wie ein TBI die Darmmikrobiota beeinflusst, sind begrenzt.
- Die Verwendung von Mäusen als Modellorganismus ermöglicht kontrollierte experimentelle Bedingungen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls zur Induktion einer Schädel-Hirn-Trauma (TBI) und zur Analyse der anschließenden Veränderungen im Mikrobiom des Darms.
- Untersuchung möglicher Korrelationen zwischen neurologischer Verletzung und Diversität der Darmmikrobiota.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Auswirkungen einer Schädel-Hirn-Verletzung (TBI) auf die Gesundheit insgesamt sowie auf Wechselwirkungen mit dem Mikrobiom.
Verwendete Methoden
- Ein laterales Fluidpercussionsystem wurde verwendet, um eine Schädel-Hirn-Trauma bei anästhesierten Mäusen zu induzieren.
- Sorgfältige chirurgische Verfahren wurden durchgeführt, einschließlich Schädelöffnung und Kanülenimplantation.
- Nach der Verletzung wurden Inhaltstoffe des Caecums zur Analyse des Mikrobioms gesammelt und sachgemäß gelagert.
- Die 16S-rDNA-Sequenzierung wurde angewandt, um Veränderungen in der Diversität und Zusammensetzung der Mikrobiota zu bestimmen.
Hauptergebnisse
- Die Analyse zeigte eine verminderte Diversität der Mikrobiota im Caecum innerhalb von drei Tagen nach TBI.
- Die nichtmetrische mehrdimensionale Skalierung zeigte signifikante Veränderungen in der Zusammensetzung der Mikrobiota nach der Verletzung.
- Die Studie unterstreicht die Notwendigkeit zur Vorsicht beim Umgang mit Geweben und bei der Aufrechterhaltung steriler Bedingungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt eine Methodik zur Erforschung der Darm-Hirn-Achse im Kontext von Schädel-Hirn-Traumata (TBI) vor.
- Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein TBI die Darmmikrobiota stören könnte, was Auswirkungen auf die Genesung haben könnte.
- Eine verbesserte Kenntnis der Wechselwirkungen zwischen Darm und Gehirn könnte zukünftige therapeutische Strategien bei TBI beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die mechanistische Entschärfung der Mikrobiota-Darm-Hirn-Achse in der Forschung zur traumatischen Hirnverletzung, indem es ein reproduzierbares Modell zur Beurteilung von Mikrobiomveränderungen nach der Verletzung bereitstellt. Es unterstützt die Validierung von Zielstrukturen und die Entdeckung von Biomarkern, indem neurologisches Trauma mit quantifizierbaren Veränderungen in der Mikrobiota-Zusammensetzung des Caecums verknüpft wird. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Studien, indem er die Induktion traumatischer Hirnverletzungen und die Arbeitsabläufe zur Mikrobiomprobennahme standardisiert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung von Hypothesen zur Darm-Hirn-Achse, indem Veränderungen der Mikrobiota-Diversität nach kontrollierter Induktion einer Schädel-Hirn-Trauma (TBI) gemessen werden.
- Operativer Wert: Bietet ein standardisiertes chirurgisches Vorgehen und Probennahmeverfahren für eine konsistente Gewinnung der Zäkum-Mikrobiota über alle Versuchsgruppen hinweg.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative 16S-rDNA-Sequenzierungsdaten zur Profilierung mikrobieller Zusammensetzungsveränderungen in Zäkumproben.
- Operationaler Wert: Etabliert einen reproduzierbaren Arbeitsablauf für die Mikrobiom-Analyse, der in Screening-Pipelines für therapeutische Wirkstoffe mit Wirkung auf den Darm integriert werden kann.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme, indem die Schwere einer Schädel-Hirn-Trauma mit Veränderungen des Mikrobioms in einem murinen Modell korreliert wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht die langfristige Verfolgung von Mikrobiota-Veränderungen, um risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung in präklinischen Programmen zu unterstützen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode verbindet die Entdeckungsbiologie mit der präklinischen Validierung, indem sie die Induktion von TBI und die Analyse des Darmmikrobioms zur Entrisikung von Zielstrukturen standardisiert.
- Entdeckungsbereich Biologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung zu Wechselwirkungen zwischen Mikrobiota, Darm und Gehirn durch kontrollierte Verletzungsmodelle und Profilierung des Mikrobioms.
- Screening: Bereitstellung standardisierter Mikrobiota-Proben aus dem Caecum, geeignet für nachfolgende 16S-Sequenzierung und Diversitätsanalyse.
- Analytik: Ermöglicht den quantitativen Vergleich der mikrobiellen Zusammensetzung mittels nicht-metrischer mehrdimensionaler Skalierung und Diversitätskennzahlen.
- Translationale Forschung: Verbindet Modelle neurologischer Verletzungen mit Biomarkern des Mikrobioms, um eine präklinische Kontinuität herzustellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung der Modulation der Darm-Hirn-Achse in Modellen neurologischer Erkrankungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Reduziert mechanistische Unschärfen in der Forschung zur Darm-Hirn-Achse, indem quantifizierbare Mikrobiota-Nachweise nach Schädel-Hirn-Trauma bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte chirurgische, Probennahme- und Sequenzierungsprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem Schädel-Hirn-Trauma-Modelle mit biomarkerbasierten Mikrobiom-Signaturen verknüpft werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen, die auf Darm-Hirn-Interaktionen in der Genesung nach Schädel-Hirn-Trauma abzielen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in murinen chirurgischen Verfahren und der sterilen Gewebehandlung.
- Hängt vom Zugang zu lateralen Fluidpercussion-Verletzungsgeräten und Infrastruktur für die 16S-rDNA-Sequenzierung ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Neurowissenschafts- und Mikrobiom-Analysegruppen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Probennahme des Caecums über verschiedene Mausstämme oder Verletzungsmodelle hinweg.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit aseptischer Techniken während der Dissektion von Darmgewebe, um Kontaminationen zu vermeiden.
