Name: Ein fluoreszenzbasierter Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung der Lipidtropfenbildung bei menschlichen Darmorganoiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung von Lipidtropfen in menschlichen Darmorganoiden mittels fluoreszenzbasierter Assay-Technik. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-Screenings für patientenspezifische Arzneimittelkandidaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken B. Spee für die großzügige Bereitstellung von LD540. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) an S.M.

<ol><li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li>
<li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li>
<li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat%3A+Presence%2C+synthesis%2C+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li>
<li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li>
<li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li>
<li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li>
<li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li>
<li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li>
<li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements%2C+Protein-losing+Enteropathy%2C+and+Rickets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li>
<li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+protein+losing+enteropathy%3A+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li>
<li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li>
<li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids%3A+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye%2C+LD540%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li>
<li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier stellen wir ein Protokoll zur Bestimmung der LD-Bildung bei menschlichen Darmorganoiden bei der Inkubation mit Ölsäure zur Verfügung. Diese Methode basiert auf dem LD-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff LD54018, der eine Charakterisierung und Quantifizierung des Gesamtvolumens von Lipidtröpfchen innerhalb einer organoiden Kultur ermöglicht. Die Verfahren zur Etablierung und Erhaltung menschlicher Darmorganoidkulturen wurden vor13veröffentlicht, und ein visueller Leitfade...

Lipide sind ein entscheidender Bestandteil der menschlichen Ernährung und spielen eine wichtige Rolle bei der systemischen Energiespeicherung und dem Stoffwechsel. Bei der Aufnahme werden diätetische Lipide durch Bauchspeicheldrüsenlipasen zu freien Fettsäuren (FFAs) und Monoglyceriden (MGs) abgebaut. Diese Substrate werden dann von den Enterozyten des Darmepithels aufgenommen, wo sie zunächst durch Monoglycerid-Acyltransferasen (MGAT)-Enzyme zu Diglyceriden (DG) und anschließend zu Triglyceriden (TG) durch Diacylglycerin reesterifiziert werden. Acyltransferase 1 (DGAT1)1. Schließlich sind diese TGs entweder in Chylomicrons für den Export in das Lymphsystem oder in zytosolische Lipidtröpfchen (LDs) für die intrazelluläre Lagerung2,3integriert. Obwohl Chylomicronen benötigt werden, um diätetische Lipide auf andere Organe zu verteilen, ist die Bedeutung der intrazellulären Fettspeicherung in LDs nicht ganz klar. Jedoch, LDs haben gezeigt, dass eine regulatorische Funktion im Darm zu erfüllen, wie sie langsam Lipide in den Kreislauf bis zu 16 h nach einer Mahlzeit4freisetzen. Darüber hinaus haben lDs gezeigt, dass sie vor toxischen Fettsäurekonzentrationen schützen, wie z. B. bei Mausadipozyten unter lipolytischen Bedingungen5.
Das DGAT1-Protein befindet sich auf der endoplasmatischen Retikulummembran (ER) und spielt eine entscheidende Rolle bei der LD-Bildung im Darmepithel. Homozygote Mutationen in DGAT1 führen zu früh auftretendem schweren Durchfall und/oder Erbrechen, Hypoalbuminämie und/oder (tödlicher) Proteinverlust-Enteropathie mit Darmversagen bei Fettaufnahme, was die Bedeutung von DGAT1 bei der Lipidhomöostase des Menschen Darmepithel6,7,8,9,10. Da das Auftreten von DGAT1-Mangel beim Menschen selten ist, ist der Zugang zu primären, vom Patienten abgeleiteten Zellen nur knapp. Darüber hinaus ist die Langzeitkultur der Darmepithelzellen seit langem auf tumorabgeleitete Zelllinien beschränkt, die die normale Physiologie nur bedingt darstellen. Daher wurde die DGAT1-vermittelte LD-Bildung meist in Fibroblasten oder tierischen Zelllinien7,10,11,12untersucht. Als solche wurde kürzlich gezeigt, dass DGAT1-defizienten Patienten-abgeleiteten Fibroblasten weniger LDs ansammeln als gesunde Kontrollzellen nach Stimulation mit Ölsäure (OA)8.
Zuvor wurden Protokolle zur Kultur epitheliale Stammzellen aus jedem Magen-Darm-Organ in Form von dreidimensionalen (3D) Organoiden13etabliert. Diese Darmorganoide können über einen längeren Zeitraum13in kulturerhalten und ermöglichen die funktionelle Untersuchung patienten- und darmortspezifischer Epithelmerkmale14. Sie sind genetisch und phänotypisch stabil und können gelagert werden, was eine langfristige Expansion und Biobanking13ermöglicht.
Wir haben vor kurzem gezeigt, dass LD-Bildung leicht in menschlichen Darmorganoiden in einem LD-Formationstest (LDF) Assay6gemessen werden kann. Wenn sie OA für 16 h ausgesetzt sind, erzeugen Organoide LDs, um die Zellen vor lipidinduzierter Toxizität zu schützen. Wenn die OA-Konzentrationen zu hoch sind, sterben die Zellen durch Caspase-vermittelte Apoptose6ab. Der LDF-Test war zuvor weitgehend von DGAT1 abhängig, wie durch Organoide von DGAT1-mutierten Patienten und durch die Verwendung von DGAT1-spezifischen Inhibitoren6angezeigt wurde.
Für den hier ausführlich beschriebenen LDF-Assay werden 3D-Organoide aus Darmbiopsien kultiviert und wöchentlich durch Unterbrechung in einzelne Zellen geleitet, die leicht neue Organoide bilden. Für den LDF-Assay werden in jedem Brunnen einer 24-Well-Platte 7.500 organoidabgeleitete Einzelzellen plattiert. Organoide werden über mehrere Tage gebildet, über Nacht mit 1 mM OA inkubiert und mit LD540, einem fluoreszierenden zelldurchlässigen LD-spezifischen Farbstoff, der die Bildgebung erleichtert, gebeizt. Die LD-Bildung wird dann durch konfokale Mikroskopie, Fluoreszenzplattenleser oder Durchflusszytometrie quantifiziert.
Durch die Skalierung dieses LD-Formationstests auf ein 96-Well-Format kann der Assay auch für die Hochdurchsatzanalyse der LD-Bildung verwendet werden, um neuartige Medikamente zu untersuchen, die die LD-Bildung in menschlichen Darmorganoidkulturen beeinflussen, oder um (menschliche genetische) Störungen zu untersuchen, die LD-Stoffwechsel.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Basalmembran-Matrix (Matrigel)</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DGAT1-Inhibitor (AZD 3988)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4837/10</td><td></td></tr><tr><td>Fettsäurefrei BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Klinipath</td><td>4078-9001</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin (GlutaMAX, 100x)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Leica</td><td>SP8X</td><td></td></tr><tr><td>LD540</td><td></td><td></td><td>freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. B. Spee, Universität Utrecht</td></tr><tr><td>mEGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09_500ug</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin-produzierende Zellen (HEK293-mNoggin-Fc-Zellen)</td><td></td><td></td><td>MTA mit J. den Hertog, Hubrecht</td></tr><tr><td>Institute Ölsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008-5G</td><td></td></tr><tr><td>p38 MAPK-Inhibitor (p38i) (SB202190)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (5.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin-produzierende Zellen (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Zellen)</td><td>R& D systems</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>TC-behandelte 24-Well-Platten</td><td>Greiner-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>TC-behandelte schwarze 96-Well-Platten mit klarem Boden</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>TGFb Typ I Rezeptor-Inhibitor (A83-01)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (TrypLE Express)</td><td>Life Technologies</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>WNT-3A-produzierende Zellen (L-Wnt-3A-Zellen)</td><td></td><td></td><td>MTA mit J. den Hertog, Hubrecht Institute</td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid (Rho-Kinase-Inhibitor)</td><td>Abcam</td><td>ab120129-10</td><td></td></tr></tbody></table>

ein fluoreszenzbasierter assay zur charakterisierung und quantifizierung der lipidtropfenbildung bei menschlichen darmorganoiden

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Diätetische Lipide werden vom Darmepithel als freie Fettsäuren (FAs) aufgenommen. Diese FAs werden intrazellulär in Triglyceridmoleküle (TG) umgewandelt, bevor sie in Chylomikron für den Transport zur Lymphe oder in zytosolische Lipidtröpfchen (LDs) zur intrazellulären Lagerung verpackt werden. Ein entscheidender Schritt für die Bildung von LDs ist die katalytische Aktivität von Diacylglycerol-Acyltransferasen (DGAT) im letzten Schritt der TG-Synthese. LDs sind wichtig, um toxische Lipidarten zu puffern und den Zellstoffwechsel in verschiedenen Zelltypen zu regulieren. Da das menschliche Darmepithel regelmäßig mit hohen Lipidkonzentrationen konfrontiert wird, ist die LD-Bildung von großer Bedeutung, um die Homöostase zu regulieren. Hier beschreiben wir einen einfachen Test zur Charakterisierung und Quantifizierung der LD-Bildung (LDF) bei Stimulation mit der häufigsten ungesättigten Fettsäure, Ölsäure, bei menschlichen Darmorganoiden. Der LDF-Test basiert auf dem LD-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff LD540, der die Quantifizierung von LDs durch konfokale Mikroskopie, Fluoreszenzplattenleser oder Durchflusszytometrie ermöglicht. Der LDF-Assay kann verwendet werden, um die LD-Bildung in menschlichen Darmepithelzellen zu charakterisieren oder menschliche (genetische) Störungen zu untersuchen, die den LD-Stoffwechsel beeinflussen, wie DGAT1-Mangel. Darüber hinaus kann dieser Assay auch in einer Hochdurchsatz-Pipeline verwendet werden, um neuartige therapeutische Verbindungen zu testen, die Defekte in der LD-Bildung bei Darm- oder anderen Organoiden wiederherstellen.

Für eine ordnungsgemäße Analyse der LD-Bildung sollten die Organoide vor der Stimulation mit OA und anschließender Färbung nicht zu dicht gesät werden. Dies ist besonders wichtig für die Konfokal- und Plattenleser-Auslesung, da überlappende Organoide die Fluoreszenz stören könnten. Ein Beispiel für die richtige organoide Saatdichte (Abbildung 1A) und eine Kultur mit überlappenden Organoiden wird gezeigt (Abbildung 1</stro...

Dieses Protokoll beschreibt einen Test für die Charakterisierung der Lipidtröpfchenbildung (LD) bei menschlichen Darmorganoiden bei Stimulation mit Fettsäuren. Wir diskutieren, wie dieser Assay für die Quantifizierung der LD-Bildung verwendet wird, und wie er für ein Hochdurchsatz-Screening für Medikamente verwendet werden kann, die die LD-Bildung beeinflussen.

Ein fluoreszenzbasierter Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung der Lipidtropfenbildung bei menschlichen Darmorganoiden

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Dieses Protokoll beschreibt einige Methoden zur Quantifizierung der Lipidtröpfchenbildung bei menschlichen Darmorganoiden. Es kann als Eine High-Throughput-Screening-Plattform verwendet werden, um auf Medikamente zu testen, die Lipid-Tröpfchenbildung modulieren. Die Von uns beschriebene Methode basiert auf einem Lipidtropfen-spezifischen Farbstoff und biopsieabgeleiteten Darmorganoiden.Es bietet damit ein stabiles, genaues und physiologisch relevantes Modell für die Lipidtröpfchenbildung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um patientenspezifische neuartige Arzneimittelkandidaten zu überprüfen, die die Bildung von Lipidtröpfchen modulieren, z. B. bei DGAT1-patienten. Diese Lipid-Tröpfchen-Bildung Assay kann auch auf andere Arten von organoiden Kulturen angewendet werden, um Lipidstoffwechsel in anderen Zelltypen zu studieren.Der Assay ist in erheblichem Maße von der Dichte der Organoidkultur abhängig. Versuchen Sie, eine konsistente Organoiddichte über Proben und Experimente hinweg zu gewährleisten. Visuelle Demonstration dieses Assays ist wichtig, weil es wichtig ist, zu zeigen, wie das Organoid kultiviert werden sollte und wie sie behandelt werden sollten, um eine ordnungsgem

a-fluorescence-based-assay-for-characterization-quantification-lipid

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt einen Durchflusszytometrie-Assay zur Quantifizierung der ROS-Spiegel in 3D-Darmorganoiden, die von GFP-exprimierenden transgenen Mäusen gewonnen wurden. Diese Methode bietet ein experimentelles In-vitro-Modell, um die Wirksamkeit von Testverbindungen auf die ROS-Produktion zu untersuchen.

Durchflusszytometrischer Assay zur Quantifizierung von oxidativem Stress: Ein Assay zur Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies in Darmorganoiden mit fluorogenen Sonden

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit folgende pharmakologische Behandlung im menschlichen Darm Organellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und live-Cell-Mikroskopie.

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Liposomen und wie diese auf einer Oberfläche immobilisiert und mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie massiv parallel abgebildet werden können. Dies ermöglicht die Quantifizierung der Größe und der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen der Population.

Ein quantitativer Fluoreszenzmikroskopie-basierter Single Liposome-Assay zum Nachweis der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen

Hier beschreiben wir eine Technik zur Quantifizierung der Barriereintegrität kleiner Darmorganoide. Die Tatsache, dass die Methode auf lebenden Organoiden basiert, ermöglicht die sequenzielle Untersuchung verschiedener Barriereintegritätsmodulisierungssubstanzen oder Kombinationen davon in einer zeitaufgelösten Weise.

Untersuchung des Darmbarriereabbaus bei lebenden Organoiden

In dieser Arbeit demonstrieren wir ein optimiertes BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basiertes Protokoll zur Charakterisierung von Lipidtröpfchen in Lebergewebe. Durch die Verwendung von orthogonalen Projektionen und 3D-Rekonstruktionen ermöglicht der Fluorophor eine erfolgreiche Unterscheidung zwischen mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose und kann einen komplementären Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen zur Beurteilung der hepatischen Steatose darstellen.

Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

Lipophagie ist eine selektive Form der Autophagie, bei der Lipidtröpfchen abgebaut werden. Funktionsstörungen in diesem Prozess werden mit der Entstehung von Krebs in Verbindung gebracht. Die genauen Mechanismen sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Dieses Protokoll beschreibt quantitative Bildgebungsansätze, um das Zusammenspiel zwischen Autophagie, Fettstoffwechsel und Krebsprogression besser zu verstehen.

Erforschung der Regulation des Lipidtröpfchen-Katabolismus durch Lipophagie

Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die hochauflösende, markierungsfreie und dreidimensionale Bildgebung von Organoiden mittels Low-Coherence-Holotomographie vor. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Organoidkulturen, die Aufnahme von Bildern und die computergestützte Bildanalyse und ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der strukturellen Dynamik und des Wirkstoffansprechens in lebenden Organoiden.

Markierungsfreie, hochauflösende 3D-Bildgebung und maschinelle Lernanalyse von Darmorganoiden mittels Low-Coherence-Holotomographie

Dieses Protokoll beschreibt einen in vitro Assay zur Messung der zellulären Lipidaufnahme in Endothelzellen nach Stimulation mit BODIPY-C12 und BODIPY-C16 fluoreszierenden Analoga von langkettigen und sehr langkettigen gesättigten Fettsäuren. Diese Methode ist effizient und an andere Zelltypen anpassbar und bietet einen nützlichen Ansatz zur Untersuchung des Fettstoffwechsels.

Quantifizierung der endothelialen Fettsäureaufnahme mit Hilfe von fluoreszierenden Fettsäureanaloga

Dieses Protokoll ermöglicht eine reproduzierbare Visualisierung von Lipidtröpfchen und Organellendynamiken während der Mitose mit synchronisierten Hepatomen.

Eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Dynamik von Lipidtröpfchen und Organellen während der Mitose in Hepatomzellen

Schwimmende Mammosphären-Assays können die Untergruppe von stammähnlichen Brustkrebszellen untersuchen, die unter Suspensionsbedingungen überleben und eine erhöhte Tumorgenese zeigen, wenn sie in Mäuse implantiert werden.  Dieses Protokoll bietet eine bequeme in vitro Messung der kugelbildenden Fähigkeit, einen Proxy für die in vivo Tumorgenese, und erleichtert gleichzeitig die Analyse der stammassoziierten Transkriptionslandschaft.

Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien

Lernen Sie die Quantifizierung von Lipidtropfen in menschlichen Darmorganoiden mittels fluoreszenzbasierter Assay-Technik. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-Screenings für patientenspezifische Arzneimittelkandidaten.

Ein fluoreszenzbasierter Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung der Lipidtropfenbildung bei menschlichen Darmorganoiden (Video) | JoVE Journal

Ein fluoreszenzbasierter Assay zur Charakterisierung und Quantifizierung der Lipidtropfenbildung bei menschlichen Darmorganoiden

Weitere Videos entdecken