Name: Untersuchung von Veränderungen in Caecum Microbiota nach traumatischen Hirnverletzungen bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Erfahren Sie, wie traumatische Hirnverletzungen bei Mäusen die Darmmikrobiota verändern. Diese Methode nutzt laterale Flüssigkeitsperkussion und 16S-rDNA-Sequenzierung zur Analyse der Darm-Hirn-Achse.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Alle durchgeführten Verfahren wurden von der Experimental Animal Ethics Committee der Zhejiang University genehmigt. Alle Instrumente und Materialien, die in der Chirurgie verwendet werden, sind steril. Das TBI-Proceudre dauert ca. 20 Minuten.
1. Tierpflege
<ol><li>Verwenden Sie 5- bis 6 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse (20-25 g Gewicht) in diesem Experiment.</li>
	<li>Halten Sie Mäuse auf einem 12 h/12 h Licht/Dunkel-Zyklus, und stellen Sie sicher, dass sie Nahrung und Wasser ad libitum erhalten. Stellen Sie die gleichen Mengen an Nahrung und Wasser sowohl für die Schein- als auch für die TBI-Gruppe während der gesamten Studie bereit.</li>
	<li>Machen Sie alle Anstrengungen, um die Schmerzen und Beschwerden der Tiere zu minimieren.</li>
</ol>2. Induktion traumatischer Hirnverletzungen
<ol><li>Injektion Ketamin (80-100 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) IP zur Anästhesie. Testen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einem Augenreflex oder Schmerzreflex. Verwenden Sie künstliche Tränen oder Schmiermittel Augensalbe, um die Augen vor dem Trocknen zu halten.</li>
	<li>Nach der Anästhesie, setzen Sie die Maus in anfällige Position. Verwenden Sie ein temperaturgeregeltes Heizkissen, um die Temperatur während der Operation und 30 min nach TBI bei 37 °C zu halten.</li>
	<li>Rasieren Sie die Haare des Schnittbereichs.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit 70% Ethanol mit drei abwechselnden Peelings, dann incise die Kopfhaut in einer sagittalen Ebene.</li>
	<li>Verwenden Sie Zangen, um den Einschnitt auf beiden Seiten zurückzuziehen und das Periost leicht zu trennen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Marker, um einen Kreis (3 mm Durchmesser) auf dem rechten parietalen Bereich des Schädels, 2 mm von der Mittellinie entfernt, zu zeichnen.</li>
	<li>Bohren Sie den Schädel mit einem elektrischen Bohrer. Stellen Sie sicher, dass dieser Schritt sorgfältig durchgeführt wird, um die Dura vor Beschädigungen zu schützen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Knochenklappe und legen Sie ein kleines Knochenfenster (3 mm Durchmesser) zur Bedeckung.</li>
	<li>Legen Sie eine Plastikverletzungskanüle (Innendurchmesser = 2,5 mm, Länge = 8 mm) über die Kraniotomie und zementieren Sie die Kanüle mit einem Zahnacryl zum Schädel.</li>
	<li>Füllen Sie die Kanüle mit sterilen 0,9% NaCl (normale Saline) mit einer Spritze (5 ml), um sicherzustellen, dass es keine Blasen in der Kanüle.</li>
	<li>Schalten Sie das Oszilloskop und den Verstärker ein und stellen Sie sicher, dass das Hochdruckrohr der LFPI-Vorrichtung (Lateral Fluid Percussion Injury) frei von Luftblasen ist. Testen Sie das Gerät, indem Sie etwa 10 Impulse liefern, bis es ein stetiges Signal aussendet. Stellen Sie den Winkel der Pendelstartposition so ein, dass eine Pulsintensität von etwa 2,0 atm erreicht wird.</li>
	<li>Schließen Sie die Verletzungskanüle an das LFPI-Gerät an. Induzieren Sie Hirnverletzungen, indem Sie den Auslöser ziehen und das Pendel loslassen. Dann erhalten Sie einen Impuls und übertragen Sie ihn über das gesamte geschlossene, mit Flüssigkeit gefüllte Schlauchsystem an die Dura.</li>
	<li>Betreiben Sie die Mäuse in der Scheingruppe mit dem gleichen chirurgischen Verfahren. Führen Sie den LFPI nicht aus.</li>
</ol>3. Post-Chirurgie-Behandlung
<ol><li>Nach der Induktion der Hirnverletzung, entfernen Sie die Kunststoffkanüle und Verschließen Sie den Schnitt. Während der Operation verabreichen Buprenorphin (2mg/kg) SQ oder IP und danach alle 6-12 h für drei Tage.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, bis es ambulant ist. Stellen Sie die Temperatur des Heizkissens auf 37 °C ein, um die Anästhesiezung zu beschleunigen.</li>
	<li>Legen Sie die Maus wieder in den Käfig und verabreichen Sie Nahrung und Wasser ad libitum.</li>
</ol>4. Laparotomie und Probensammlung aus dem Caecum
<ol><li>Euthanisieren Sie die Mäuse durch CO2, gefolgt von zervikalen Dislokationen zu den entsprechenden Zeitpunkten. HINWEIS: In diesem Experiment waren die ausgewählten Zeitpunkte 1 h, 6 h, 1 d, 3 d und 7 d posttraumatische Hirnverletzungen, um die dynamische Entwicklung der Darmmikrobiota zu analysieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Haar von der Oberfläche des Bauches. Desinfizieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Legen Sie einen sterilen Vorhang über die Maus. Machen Sie einen Schnitt von der unteren Bauchmittellinie, knapp über der Präbiss in den männlichen Mäusen.</li>
	<li>Nachdem der Darm exponiert ist, lokalisieren Sie das Cecum und trennen Sie es sanft von anderen Darmtrakten. Vermeiden Sie es, das Cecum mit verzahnten oder scharfen Zangen zu greifen. Verwenden Sie atraumatische Zangen, wie Z. B. Adson-Zangen mit Serrationen.</li>
	<li>Schneiden Sie das Caecum mit einer scharfen Schere.</li>
	<li>Den Caecuminhalt manuell auf sterile Verbande extrahieren und in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aufbewahren.</li>
	<li>Bewahren Sie den Caecumgehalt bei -80 °C bis zur Mikrobiomanalyse auf.</li>
</ol>5. DNA-Extraktion und 16S-rDNA-Sequenzierung und Datenanalyse
<ol><li>
Isolierung von DNA aus Kot HINWEIS: Für dieses Experiment wurde ein handelsübliches DNA-Isolationskit (Materialtabelle) verwendet.<ol>
<li>Verwenden Sie ein Skalpell, um 300 mg Kot in einem 2 ml Mikrozentrifugenrohr zu kratzen und legen Sie das Rohr auf Eis.</li>
		<li>Fügen Sie jeder Probe 1 ml Inhibitionspuffer hinzu. Wirbel kontinuierlich für 1 min oder bis die Fäkalienprobe gründlich homogenisiert ist.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe mit der maximalen Geschwindigkeit von 1 min, um die Fäkalienpartikel zu pelleten.</li>
		<li>Pipette 2 l Proteinase K in ein neues 2 ml Mikrozentrifugenrohr. Pipetten Sie 600 l des Überstandes von Schritt 5.1.3 in das 2 ml Mikrozentrifugenrohr mit Proteinase K. Fügen Sie dann 600 l Puffer 1 und Wirbel für 15 s hinzu.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Probe bei 70 °C für 10 min.</li>
		<li>Fügen Sie dem Lysat (1:1-Verhältnis) 600 l 100 % Ethanol hinzu und mischen Sie es durch Wirbeln. Zentrifuge mit der maximalen Geschwindigkeit kurz, um Tropfen aus der Innenseite des Rohrdeckels zu entfernen.</li>
		<li>Tragen Sie 600 l des Lysats auf die Spinspalte auf. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min. Entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Übertragen Sie dann die Säule in ein neues 2 ml-Sammelrohr.</li>
		<li>Öffnen Sie die Spin-Spalte, und fügen Sie 500 L Puffer 2 hinzu. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min. Entfernen Sie die Säule und legen Sie sie in ein neues 2 ml Sammelrohr.</li>
		<li>Fügen Sie der Spalte 500 L Puffer 3 hinzu. Zentrifuge bei der maximalen Geschwindigkeit für 3 min. Entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie den Zentrifugationsprozess einmal, um sicherzustellen, dass der Puffer 3 vollständig eluiert ist.</li>
		<li>Legen Sie die Spinsäule in ein neues Rohr 2 ml Sammelrohr und Pipette 200 l Puffer 4 direkt auf die Membran. 1 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, dann zentrifugieren mit der maximalen Geschwindigkeit für 1 min, um die DNA zu entwerten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
16S-rDNA-Sequenzierung und Datenanalyse
	<ol>
<li>Verwenden Sie 20-30 ng DNA, um Amplicons zu erzeugen.</li>
		<li>Verwenden Sie handelsübliche Primer, die für die relativ konservierten Regionen an grenzend an die hypervariablen V3- und V4-Regionen von Bakterien 16S rDNA entwickelt wurden. In der vorliegenden Studie wurden die Vorwärtsprimer mit der Sequenz "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" und Reverse Primer mit der Sequenz "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC" verwendet.</li>
		<li>Machen Sie die PCR-Reaktionen mischung, indem Sie 2,5 l Puffer 1, 2 l dNTPs, 1 l jedes Primers, 0,5 l DNA-Polymerase und 20 ng Vorlagen-DNA in einem Rohr hinzufügen. Verwenden Sie ddH2O, um das Reaktionssystem auf 25 l einzustellen.</li>
		<li>Stellen Sie die PCR-Reaktionsparameter wie folgt ein: Führen Sie die Vordenaturierung bei 94 °C für 3 min einmal durch. Denaturierung bei 94 °C für 5 s, Aneal bei 57 °C für 90 s, bei 72°C für 10 s ausdehnen und 24x wiederholen.</li>
		<li>Führen Sie die PE250/300-Gekoppeltendsequenzierung gemäß der Anweisung des Herstellers durch und verwenden Sie das QIIME-Datenanalysepaket für die 16S rRNA-Datenanalyse. HINWEIS: In diesem Experiment wurden die DNA-Sequenzierung und Datenanalyse in erster Linie von einem professionellen Sequenzierungsunternehmen durchgeführt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cheng, P., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCheng%2C+P+%22Trends+in+traumatic+brain+injury+mortality+in+China%2C+2006-2013%3A+A+population-based+longitudinal+study%22">Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study</a>. 14, e1002332(2017).</li>
<li>Maas, A. I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+brain+injury%3A+integrated+approaches+to+improve+prevention%2C+clinical+care%2C+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research.</a> The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).</li>
<li>Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+manifestations+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Systemic manifestations of traumatic brain injury.</a> Handbook of Clinical Neurology. 127, 205-218 (2015).</li>
<li>Kabadi, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid-percussion-induced+traumatic+brain+injury+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats.</a> Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).</li>
<li>Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+microbiota%2C+immune+and+nervous+systems+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease.</a> Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).</li>
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<li>Cryan, J. F., Dinan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind-altering+microorganisms%3A+the+impact+of+the+gut+microbiota+on+brain+and+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).</li>
<li>Nicholson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+Traumatic+Brain+Injury+Alters+the+Gastrointestinal+Microbiome+in+a+Time-Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent.</a> Shock. , (2018).</li>
<li>Houlden, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+injury+induces+specific+changes+in+the+caecal+microbiota+of+mice+via+altered+autonomic+activity+and+mucoprotein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).</li>
<li>Treangen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+Brain+Injury+in+Mice+Induces+Acute+Bacterial+Dysbiosis+Within+the+Fecal+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2757(2018).</li>
<li>Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+fluid+percussion%3A+model+of+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li>
<li>Thompson, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+fluid+percussion+brain+injury%3A+a+15-year+review+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation.</a> Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).</li>
<li>Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faecal+and+caecal+microbiota+profiles+of+mice+do+not+cluster+in+the+same+way%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way.</a> Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren danken Baohong Wang aufrichtig für ihre technische Anleitung.

Hier wird ein einfaches und effizientes Protokoll zur Bestimmung von Veränderungen der cecal microbiota nach TBI bei Mäusen vorgestellt. Die Induktion von Hirnverletzungen und die Entnahme von Caecum-Gehaltsproben sind wichtige Bestandteile des Protokolls.
Obwohl Forscher die Veränderungen der Darmmikrobiota nach TBI untersucht haben, waren die in diesen Studien verwendeten Hirnverletzungen CCI-8 und Gewichtstropfen/Impact-induzierte Modelle9. Je...

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind ein globales Problem der öffentlichen Gesundheit und die häufigste Todesursache bei jungen Erwachsenen1,2. TBI verursacht jedes Jahr viele Todesfälle, und Überlebende erleben eine Vielzahl von körperlichen, psychiatrischen, emotionalen und kognitiven Behinderungen. Daher ist TBI eine schwere Belastung für die Familiären und gesellschaftlichen Ressourcen eines Patienten. TBI beinhaltet sowohl die primäre Hirnverletzung, die zum Zeitpunkt des Traumas auftritt, als auch alle sekundären Hirnverletzungen, die Stunden bis Monate nach einer anfänglichen Verletzung entstehen. Sekundäre Hirnverletzungen werden durch mehrere biochemische Kaskaden vermittelt, die nicht nur schädlich für das Gehirn sind, sondern auch erhebliche negative Auswirkungen auf verschiedene Organsysteme haben, einschließlich des Magen-Darm-Systems3.
Derzeit gibt es drei Modelle, um TBI in Tierversuchen zu induzieren: Flüssigkeitspercussion-Verletzung, Kontrolle kortikaler Auswirkungen (CCI) und Gewichtsabnahmebeschleunigung. Lateral Fluid Percussion Injury (LFPI) ist das am häufigsten verwendete Modell, um diffuse Hirnverletzungen (DAI) zu etablieren4. Das Gerät verursacht Hirnverletzungen durch eine Kraniektomie, indem es einen kurzen Flüssigkeitsdruckimpuls auf die intakte Dura aufträgt. Dieser Impuls entsteht durch den Schlag des Pendels. LFPI ist eine reproduzierbare und kontrollierbare Modellierungsmethode für die TBI-Forschung.
Das Mikrobiom ist definiert als das kollektive Genom aller Mikroorganismen, die sich im menschlichen Körper befinden. Insbesondere Darmmikroben spielen nicht nur eine wichtige Rolle bei der Darmhomöostase und Funktion, sondern regulieren auch viele Aspekte der Wirtsphysiologie und der Funktion anderer Organe5. In den letzten Jahren, Es gibt zunehmend Hinweise, die darauf hindeuten, dass Darm-Mikrobiota reguliere Gehirnentwicklung und Funktion über Gehirn-Darm-Achsen6. Störung der Darmmikrobiota wurde mit mehreren Gehirnfunktionsstörungen einschließlich Parkinson-Krankheit, affektive Störungen, und Autismus7verbunden. Kürzlich, präklinische Studien haben auch berichtet, dass akute Hirnverletzungen Veränderungen in der Darmmikrobiotainduzierenkönnen 8,9.
Eine Studie von Treangen et al.10 fand signifikante Abnahmen bei drei mikrobiellen Arten und Erhöht bei zwei mikrobiellen Arten nach CCI-induziertem TBI. Diese Beweise deuten darauf hin, dass die Modulation von Darmmikrobiota eine therapeutische Methode im TBI-Management sein kann. Jedoch, die Mechanismen zugrunde Hirnverletzung-induzierte Darm-Mikrobiota Veränderungen bleiben unbekannt. Aus diesem Grund ist ein relativ einfaches und effizientes Modell zur Untersuchung der Veränderungen der Darmmikrobiota nach TBI erforderlich. Daher präsentiert die vorliegende Studie ein Protokoll zur Untersuchung von Veränderungen in Darmmikrobiota nach TBI bei Mäusen.

<table><tbody><tr><td>DNA-Isolationskit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>51604</td><td>Für die schnelle Aufreinigung genomischer DNA aus Stuhlproben</td></tr><tr><td>Genanalyse-Service</td><td>GENEWIZ</td><td></td><td>Genanalyse-Service</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Shanghai SAFE Biotech Co.</td><td>TR-200</td><td></td>Heizkissen-Injektor</tr><tr><td></td><td>Das erste angeschlossene Krankenhaus, School of Medicine, Zhejiang University</td><td></td><td>Injektor</td></tr><tr><td>LFPI-Gerät</td><td>Virginia Commonwealth University</td><td>FP302</td><td>LFPI-Gerät</td></tr><tr><td>Mikro-Schädelbohrer</td><td>RWD Life Science</td><td>78061</td><td>Mikro-Schädelbohrer</td></tr><tr><td>Povidon-Jod</td><td>Das erste angeschlossene Krankenhaus, School of Medicine, Zhejiang Universität</td><td></td><td>Povidon-Jod</td></tr></tbody></table>

untersuchung von veränderungen in caecum microbiota nach traumatischen hirnverletzungen bei mäusen

Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Zunehmende Erkenntnisse zeigen, dass die Mikrobiota-Darm-Gehirn-Achse eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Hirnerkrankungen spielt. Mehrere Studien zeigen auch, dass traumatische Hirnverletzungen Veränderungen der Darmmikrobiota verursachen. Jedoch, Mechanismen, die der bidirektionalen Regulation der Gehirn-Darm-Achse zugrunde liegen, bleiben unbekannt. Derzeit gibt es nur wenige Modelle für die Untersuchung der Veränderungen in Darm-Mikrobiota nach traumatischen Hirnverletzungen. Daher kombiniert die vorgestellte Studie Protokolle zur Induktion traumatischer Hirnverletzungen mit einem lateralen Fluid Percussion-Gerät und die Analyse von Caecum-Proben nach Verletzungen zur Untersuchung von Veränderungen im Darmmikrobiom. Veränderungen der Darmmikrobiotazusammensetzung nach traumatischen Hirnverletzungen werden mittels 16S-rDNA-Sequenzierung bestimmt. Dieses Protokoll bietet eine effektive Methode zur Untersuchung der Beziehungen zwischen enterischen Mikroorganismen und traumatischen Hirnverletzungen.

Die Einrichtung von TBI ist in Abbildung 1dargestellt. Nach Anästhesie und Desinfektion wurde die Kopfhaut sagittisch eingeschnitten (Abbildung 1A). Eine Kraniotomie (3 mm Durchmesser) wurde mit einem elektrischen Bohrer über den rechten parietalen Kortex in den Schädel gezerrt, die Dura wurde intakt gehalten (Abbildung 1B, C). Eine Plastikverletzungskanüle wurde über das Knochenfens...

Präsentiert hier ist ein Protokoll, um diffuse traumatische Hirnverletzungen mit einem lateralen Fluid Percussion-Gerät gefolgt von der Sammlung des Caecum-Gehalts für Darm-Mikrobiom-Analyse induzieren.

Untersuchung von Veränderungen in Caecum Microbiota nach traumatischen Hirnverletzungen bei Mäusen

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Gleichzeitigkeit und die Linien Interaktionen zwischen dem Gehirn und der Darm-Mikrobiota bleibt unbekannt. Verwenden Sie diese Technik, Veränderungen in der Darmmikrobiota nach traumatischen Hirnverletzungen bei Mäusen können untersucht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie relativ einfach und effizient ist.Demonstriert das Verfahren wird Wendong You, ein Student aus meinem Labor. Für traumatische Hirnverletzung Induktion, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in einer anästhesierten Maus, und tragen Salbe auf die Augen des Tieres. Nach der Rasur, desinfizieren Sie die exponierte Kopfhaut mit 70% Ethanol, bevor Sie die Kopfhaut in einer sagittalen Ebene einschneiden.Mit Zangen, ziehen Sie den Schnitt auf beiden Seiten, und trennen Sie das Periost leicht. Verwenden Sie einen Marker, um einen Kreis mit drei Millimetern Durchmesser auf dem rechten Parietalbereich des Schädels zwei Millimeter von der Mittellinie entfernt zu zeichnen. Verwenden Sie einen elektrischen Bohrer, um vorsichtig den Schädel zu durchdringen, ohne die Dura zu beschädigen.Entfernen Sie die Knochenklappe, um ein Drei-Millimeter-Knochenfenster freizulegen, und legen Sie eine Plastikverletzungskanüle über die Kraniotomie. Nach der Zementierung der Kanüle zum Schädel mit Zahnacryl, verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, um die Kanüle mit sterilen 0,9%normaler Saline zu füllen, wobei darauf zu achten ist, Blasen zu vermeiden. Schalten Sie das Oszilloskop und den Verstärker ein.Bestätigen Sie, dass das Hochdruckrohr der seitlichen Fluid-Percussion-Verletzungsvorrichtung frei von Luftblasen ist, und liefern Sie etwa 10 Testimpulse, bis das Gerät ein stabiles Signal aussendet. Stellen Sie den Winkel der Pendelstartposition so ein, dass eine Pulsintensität von etwa zwei Standardatmosphären erreicht wird, und verbinden Sie die Verletzungskanüle mit der seitlichen Fluid-Percussion-Verletzungsvorrichtung. Ziehen Sie den Auslöser, um das Pendel freizugeben, was die Hirnverletzung induzieren.Dann erhalten und übertragen Sie einen Impuls an die Dura durch das gesamte geschlossene, flüssigkeitsgefüllte Schlauchsystem. Nach der Induktion einer Hirnverletzung entfernen Sie die Kanüle und vernähten den Schnitt. Legen Sie dann die Maus auf ein Heizkissen mit Überwachung, bis es ambulant ist, bevor Sie das Tier in seinen Hauskäfig mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser zurück.An den angegebenen experimentellen Zeitpunkten, setzen Sie den Darm nach Standardprotokollen und verwenden Atraumatische Zangen, um das Ekzum sanft von den anderen Darmtrakten zu trennen. Wenn das Gewebe gefunden wurde, schneiden Sie das Caecum mit einer scharfen Schere und extrahieren Sie den Caecum-Inhalt manuell auf einen sterilen Verband. Dann übertragen Sie den Inhalt auf ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, für minus 80 Grad Celsius Lagerung bis zur Mikrobiom-Analyse.16S rekombinante DNA-Sequenzierung zeigt eine reduzierte Vielfalt der Caecum-Mikrobiota bei Mäusen drei Tage nach traumatischen Hirnverletzungen, wobei die am häufigsten vorkommende Taxa innerhalb des Caecum-Inhalts der Schein- und traumatischen Hirnverletzungsgruppen in der Abbildung gezeigt wird. Darüber hinaus zeigt die nicht-metrische, multidimensionale Skalierung Veränderungen in der Zusammensetzung der Caecum-Mikrobiota nach traumatischen Hirnverletzungen. Denken Sie daran, Dura intakt zu halten, wenn Sie den Schädel bohren, und sanft zu sein, wenn Sie das Caecum von anderen Darmtrakten lokalisieren und trennen.Nach diesem Verfahren, Hämatoxylin und Eosin Färbung und analyse kann durchgeführt werden, um die histologische Veränderung und Entzündungsreaktion in Darmtrakt nach traumatischen Hirnverletzungen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein vielschichtiger Ansatz zur Untersuchung funktionelle Veränderungen im Hippocampus Schaltung erläutert. Elektrophysiologischen Verfahren werden zusammen mit der Schädigung Protokoll Verhaltenstests und regionalen Dissektionsverfahren beschrieben. Die Kombination dieser Techniken können in ähnlicher Weise für andere Hirnregionen und wissenschaftlichen Fragen angewendet werden.

Untersuchungen über Veränderungen der hippokampalen Schaltung Funktion Nach Mild Traumatic Brain Injury

Das Video demonstriert eine Methode zur Erstellung eines Mausmodells für traumatische Hirnverletzungen (TBI) mit Hilfe eines lateralen Flüssigkeitsperkussionsgeräts (LFPI). Bei der Betäubung der Maus wird das Gehirn freigelegt, indem ein Fenster auf dem Schädel geschaffen wird. Eine mit Kochsalzlösung gefüllte Kanüle wird am Fenster befestigt und dann mit dem LFPI verbunden. Das Pendel des Geräts wird losgelassen, um einen Druckimpuls zu erzeugen, der ein Schädel-Hirn-Trauma zufügt.

Generierung eines Mausmodells für ein Schädel-Hirn-Trauma mit Hilfe eines lateralen Flüssigkeitsperkussionsgeräts

Quelle: Macheda, T., et. al. Elektromagnetisch gesteuertes Modell mit geschlossenem Kopf für leichte traumatische Hirnverletzungen bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Induktion einer geschlossenen Kopfverletzung in einem Mausmodell unter Verwendung eines stereotaktischen Rahmens. Der kontrollierte Aufprall repliziert eine leichte traumatische Hirnverletzung und ermöglicht es den Forschern, neurologische Auswirkungen und die Genesung zu untersuchen, indem sie die...

Induktion eines leichten Schädel-Hirn-Traumas in einem Mausmodell

Quelle: Braeckman, K., et. al. Erweiterte Diffusionsbildgebung im Hippocampus von Ratten mit leichtem Schädel-Hirn-Trauma. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die Verwendung von diffusionsgewichteter Bildgebung zur Beurteilung mikrostrukturelle Veränderungen im Hippocampus einer Ratte nach einem leichten Schädel-Hirn-Trauma (mTBI), wobei die axonale Verletzung durch präzise MRT-Scans und Diffusionsanalysen hervorgehoben wird.

Diffusionsgewichtete Bildgebung des Hippocampus der Ratte mit leichtem Schädel-Hirn-Trauma

Akute Hirn-Trauma ist eine schwere Verletzung, die keine angemessene Behandlung bis heute hat. Multiphotonen-Mikroskopie ermöglicht Studium in Längsrichtung den Prozess der akuten Hirntrauma Entwicklung und Untersuchung therapeutische Strategien bei Nagern. Zwei Modelle des akuten Hirn-Trauma untersucht mit in vivo Zwei-Photonen-Imaging von Gehirn werden in diesem Protokoll demonstriert.

Akute Brain Trauma in Mäusen Gefolgt durch Längs Zwei-Photonen-Imaging

Traumatische Hirnverletzungen (TBIs) sind nach wie vor ein ernstes Gesundheitsproblem. Mit Hilfe des Modells der kontrollierten kortikalen Aufprallchirurgie können die Auswirkungen des SHT und mögliche Behandlungsmethoden erforscht werden.

Controlled Cortical Impact-Modell für traumatische Hirnverletzung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, quantitative mikrostrukturelle Informationen über den Hippocampus bei einer Ratte mit leichter traumatischer Hirnverletzung zu erhalten. Dies geschieht mit einem fortschrittlichen diffusionsgewichteten Magnetresonanztomographieprotokoll und einer regionsbezogenen Analyse parametrischer Diffusionskarten.

Advanced Diffusion Imaging im Hippocampus von Ratten mit leichter traumatischer Hirnverletzung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung des Antibiotika-induzierten pseudo-keimfreien Dextransulfat-Natrium-induzierten Colitis-Mausmodells vor, um die Rolle der Darmmikrobiota bei der Regulierung der positiven Auswirkungen von Bacillus cereus auf Colitis zu untersuchen.

Untersuchung der lindernden Wirkung der Verabreichung von Bacillus cereus auf Colitis durch Modulation der Darmmikrobiota

Aus dem Darm stammende mikrobielle Metaboliten haben vielfältige Wirkungen, die zu komplexem Verhalten bei Tieren führen. Unser Ziel ist es, eine Schritt-für-Schritt-Methode bereitzustellen, um die Auswirkungen von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm im Gehirn über die intrazerrebroventrikuläre Verabreichung über eine Führungskanüle zu beschreiben.

Intracerebroventrikuläre Abgabe von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm in frei beweglichen Mäusen

Das Protokoll beschreibt ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma in einem Mausmodell. Insbesondere wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Induktion einer leichten Mittellinien-geschlossenen Kopfverletzung und die Charakterisierung des Tiermodells vollständig erläutert.

Elektromagnetisch gesteuertes Closed-Head-Modell für leichtes Schädel-Hirn-Trauma bei Mäusen

Dieses Protokoll stellt ein modifiziertes Mausmodell für repetitive milde traumatische Hirnverletzungen (rmTBI) vor, die über eine geschlossene Kopfverletzungsmethode (CHI) induziert werden. Der Ansatz zeichnet sich durch ein verdünntes Schädelfenster und eine Flüssigkeitsperkussion aus, um die Entzündung zu reduzieren, die häufig durch die Exposition von Hirnhäuten verursacht wird, sowie eine verbesserte Reproduzierbarkeit und Genauigkeit bei der Modellierung von rmTBI bei Nagetieren.

Modifiziertes Mausmodell für repetitives leichtes Schädel-Hirn-Trauma mit verdünntem Schädelfenster und flüssiger Perkussion

Erfahren Sie, wie traumatische Hirnverletzungen bei Mäusen die Darmmikrobiota verändern. Diese Methode nutzt laterale Flüssigkeitsperkussion und 16S-rDNA-Sequenzierung zur Analyse der Darm-Hirn-Achse.

Untersuchung von Veränderungen in Caecum Microbiota nach traumatischen Hirnverletzungen bei Mäusen

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