Name: Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie chimäre Axolotls mit mutagenisierten haploiden Gliedmaßen durch embryonales Grafting erzeugen. Diese Methode ermöglicht genetische Screening-Studien zur Untersuchung von Regenerationsmechanismen.

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Wir danken Katherine Roberts für ihre Pflege der Axolotl-Kolonie. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde vom Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 und 15-RMB-YALE-01) und dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral) bereitgestellt. Stipendium F32HD086942).

Experimentelle Verfahren, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurden vom Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017–10557) genehmigt und entsprachen allen Bundesrichtlinien und Richtlinien für die Verwendung von Wirbeltieren. Alle Tierversuche wurden am Ambystoma mexicanum (Axolotls) in Einrichtungen der Yale University durchgeführt.
1. Diploid Embryo Generation
<ol><li>Erhalten Sie GFP+ diploide Embryonen, um als Transplantatwirte durch natürliche Paarung mit einem oder zwei gfp Eltern 24zu dienen.</li>
	<li>Sammeln Sie frisch gelegte diploide Eier und legen Sie sie in ein Metallsieb.</li>
	<li>Spülen Sie die Eier gründlich mit 40% Holtfreter Lösung (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH bis 7,4).</li>
	<li>Die Eier in frische 40% Holtfreter-Lösung geben und bei 12 °C lagern. HINWEIS: Diploide Embryonen sollten immer erhalten werden, bevor sie zur haploiden Embryoerzeugung übergehen.</li>
</ol>2. Haploid Embryo Generation
<ol><li>Weibliche Gamete Spender Vorbereitung<ol>
<li>48 h vor Der in vitro Aktivierung, anästhetisieren Sie ein geschlechtsreifes weißes oder weißes/RFP weibliches Axolotl durch Eintauchen in 1 g/L HEPES-gepufferte MS-222 in 40% Holtfreters Lösung25.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass das Tier nach ca. 30 min Eintauchen vollständig beäpft wird, indem Sie den Schwanz fest zwischen Daumen und Zeigefinger kneifen. Voll anästhesierte Tiere reagieren nicht physisch auf eine Prise.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Lösung des menschlichen Choriongonadotropins (HCG) mit 10.000 U/ml in steriler Saline vor.</li>
		<li>Mit einer 30 G Insulinspritze 0,15 CC HCG (1.500 Einheiten) in die Muskulatur dorsal in die Hinterseite des anästhesierten Weibchens in 45° Winkel zur Mittellinie injizieren, um den Kontakt mit dem Rückenmark zu vermeiden.</li>
		<li>Das Weibchen auf frische 40% Holtfreter-Lösung zurückgeben und in einen 8-12 °C-Kühlschrank geben.</li>
		<li>Nach 48 h das Weibchen auf Raumtemperatur zurückbringen. Legen Sie ein paar Steine oder Plastikpflanzen in ihren Behälter als Oberflächen für die Eiablage. HINWEIS: Weibchen, die mit HCG injiziert werden, legen oft leere Gelee-Hüllen für mehrere Stunden ab, bevor sie Eier legen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Steine oder Kunststoffpflanzen, nachdem das Weibchen begonnen hat, konsequent Eier zu legen.</li>
		<li>Lassen Sie das Weibchen 30 min bis 1 h im leeren Tank sitzen. HINWEIS: Das Zurückhalten von Materialien, auf die das Tier Eier legen kann, ermöglicht eine strengere Kontrolle der Eizellensammlung.</li>
	</ol></li>
	<li>Männliche Gamete-Sammlung<ol>
<li>Während die Eiablage des Weibchens ins Stocken gerät, befeuchten Sie ein geschlechtsreifes GFP+ männliches Axolotl, um als Samenspender zu dienen, wie in Schritt 2.1.1.</li>
		<li>Legen Sie das voll befruchtete Männchen auf den Rücken auf feuchte Papiertücher unter einem Sezierendes Mikroskop.</li>
		<li>Wenn der Experimentator rechtshändig ist, positionieren Sie die Spitze einer P1000 Pipette mit der rechten Hand an der Basis der Kloake.</li>
		<li>Legen Sie den linken Zeigefinger und Daumen der linken Hand 2 x 3 cm rostral auf das Becken. Drücken Sie das Tier vorsichtig, während Sie die Finger in Richtung der Hinterbeine bewegen, um Spermien-Urinproben auszuspülen.</li>
		<li>Sammeln Sie jeden, der aus der Kloake gespült wird, in ein einzelnes Mikrozentrifugenrohr. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um 6 bis 10 Proben zu sammeln.</li>
		<li>Pipette 5,0 l von jeder Probe auf eine Petrischale, um die Qualität des Spermas mit einem invertierten Mikroskop zu überprüfen. HINWEIS: Konzentrierte Spermienproben sind eine milchige weiße Farbe, in der Regel reichen von 5 bis 20 L, und werden in der Regel nach mehreren, höhervolumigen Sperma Urinproben extrahiert extrahiert. Sperma sammelt sich an der Unterseite der Rohre in Proben mit höherem Volumen, wenn sie ungestört gelassen werden. Konzentrierte Proben von gesunden Spermien sind stark motil und verlieren Aktivität, wenn ihre Konzentration abnimmt. Gesunde Männchen können bis zu 50 l konzentrierte Spermien produzieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Weibliche Gamete-Sammlung<ol>
<li>Nach Erhalt und Bestätigung einer gesunden Spermienprobe, befeuchten Sie das HCG-injizierte weibliche Axolotl wie in Schritt 2.1.1.</li>
		<li>Legen Sie das voll befruchtete Weibchen auf feuchte Papiertücher auf ihren Rücken.</li>
		<li>Extrahieren Sie unbefruchtete Eier aus dem Weibchen mit einer Handbewegung ähnlich der in Schritt 2.2.4.</li>
		<li>Sammeln Sie die Eier mit nassen Zangen und übertragen Sie sie in eine 10 cm Petrischale. Behandeln Sie Eier mit bestrahlten Spermien innerhalb von 15 min nach der Sammlung.</li>
	</ol></li>
	<li>Männliche Gametenvorbereitung und In-vitro-Aktivierung<ol>
<li>Verwenden Sie eine P10- oder P20-Pipette, um das Sperma nach oben und unten zu pipette, indem Sie die Klumpen auseinanderbrechen, um eine homogene Suspension zu bilden.</li>
		<li>Ungefährden Prozentsatz der motilen Spermien, indem sie einen 0,5-L-Tropfen unverdünnter Spermiensuspension auf einen Petrischalendeckel oder glasschiebeleiter legen und mit einem invertierten Mikroskop untersuchen.</li>
		<li>Fügen Sie 9,5 l von 0,1x Marcs modifizierter Ringer-Lösung (MMR; Materialtabelle) zu dieser Probe, um eine 20-fache Spermienverdünnung zu machen. Sanfte Pipette nach oben und unten zu mischen.</li>
		<li>Mit einem invertierten Mikroskop zählen Sie das Sperma in drei 1,0 L Tropfen des 20x verdünnten Aliquots auf einer Petrischalenabdeckung oder einem Hämozytometer, um die Spermienkonzentration der unverdünnten Suspension abzuschätzen.</li>
		<li>Bereiten Sie das Sperma für die Bestrahlung vor, indem Sie ein Aliquot der ursprünglichen Spermienprobe auf etwa 80.000 motile Zellen/ml in sterilen 0,1x MMR verdünnen.</li>
		<li>Zählen Sie die Anzahl der Innerhalb der letzten 15 min erhaltenen Eier. Fügen Sie 0,5 l des frisch verdünnten Spermas aus Schritt 2,4,5 pro Ei in eine Petrischale ein. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um diese Aufhängung in eine 1 mm dicke Schicht zu verteilen.</li>
		<li>Mit einem Kunststofflift die Probe 4 cm von den Glühbirnen eines 254 nm Verklinkers abstellen. Die Spermien werden genetisch inaktiviert, indem die Probe mit 800.000 uJ/mm2bestrahlt wird.</li>
		<li>Mit einer P10-Pipette die Suspension auf die unbefruchteten Eier zu pipette, wobei jedes Ei mit 0,25 bis 0,5 L bestrahlten Spermien beschichtet wird. Lassen Sie die Eier bei Raumtemperatur für 30 min sitzen.</li>
		<li>Nach 30 min die Eier mit 0,1x MMR überfluten. Legen Sie die Eier sofort in einen 8-10 °C-Inkubator für Injektionen am nächsten Tag oder bei 18 °C für Injektionen innerhalb von 7 Stunden nach der Aktivierung (hpa).</li>
		<li>Dejelly Haploide mit scharfen Zangen 30 min nach Hydratation. Die Eier sofort in einen 8-10 °C-Inkubator für Injektionen am nächsten Tag oder bei 18 °C für Injektionen am selben Tag legen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Haploid Mutagenese und Wartung
<ol><li>CRISPR/Cas9 Mikroinjektionen<ol>
<li>Entwerfen Sie sgRNAs mit CRISPRscan und synthetisierenSie 26,27.</li>
		<li>Für Multiplex-Mutagenese einen Vorrat von 5 sgRNAs (10 ng/l für jede sgRNA) und Cas9-Protein (1 g/ l) zubereiten. Bereiten Sie eine 100-fache Verdünnung dieses Vorrats (0,1 ng/L pro sgRNA, 10 ng/L Cas9) zur Injektion vor. Für einzelne Gene, hochmutationsreiche Mutagenese, folgen Sie dem zuvor beschriebenen Protokoll28.</li>
		<li>Injizieren Sie haploide Embryonen im Einzelzellstadium 7 hpa, wenn sie bei 18 °C gelagert werden, oder injizieren Sie Embryonen am nächsten Tag im Stadium von 2 x 8 Zellen, wenn sie bei 8 bis 10 °C gelagert werden.</li>
		<li>Übertragen Sie die Embryonen auf 1,0x MMR mit 20% Polysucrose 400.</li>
		<li>Wenn Einzelzelle, injizieren Sie jeden Embryo mit einem 5 nL Tropfen der Injektionslösung (ca. 1/4 Radius der Eizelle), die eine Gesamtmasse von 0,5 pg/sgRNA und 50 pg Cas9-Protein enthält. Wenn multizellulär, verteilen Sie diese Masse, indem Sie kleinere Volumes in mehrere Zellen injizieren.</li>
		<li>Lassen Sie die Embryonen in der Polysukrose 400 für mindestens 4 h und maximal 18 h bei 18 °C heilen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Haploid Embryo Gehäuse<ol>
<li>Übertragen Sie die Embryonen auf 0,1x MMR mit Antibiotikum.</li>
		<li>Beherbergen Sie jeden Embryo in einem individuellen Brunnen einer 24-Well-Platte, da einige absterben oder sich ungewöhnlich entwickeln. Bei 16 bis 18 °C aufbewahren. Niedrigere Temperaturen können bei Bedarf verwendet werden, um die Entwicklung zu verlängern.</li>
		<li>Ersetzen Sie die Medien jeden zweiten Tag durch frische0,1x MMR durch Antibiotika-Antimykotik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Diploid Host Embryo Vorbereitung
<ol><li>Halten Sie Embryonen in der Geleebeschichtung bei 12 bis 16 °C, bis sie Stufe 22 bis 26 erreichen.</li>
	<li>Sammeln Sie die embryonen, die für die Transplantation bereit sind, legen Sie sie in ein Sieb (4 mm Maschenweite), und spülen Sie sie vorsichtig mit 40% Holtfreters Lösung.</li>
	<li>Übertragen Sie die Embryonen in filtersterilisierte 0,1x MMR mit 1,5% Bleichmittel für bis zu 2 min. Tauchen Sie die Embryonen vollständig in die Bleichlösung und wirbeln Sie sie sanft, um sicherzustellen, dass die Geleebeschichtung vollen Kontakt mit der Bleichlösung herstellt, um die Mikroben abzutöten an den Embryonen vorhanden sind.</li>
	<li>Nach 2 min die Bleichlösung, die die Embryonen enthält, mit einem gleichen Volumen von filtersterilisierten 0,1x MMR verdünnen.</li>
	<li>Gießen Sie die Embryonen vorsichtig in ein bleiches Sieb (4 mm Maschenweite) und spülen Sie die Embryonen fünfmal mit filtersterilisiert0,1x MMR.</li>
	<li>Die Embryonen in sterile 10 cm Petrischalen mit 0,1x MMR mit Antibiotika zur Entjellytung (Penicillin 100 Einheiten/ml, Streptomycin 100 g/l, 0,25 g/ml, Gentamicin 25 g/ml) geben.</li>
	<li>Entfernen Sie unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop die Geleemäntel und Vitelline-Membranen von GFP+-Embryonen mit scharfen Zangen (Spitzenmaße 0,05 x 0,01 mm2).</li>
	<li>Übertragen Sie die GFP+ Embryonen auf eine neue Petrischale. Minimieren Sie die Menge an Flüssigkeit, die von der Petrischale übertragen wurde, wo sie dejellied wurden.</li>
	<li>Spülen Sie die GFP+ Wirtsembryonen mit sterilen 0,1x MMR mit Antibiotika vier- bis sechsmal, um Verunreinigungen zu entfernen.</li>
	<li>Die sauberen Embryonen vor der Pfropfung auf 4 °C legen. HINWEIS: Das Abkühlen der Embryonen macht sie steifer und sauberer, das Mesoderm vom Endoderm zu trennen.</li>
</ol>5. Haploid-diploid Chimäre Generation
<ol><li>Chirurgische Schale und Medienzubereitung<ol>
<li>Bereiten Sie sterile chirurgische Operationsschalen vor, indem Sie autoklavierte 2% Agarose in 0,1x MMR in sterile 35 mm leicht griffige Petrischalen gießen. Füllen Sie die Petrischalen auf halbem Weg mit Agarose.</li>
		<li>Nachdem die Agarose abgekühlt ist, verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen 25 mm langen, schrägen Trog in der Agarose zu schneiden, um die Embryonen an Ort und Stelle zu halten.</li>
		<li>Füllen Sie die Schale mit sterilen chirurgischen Medien (0,1x MMR mit Antimykoplasma 2,5 g/ml, Amphotericin B 0,25 g/ml und Ciprofloxacin 10,0 g/ml) und kühlen Sie bei 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embryo-Transplantationsverfahren<ol>
<li>Legen Sie einen gesunden haploiden Spender mit einem oder zwei stufengleichen GFP+ diploiden Wirtsembryonen in den Trog der vorgekühlten Operationsschale, die chirurgische Medien enthält (Abbildung 3). HINWEIS: Führen Sie das Verfahren nach Möglichkeit auf einer Kühlstufe (10 °C oder niedriger) durch.</li>
		<li>Verwenden Sie zwei ultrafeine, autoklavierte Zangen (gerade Spitze, Spitzenmaße 0,05 x 0,02 mm2), um die Ektoderm- und Mesodermenschichten vom Wirt mit der Gliedmaßenknospe in der Nähe der Mitte zu entfernen (Abbildung 4). HINWEIS: Der rechteckige Gewebetransplantatbereich umfasst die Gliedmaßenknospe und erstreckt sich von der neunten Sospe bis zur hinteren Hälfte der Kiemenwölbung, etwa 2 mm, entlang der vorderen hinteren Achse. Entlang der dorsoventralen Achse erstreckt sich der transplantierte Bereich über ca. 1,5 mm, einschließlich der Soden bis knapp über den ventralen Rand der Kiemenwölbung. Der transplantierte Bereich umfasst alle seitlichen Plattenmesoderm und die seitlichen Hälften der Sos, ohne die zugrunde liegende Endoderm zu stören. Weitere Informationen finden Sie in Abbildung 4 und im dazugehörigen Video.</li>
		<li>Legen Sie das Wirtsgewebe beiseite und entfernen Sie ein gleichwertig großes Gewebeblatt aus dem haploiden Spender mit den gleichen Methoden.</li>
		<li>Legen Sie das haploide Spendergewebeblatt auf den entsprechenden Bereich des Spenderembryons.</li>
		<li>Sichern Sie das Gewebe, indem Sie es mit einer autoklavierten, rechteckigen Glasscherbe aus einem zerkleinerten Mikroskop bedecken Glas bedecken und sanft in den Wirtsembryonkörper drücken.</li>
		<li>Drehen Sie den haploiden Spender-Embryo auf seine andere Seite, um die Gliedmaßenknospe für den zweiten Wirtsembryon zu ernten. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.2 bis 5.2.5.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig das verbleibende überschüssige Wirtsgewebe und den Spenderembryon aus der Schale.</li>
		<li>Lassen Sie die Transplantate mit den Glasscherben an Ort und Stelle für 60 bis 75 min, überprüfen Sie alle 20 min, um sicherzustellen, dass das Glas nicht abgerutscht ist.</li>
		<li>Nachdem die Gewebetransplantate vollständig haften, verwenden Sie die Zange, um die Glasscherben ankert langsam abzuziehen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chimäre Wartung<ol>
<li>Übertragen Sie die transplantierten Embryonen auf frische chirurgische Medien und halten Sie sie über Nacht bei 8 bis 12 °C, um zu heilen. Individuell hausierte embryonale Embryonen in 12 oder 24-Well-Platten.</li>
		<li>Übertragen Sie die transplantierten Embryonen nach 36 bis 48 h auf steriles 0,1x MMR-Antimykotikum. Die starken Antibiotika in den chirurgischen Medien verursachen Toxizität bei transplantierten Embryonen nach 3 Tagen.</li>
		<li>Ersetzen Sie die Medien alle 2 bis 3 Tage durch frische 0,1x MMR und Antibiotika.</li>
		<li>Bewahren Sie die transplantierten Embryonen bei 18 °C auf, bis sie28füttern können.</li>
		<li>Nach 1 bis 2 Monaten Entwicklung und Pflege können haploide Gliedmaßen mit einem fluoreszierenden Dissektionsmikroskop auf Reinheit des Transplantats bewertet werden. HINWEIS: Das Vorhandensein von nicht-neuralen oder nicht-Blut-Wirt-abgeleiteten GFP-Gewebe in Gliedmaßen ist ein Indikator für unreine Transplantation und ist oft mit abnormaler Gliedmaßenentwicklung verbunden. Diese Tiere sollten von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Es gibt einige kritische Schritte in unserem Protokoll zur Erzeugung von haploid-diploiden Chimären, die der Betriebstechniker für konsistente Pfropfergebnisse berücksichtigen sollte.
Der wahrscheinlichste Grund für haploid-Generation zu scheitern ist aufgrund schlechter In-vitro-AktivierungBedingungen. Die richtigen Mengen an motilen Spermien müssen verwendet werden, um Eier zu aktivieren. Um die Beweglichkeit zu verlängern, sollten Spermienproben immer bei 4 °C gehalten werden. Bevor Sie ein...

Historisch gesehen war die embryonale Gewebetransplantation in Amphibien eine wichtige Technik zur Erforschung grundlegender Mechanismen der Entwicklungsbiologie und Regeneration. Das Axolotl, eine Salamanderart, besitzt eine beeindruckende Fähigkeit, Gewebe und komplexe Strukturen wie Gliedmaßen und Organe nach Verletzungen oder Amputationen zu regenerieren. Ebenso beeindruckend können sie ohne Abstoßung Gewebetransplantate von anderen Individuen in embryonalen, juvenilen und erwachsenen Stadien1,2,3erhalten. Regionen von Embryonen, die ganze Strukturen wie Gliedmaßen, Schwänze, Augen und Köpfe produzieren, und spezifischere Gewebe, wie Neuroektoderm und Soden, können zwischen Embryonen gepfropft werden, um chimäre Tiere zu produzieren1,2,4,5,6. Seit fast einem Jahrhundert liefern Studien an solchen chimertieren den entscheidenden Einblicken in Regeneration, Gewebedifferenzierung, Größenkontrolle und Musterung1,7,8.
In den letzten zehn Jahren haben zahlreiche transkriptionelle Studien an regenerierenden Geweben Einblicke in die genetischen Programme der Salamanderregeneration9,10,11,12,13. Diese Studien haben zu einer wachsenden Liste von Kandidatengenen hinzugefügt, die bis heute im Kontext der Regeneration weitgehend uncharakterisiert sind. Gezielte Mutagenesetechniken wie CRISPR/Cas ermöglichen nun die Untersuchung solcher Gene, und solche genetischen Ansätze werden durch die kürzliche Sequenzierung und Montage des großen Axolotl-Genoms14,15,16erheblich erleichtert.
Wir versuchten, Techniken zu entwickeln, die klassische Entwicklungsbiologie mit neuer Gentechnologie koppelten, um die Mechanismen der Regeneration zu sezieren. Methoden zur Erzeugung haploider Embryonen von Axolotls und anderen Salamandern sind seit Jahrzehnten etabliert17. Während diese Techniken seit langem als Vorteile von Salamandern als genetische Modellorganismen18bezeichnet werden, haben nur wenige nachfolgende genetische Studien haploide Tiere aufgenommen. Wir verwenden In-vitro-Aktivierung im Axolotl, um haploide Embryonen zu produzieren, die als Gewebespender für die Transplantation dienen19. Mit Embryonen, die fluoreszierende genetische Marker tragen, haben wir zuverlässige Methoden zur Erzeugung von Gliedmaßen entwickelt, die fast ausschließlich aus Spendergeweben gewonnen wurden (Abbildung 1A). Durch die Kombination dieser beiden Techniken haben wir die späte embryonale Letalität im Zusammenhang mit der Haploidie umgangen, die die Produktion voll entwickelter, transplantierter haploider Gliedmaßen ermöglicht (Abbildung 1B, Abbildung 1B"und Abbildung 2).
Durch die Durchführung von CRISPR/Cas-vermittelter Mutagenese in haploiden Embryonen vor der Transplantation zur Herstellung von chimerischen Axolotlen mit mutierten haploiden Gliedmaßen können wir die Genfunktion speziell im Kontext der Gliedmaßenentwicklung und -regeneration untersuchen. Dies ermöglicht die Rettung von Gliedmaßen von potenziell embryonal-tödlichen mutierten Phänotypen. Während CRISPR/Cas Mikroinjektion Tiere erzeugen kann, die stark mutiert sind, sind solche Tiere in der Regel sehr mosaikartig, mit einem gewissen Grad an Retention von Wildtyp-Allelen und einer Vielzahl von unterschiedlichen Mutationen an den Zielstellen14,20. CRISPR-basierte Mutagenese in haploiden Zellen erhöht die Penetranz einzelner Allelverlust-der-Funktionsmutationen, da sie nicht durch zurückgehaltene Wildtyp-Allele maskiert werden können. Aus diesem Grund wird DAS CRISPR-basierte Screening in haploiden Zelllinien zunehmend zur Untersuchung der genetischen Grundlagen vieler zellulärer Prozesse21,22,23verwendet. Durch die Kombination von CRISPR-basierter Linienverfolgung mit unseren haploiden Gliedmaßenknospen-Pfropfprotokollen kann der hier beschriebene Ansatz als Plattform für haploide genetische Screens bei lebenden Tieren dienen20.

<table><tbody><tr><td>#55 Dumont Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-1</td><td>Nur Dumostar Material verwenden (autoklavierbar)</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-20ML</td><td>20 mL</td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400 (Polysaccharose 400)</td><td>bioworld</td><td>40600032-3</td><td>Ficoll 400</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1914-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Heiz-/Kühlinkubator</td><td>RevSci</td><td>RS-IF-233</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Choriongonadotropin</td><td>Merk</td><td></td><td>Chorulon</td></tr><tr><td>Megascript T7 Transkriptionskit</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1334</td><td>40 Reaktionen</td></tr><tr><td>Miroskop Kühlstufe</td><td>Brook Industries</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Custom NLS Cas9 Protein</td><td>PNAbio</td><td>CP01-200</td><td>4 Fläschchen mit 50 & Mikro; g Protein pro</td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpt-1</td><td>Behandlungslevel</td></tr><tr><td>Rezepte</td>1,0x Marc's modifizierte Ringer-Lösung <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(MMR)</td><td></td><td></td><td>0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7,8), ph 7,4</td></tr><tr><td>40% Holtfreter-Lösung</td><td></td><td></td><td>20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH bis 7,4</td></tr></tbody></table>

generation von chimeric axolotls mit mutant haploid limbs durch embryonale grafting

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Eine wachsende Reihe von genetischen Techniken und Ressourcen ermöglichen es Forschern, die molekularen Ursprünge der Fähigkeit einiger Salamanderarten, wie Axolotls, ganze Gliedmaßen als Erwachsene zu regenerieren, zu erforschen. Hier skizzieren wir Techniken zur Erzeugung von chimerischen Axolotls mit Cas9-mutagenisierten haploiden Vorderbeinen, die zur Erforschung der Genfunktion und der Genauigkeit der Gliedmaßenregeneration verwendet werden können. Wir kombinieren mehrere embryologische und genetische Techniken, einschließlich der haploiden Erzeugung mittels In-vitro-Aktivierung, CRISPR/Cas9-Mutagenese und Gewebetransplantation in einem Protokoll, um ein einzigartiges System für haploidgenetisches Screening in einem Modellorganismus der Regeneration zu produzieren. Diese Strategie reduziert die Anzahl der Tiere, den Raum und den Zeitaufwand für die funktionelle Analyse von Genen bei der Regeneration der Gliedmaßen. Dies ermöglicht auch die Untersuchung von regenerationsspezifischen Funktionen von Genen, die für andere wesentliche Prozesse wie Organogenese, Gewebemorphogenese und andere wesentliche embryonale Prozesse erforderlich sein können. Die hier beschriebene Methode ist eine einzigartige Plattform für die Durchführung haploider genetischer Screenings in einem Wirbeltiermodellsystem.

Die Entwicklung von haploiden Embryonen kann von diploiden Embryonen durch ihren "haploiden Syndrom"-Phänotyp29unterschieden werden. Im Transplantatstadium weisen haploide Embryonen eine reduzierte Krümmung entlang der vorderen-hinteren Achse und ein unvollständiges Gehäuse des Dottersteckers auf (Abbildung 3A). Ein Fluoreszenzmikroskop kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass haploide Embryonen frei von väterli...

Dieses Ziel dieses Protokolls ist es, chimäre Axolotle mit haploiden Vorderbeinen aus Cas9-mutagenisiertem Spendergewebe unter Verwendung embryonaler Gewebetransplantationstechniken zu produzieren.

Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Produktion von mutagenisierten haploiden Gliedmaßen, die für das genetische Screening im Axolotl verwendet werden können. Bei Haploiden kann selbst eine niedere Mutagenese den Verlust von Funktionsphänotypen innerhalb von Zellen verursachen. Diese Transplantationstechnik kann auch zur Rettung embryonaler tödlicher Phänotypen eingesetzt werden.Diese Methode kann verwendet werden, um die Regeneration bei allen Amphibienarten zu untersuchen, die für In-vitro-Fertilisation und Transplantation geeignet sind. Bevor wir haploide Embryonen als Spender verwenden, empfehlen wir, den Erfolg von Transplantaten zwischen GFP-positiven und negativen diploiden Embryonen zu praktizieren und zu bestätigen. Für die Vorbereitung weiblicher Gamete-Spender, anästhesieren Sie ein geschlechtsreifes weißes oder weißes RFP-Weibchen-Axolotl, um als Gamete-Spender zu dienen.Nachdem Sie einen Mangel an Reaktion auf Schmerzsimulation bestätigt haben, verwenden Sie eine 30 Gauge Insulinspritze, um 0,15 Milliliter humanes Choriongonadotropin in die Muskulatur dorsal in die Hinterbeinige zu injizieren. Setzen Sie die Spritze in einem 45-Grad-Winkel zur Mittellinie ein, um den Kontakt mit dem Rückenmark zu vermeiden. Das injizierte Tier in eine frische 40%Holtfreter-Lösung geben und das Axolotl 48 Stunden lang in einen acht bis zwölf Grad Celsius Kühlschrank geben.Dann kehren Sie das Weibchen auf Raumtemperatur zurück. Während das Weibchen Eier legt, legen Sie ein voll beseelisiertes Männchen in die Rückenlage auf feuchte Papiertücher unter einem Sezierendes Mikroskop und positionieren Sie die Spitze einer P1000 Pipette an der Basis der Kloake mit der dominanten Hand. Legen Sie den anderen Zeigefinger und Daumen zwei bis drei Zentimeter rostral in das Becken und drücken Sie das Tier sanft, während Sie die Finger in Richtung der Hinterbeine bewegen, um die Spermien-Urinproben, die jede Probe sammeln, in ein neues Mikrozentrifugenrohr zu spülen.Dann übertragen Sie fünf Mikroliter aus jeder Probe in eine Petrischale, um die Qualität des Spermas mit einem invertierten Mikroskop zu überprüfen. Nach dem Zählen das Sperma auf eine Konzentration von acht mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Milliliter in 0,1X sterilem MMR verdünnen und 0,5 Mikroliter Spermien pro Ei in eine neue Petrischale übertragen. Dann verwenden Sie die Pipettenspitze, um die Suspension auf eine ein Millimeter dicke Schicht zu verteilen und die Probe mit einem Kunststofflift vier Zentimeter von den Glühbirnen eines 254 Nanometer-Verknüppels für die Bestrahlung bei achtmal 10 bis fünf Mikrojoule pro Millimeter quadratisch zu platzieren.Nach dem Sammeln einer gesunden Spermienprobe, legen Sie das Weibchen in der Supine-Position auf einen Stapel von feuchten Papiertüchern und verwenden Sie eine ähnliche Spülbewegung, um unbefruchtete Eier aus dem weiblichen Axolotl zu extrahieren. Dann verwenden Sie nasse Zange, um die Eier in eine 10 Zentimeter Petrischale zu übertragen. Verwenden Sie innerhalb von 15 Minuten nach der Entnahme eine P10-Pipette, um das bestrahlte Sperma auf die unbefruchteten Eier zu verteilen, die jedes Ei mit 0,25 bis 0,5 Mikroliter inaktivierten Spermien beschichten.Nachdem Sie die Eier 30 Minuten bei Raumtemperatur sitzen lassen, überfluten Sie die Eier mit 0,1X MMR. Dreißig Minuten nach der Hydratation, verwenden Scharfe Zange, um die Eier zu entjelly und legen Sie die Eier bei 18 Grad Celsius für Mikroinjektion innerhalb von sieben Stunden. Um eine haploid-diploide Chimäre zu erzeugen, platzieren Sie einen gesunden haploiden Spender mit einem oder zwei Stufen abgestimmten GFP-positiven diploiden Wirtsembryonen in den Trog einer vorgekühlten Operationsschale, die chirurgisches Medium auf einem 10 Grad Celsius oder niedrigeren Kühlstadium enthält.Verwenden Sie zwei ultrafeine autoklavierte gerade Spitzenzange, um die gesamte Gliedmaßenknospe und die umgebenden Ektoderm- und Mesodermgewebeschichten zu entfernen und das Wirtsgewebe beiseite zu legen. Entfernen Sie eine gleichwertig große Gewebescheide vom haploiden Spender und legen Sie die haploide Spendergewebescheide auf den entsprechenden Bereich des Wirtsembryons. Sichern Sie das Gewebe mit einer autoklavierten rechteckigen Glasscherbe aus einem zerkleinerten Mikroskop-Coverglas und drücken Sie das Gewebe vorsichtig in den Körper des Wirtsembryons.Lassen Sie den Anker für 60 bis 75 Minuten an Ort und Stelle, um alle 20 Minuten zu überprüfen, ob das Glas nicht gerutscht ist, bevor Sie die Zange verwenden, um das Deckglasfragment abzublättern. Übertragen Sie die transplantierten Embryonen in ein frisches chirurgisches Medium, so dass sie über Nacht bei acht bis 12 Grad Celsius heilen können, bevor sie die transplantierten Embryonen einzeln in 12 oder 24-Well-Platten beherbergen. 38,7 % der Eizellen entwickelten sich zu normal entwickelten haploiden Embryonen.Im Transplantatstadium weisen haploide Embryonen eine reduzierte Krümmung entlang der vorderen-hinteren Achse und ein unvollständiges Gehäuse des Dottersteckers auf. Darüber hinaus kann ein Fluoreszenzmikroskop verwendet werden, um zu bestätigen, dass die haploiden Embryonen frei von väterlicher GFP-Expression sind. Gescheiterte und unreine Transplantate produzieren eine Vielzahl von Phänotypen.Wenn die Transplantate sauber und normal entwickelt sind, sollte die GFP-Expression in erster Linie auf den Brachialplexus beschränkt werden, das neuronale Netzwerk, das vom Wirtsrückenmark abgeleitet wird. Punctate GFP-Expression ist auch in einzelnen Zellen vorhanden, die sensorische Neuronen in blutabgeleiteten Wirtszellen zu sein scheinen, die in die sich entwickelnde Gliedmaße wandern. Wenn RFP-positive Spender verwendet werden, weisen haploide Transplantat-Glieder einen universellen Ausdruck von RFP auf.Während der gesamten Entwicklung sind nicht-mutagenisierte haploide Gliedmaßen deutlich kürzer als die gegnerischen diploiden Vorderbeine bei chimarischem Tier. Nicht-mutagenisierte haploide Gliedmaßen regenerieren sich vollständig, obwohl sie eine leichte Verzögerung beim Erreichen des digitalen Auswuchsstadiums im Vergleich zu Diploiden zeigen. Denken Sie daran, sterile Technik zu verwenden und vollständig entfernen und ersetzen Sie die vollen Mesoderm und Ektoderm Gewebeschichten aus dem embryonalen Wirt, um eine sauber transplantierte Gliedmaße zu produzieren.Mutante Gliedmaßen können amputiert und für Regenerations-Phänotypen bewertet werden. Mutante Allele können mit der Sequenzierung der nächsten Generation quantifiziert werden. In Kombination mit CRISPR-Cas9 Mutagenese hat unsere Pfropftechnik es uns ermöglicht, einen negativen Selektionsschirm von gezielten Genen bei der Regeneration haploider Gliedmaßen durchzuführen.

generation-chimeric-axolotls-with-mutant-haploid-limbs-through

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für gezielte chimären Zebrafischembryonen durch die Transplantation erzeugt an der Blastula oder Gastrula-Stadium.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

Zebrafisch-Transplantation ermöglicht die Kombination von Genetik und Embryologie an gewebespezifischen Chimären zu erzeugen. Dieses Video zeigt Gastrula inszeniert zelltransplantationen, dass es unserem Labor auf den Rollen von astroglialen Bevölkerung und spezifische Anleitungen Cues während Kommissur Bildung im Vorderhirn zu untersuchen.

Tissue Gezielte Embryonale Chimären: Zebrafisch Gastrula Cell Transplantation

Aufgrund der harten und weichen Chorion Embryonen, die Manipulation von Embryonen medaka ist mehr als in Zebrafisch beteiligt. Dieses Video zeigt Schritt-für-Schritt-Anleitungen, wie Sie medaka Embryonen zu manipulieren, einschließlich dechorionation, Montage in Agarose für die Bildgebung und-Transplantation für die Herstellung von Chimären. Diese Verfahren sind unerlässlich, um medaka und Zebrafisch in einem Labor zu verwenden, um vollen Nutzen aus ihren komplementären Funktionen für die...

Dechorionation von Medaka Embryonen und Zell-Transplantation für die Erzeugung von Chimären

Durch das Pfropfen von Kügelchen, die mit Wachstumsfaktoren oder spezifischen Inhibitoren von Signalwegen getränkt sind, in sich entwickelnde Embryonen ist es möglich, ihre Wirkung direkt in vivo zu testen. Bei diesem Protokoll werden Kügelchen in die Knospe der Gliedmaßen transplantiert, um die Auswirkungen dieser Moleküle auf die Genexpression und Signaltransduktion zu bestimmen.

Pfropfen von Beads in die Entwicklung von Hühnerembryo-Glieder zu identifizieren Signaltransduktionswegen Beeinflussung der Genexpression

Gene überlebensnotwendig stellen technische Hürden für die Erstellung von mutierter Linien. Leap Frogging umgeht Letalität durch die Kombination von Genom-Bearbeitung mit Keim Urzelle Transplantation Wildtyp Tiere Keimbahn-Mutationen zu erstellen. Leap Frogging erlaubt auch die effiziente Erzeugung von homozygot null Mutanten in der F-1 -Generation. Hier wird die Transplantation Schritt demonstriert.

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

Hier präsentieren wir Ihnen Echokardiographie Protokolle für zwei- und dreidimensionale Bilderfassung des schlagenden Herzens der Axolotl Salamander (Z.B. geschieht), ein Modell-Arten im Herzen Regeneration. Diese Methoden ermöglichen längs-Beurteilung der Herzfunktion mit einer hohen räumlich-zeitliche Auflösung.

2D und 3D Echokardiographie in der Axolotl (Z.B. geschieht)

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung zeit- und raumbeschränkter Gen-Knock-out in Axolotl-Rückenmarksen vorgestellt, indem der CAS9-gRNA-Komplex in den Zentralkanal des Rückenmarks injiziert wird, gefolgt von Elektroporation.

Direkter Gene Knock-out von Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Dieser Artikel beschreibt, wie man eine chirurgische Methode durchführt, um die Bildung von Wundepidermis während der Regeneration der Axolotlgliedmaßen zu hemmen, indem sofort die Haut in voller Dicke über die Amputationsebene näht wird. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, die funktionellen Rollen der Wundepidermis in den frühen Stadien der Regeneration der Gliedmaßen zu untersuchen.

Hemmung der Wundepidermisbildung durch vollständige Hautlappenchirurgie während der Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen

Rekombinante Gliedmaßen sind ein leistungsfähiges experimentelles Modell, das es ermöglicht, den Prozess der Zelldifferenzierung und die Erzeugung von Mustern unter dem Einfluss embryonaler Signale zu untersuchen. Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung rekombinanter Gliedmaßen mit Mesodermalzellen von Hühnergliedmaßen vor, die an andere Zelltypen angepasst werden können, die aus verschiedenen Organismen gewonnen werden.

Chicken Recombinant Limbs Assay, um Morphogenese, Musterung und frühe Schritte in der Zelldifferenzierung zu verstehen

Es wird ein Protokoll für die femorale Osteotomie unter Verwendung der internen Plattenfixation bei reifen Axolotln vorgestellt. Mit dem Verfahren können vergleichende Studien zur Regeneration und Frakturheilung von Gliedmaßen bei aquatischen Amphibien durchgeführt werden.

Stabilisierung einer Femurosteotomie mit einer Plattenfixation bei Ambystoma mexicanum

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Axolotl-Gewebe für die Rasterkraftmikroskopie (AFM) vorbereitet und Indentationsmessungen in intaktem und regenerierendem Gliedmaßenknorpel durchgeführt werden können.

Rasterkraftmikroskopische Messungen von Knorpel in intakten und regenerierenden Axolotl-Gliedmaßen

Erfahren Sie, wie Sie chimäre Axolotls mit mutagenisierten haploiden Gliedmaßen durch embryonales Grafting erzeugen. Diese Methode ermöglicht genetische Screening-Studien zur Untersuchung von Regenerationsmechanismen.

Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting

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