Markierungsfreie, hochauflösende 3D-Bildgebung und maschinelle Lernanalyse von Darmorganoiden mittels Low-Coherence-Holotomographie

Unser Ziel ist es, markierungsfreie Echtzeit-Bildgebungsverfahren für die Überwachung biophysikalischer Veränderungen in lebenden Organoiden während der Entwicklung und als Reaktion auf Medikamente zu etablieren. Dieses Protokoll ermöglicht eine optimierte Skalierung der Bildgebung und nicht-invasive Wirkstofftests an lebenden Organoiden, unterstützt durch KI-gesteuerte Mutation und quantitative Texturauswahl für die biomedizinische Forschung. Wir planen, markierungsfreie 3D-Bildgebung und eine einjährige Analyse für hochauflösende, nicht-invasive Organoidstudien in der Krankheitsmodellierung und präzisen Medizin weiter zu integrieren.

Zu Beginn aspirieren Sie das verbrauchte Medium aus jeder Vertiefung einer 48-Well-Platte, die die extrazelluläre Matrix enthält. Geben Sie 200 Mikroliter Zellwiederherstellungslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie die Organoidsuspension vorsichtig mit einer Pipette und überführen Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 150 g drei Minuten lang, dann entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Um das Pellet mechanisch zu trennen, resuspendieren Sie es in 200 Mikrolitern Nährmedium und pipettieren Sie die Suspension 20 bis 30 Mal mit einer P200-Pipette auf und ab, bevor Sie es drei Minuten lang zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren und Entfernen des Überstands Medium und frische extrazelluläre Matrix (ECM) in einem Verhältnis von eins zu vier zum Pellet hinzufügen und vorsichtig pipettieren, um es gründlich zu mischen.

Geben Sie 15 Mikroliter der Mischung pro Dome in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte. Legen Sie die Platte für eine Stunde kopfüber in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, um die Polymerisation der ECM zu ermöglichen. Geben Sie nach der Polymerisation 200 Mikroliter frisches Kulturmedium in jede Vertiefung und füllen Sie die leeren äußeren Vertiefungen mit PBS.

Um die Probe für die Bildgebung vorzubereiten, geben Sie 15 Mikroliter organoide ECM-Kuppel auf eine Bildgebungsschale mit Deckglas Nummer 1,5 und inkubieren Sie sie eine Minute lang bei Raumtemperatur. Stellen Sie die Platte für eine Stunde kopfüber in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Fügen Sie dann vorsichtig so viel Nährmedium hinzu, dass die Organoide vollständig untergetaucht sind.

Fünf Tage nach der Passage waschen Sie die Probe unmittelbar vor der Bildgebung zwei- bis dreimal mit PBS. Schalten Sie als Nächstes für die Bildgebung den Umgebungscontroller ein. Die Kammersteuerung stellt die Temperatur automatisch auf 37 Grad Celsius und das Kohlendioxid auf 5 % ein. Drücken Sie die Türtaste, um die Tür zu öffnen.

Fügen Sie Wasser hinzu, um eine dünne Schicht in der Kammer zu bilden. Setzen Sie die Bildschale in den Gefäßhalter ein, setzen Sie sie in die Bildkammer ein und befestigen Sie sie mit einem Stift, um ein Verrutschen zu verhindern. Schließen Sie die Tür, um Störungen durch externes Licht zu vermeiden.

Starten Sie nun die TomoStudio X-Software und melden Sie sich an. Klicken Sie auf Start, um das Hauptfenster zu öffnen, und klicken Sie dann in der oberen linken Ecke auf Projekt hinzufügen, und weisen Sie das Experiment zu. Vergewissern Sie sich, dass der richtige Medientyp für die richtige Verwendung des Brechungsindex ausgewählt ist.

Klicken Sie auf die gewünschte Vertiefung in der Platte und dann oben auf Erstellen, um die Vertiefung als Probe zu registrieren. Klicken Sie dann in der oberen rechten Ecke auf ROI-Setup, um den Interessenbereich des Gerichts zu definieren. Klicken Sie nach der Einstellung in der unteren rechten Ecke auf Experiment ausführen, um das Fenster "Bildaufnahme" zu öffnen.

Klicken Sie in der Ecke auf Behälter laden, um ein Hellfeldbild anzuzeigen. Passen Sie die Z-Position mit den Tasten Z und Z an, um das Bild scharf zu stellen. Passen Sie auf der Registerkarte Single Imaging die ROI-Größe an.

Erfassen Sie Organoide in einem Sichtfeld von 160 Mikrometern x 160 Mikrometern und erfassen Sie Stapel mit einer Tiefe von bis zu 140 Mikrometern. Navigieren Sie zur Registerkarte Zeitraffer-Bildgebung, um die Langzeit-Bildgebung einzurichten und die gewünschte Dauer und Intervallzeit festzulegen. Klicken Sie auf das Symbol Scannen, um den aktuellen ROI-Standort zu erfassen.

Klicken Sie auf die Taste "BF", um die Intensitäts- und Belichtungswerte für die Hellfeld-Bildgebung anzupassen. Verschieben Sie das Feld ROI im Vorschaufenster, um den ROI auszuwählen. Sobald der gewünschte ROI ausgewählt ist, klicken Sie unten auf Punkt hinzufügen, um die Liste der Bildgebungspunkte zu erstellen.

Doppelklicken Sie auf eine Miniaturansicht einer Datei, um das ROI-Tomogramm zu öffnen. Untersuchen Sie die 2D-Ansicht, indem Sie mit den Steuerelementen Zoom, Schwenken und Scrollen durch die Ebenen X, Y und Z navigieren. Klicken Sie auf das Symbol für die MIP-Rendering-Ansicht auf der linken Seite, um in den 3D-Rendering-Modus zu wechseln.

Navigieren Sie in der 3D-Ansicht, indem Sie das Bild drehen, zoomen und schwenken. Exportieren Sie für die auf maschinellem Lernen basierende Bildsegmentierung die TCF-Bilddatei in das HDF5-Format, um sicherzustellen, dass die Daten in einem mehrdimensionalen Format vorliegen, das mit ilastik kompatibel ist. Öffnen Sie ilastik und navigieren Sie zu Neues Projekt.

Wählen Sie im Abschnitt Segmentierungs-Workflow die Option Pixel-Klassifizierung aus und speichern Sie das Projekt in einem bestimmten Ordner. Um die HGF5-Datei zu laden, navigieren Sie zur Registerkarte Eingabedaten, klicken Sie auf Neue Datei hinzufügen, wählen Sie das entsprechende H5-Dataset aus und überprüfen Sie die korrekten Bildkanalzuweisungen. Navigieren Sie nun zur Registerkarte Feature-Auswahl, um Features wie Farbe, Intensität, Kante und Textur auszuwählen und die Segmentierung zu optimieren.

Beschriften Sie auf der Registerkarte Training die organoiden und nicht-organoiden Bereiche mit unterschiedlichfarbigen Pinselstrichen. Klicken Sie auf Live-Update, um eine Vorschau der Segmentierungsergebnisse anzuzeigen und bei Bedarf Anpassungen vorzunehmen. Wenn Sie fertig sind, wechseln Sie zur Registerkarte Prediction Export.

Wählen Sie Einfache Segmentierung als Quelle aus, um beschriftete Vorhersagen zu exportieren, und klicken Sie auf Alle exportieren. Legen Sie das Exportformat je nach Analyseanforderungen auf H5 oder TIFF fest. Für die quantitative Analyse öffnen Sie die Supplementary Coding File 2.

Legen Sie die entsprechenden Ordnerpfade für die Maskendatei und die entsprechende TCF-Datei innerhalb des Skripts fest. Führen Sie den Code aus, um die quantitative Analyse zu initiieren. Der Code berechnet das Organoidvolumen, die Proteindichte und den Gesamtproteingehalt für jeden Datensatz.

Diese Abbildung veranschaulicht die hochauflösenden, dreidimensionalen Brechungsindex-Rekonstruktionen, mit denen die Gesamtmorphologie von Dünndarm-Organoiden sichtbar gemacht wird. Die gerenderten Rekonstruktionen zeigen deutliche strukturelle Unterschiede zwischen Vehikel-behandelten und Cisplatin-behandelten Organoiden über alle drei optischen Schnitttiefen. Mit Cisplatin behandelte Organoide zeigten 10 Minuten nach der Behandlung im Vergleich zu Vehikel-behandelten Organoiden ein signifikant höheres Volumen, eine geringere Proteindichte und einen höheren Gesamtproteingehalt, was auf eine frühe strukturelle Schwellung und eine veränderte Proteinzusammensetzung hinweist.

Zeitrafferaufnahmen über 24 Stunden zeigten, dass Vehikel-behandelte Organoide ihre strukturelle Integrität beibehielten, während Cisplatin-behandelte Organoide eine fortschreitende strukturelle Degradation erfuhren, einschließlich eines Kryptenkollapses und einer erhöhten Zelldissoziation, was auf eine zeitabhängige zytotoxische Schädigung hindeutet. Die quantitative Nachverfolgung bestätigte, dass Vehikel-behandelte Organoide im Laufe der Zeit an Volumen und Proteingehalt zunahmen, während mit Cisplatin behandelte Organoide einen zeitabhängigen Rückgang beider Parameter zeigten, was darauf hindeutet, dass Cisplatin das Wachstum unterdrückte und den Zellabbau induzierte. Die Proteindichte blieb in Vehikel-behandelten Organoiden stabil, nahm aber in mit Cisplatin behandelten Organoiden über einen Zeitraum von 24 Stunden progressiv ab, was auf einen Zusammenbruch der Zellstruktur und einen erhöhten extrazellulären Raum aufgrund des Peelings hindeutet.