3D-Bildgebung von Weichgewebeproben mit einer Röntgen-spezifischen Färbemethode und nanoskopischer Computertomographie
24. Oktober 2019
Ein Protokoll zur 3D-Visualisierung mikroskopischer Gewebestrukturen mit Hilfe einer Röntgen-spezifischen Färbemethode für die Röntgen-Computertomographie wird vorgestellt.
Unser neues Protokoll ermöglicht es uns tatsächlich, zelluläre Strukturen in 3D mithilfe von Röntgen-Computertomographie zu visualisieren. Und wir tun dies, indem wir Gewebe mit Eosin färben und so das Zytoplasma sichtbar machen. Neben medizinischen Anwendungen und Forschung denken wir auch, dass unsere Methode in der Biologie angewendet werden kann, wie zum Beispiel in der Zoologieforschung oder der Entwicklungsbiologie.
Die Technik ist relativ unkompliziert, sehr schnell und auch für größere Gewebeproben geeignet. Wir denken, dass unser Ansatz in Kombination mit Röntgen-Mikro-Computertomographie in den klinischen Workflow integriert werden kann und dann Pathologen tatsächlich helfen kann, bessere Entscheidungen zu treffen. Beginnen Sie mit der Fixierung der Weichteilproben.
Füllen Sie ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit einer fixativen Lösung, die 9,5 Milliliter 4%Formaldehyd und 0,5 Milliliter Eisessigsäure enthält. Fügen Sie die Weichteilprobe in das Zentrifugenrohr und kühlen Sie sie für 24 bis 72 Stunden. Nach der Kühlung die Weichteilprobe mit DPBS-Lösung eine Stunde lang waschen.
Dann färben Sie die Probe, indem Sie sie in zwei Milliliter Eosin Y Färbung Lösung und inkubieren Sie es auf einer horizontalen Schüttelplatte für 24 Stunden. Am nächsten Tag die Weichteilprobe vorsichtig aus dem Probenbehälter nehmen und überschüssiges Färbemittel mit Zellulosegewebepapier entfernen. Legen Sie es in einen konischen Behälter über einer Ethanoldampfphase zur Lagerung und weiterverwendung.
Bereiten Sie einen geeigneten Probenhalter vor, um die Weichteilprobe gemäß den Anweisungen des Manuskripts zu montieren, und stellen Sie eine enge Passform sicher, um zu verhindern, dass sich die Probe während der Röntgen-CT-Messungen bewegt. Sobald der Klebstoff gehärtet ist und der Probenhalter einsatzbereit ist, übertragen Sie die Mausniere in das intakte Zentrifugenrohr, das ein paar Tropfen 70% Ethanol an der Unterseite hält. Legen Sie die montierte Probe in den Röntgen-CT-Scanner.
Nachdem Sie das Beispiel sorgfältig ausgerichtet haben, wählen Sie Erfassungsparameter für die beste Bildqualität aus. Für die vorgestellten Mikro-CT-Daten erfassen Sie den Scan bei einer Spitzenspannung von 50 Kilovolt und einem Strom von 3,5 Watt mit 1601 Projektionen, die gleichmäßig über 360 Grad verteilt sind. Verwenden Sie dann die Micro-CT-Daten aus dem Übersichtsscan, um den Interessenbereich für den hochauflösenden CT-Scan auszuwählen.
Bereiten Sie die Interessensmengen der Weichteilprobe vor, indem Sie sie mit einem Skalpell und einem Stereomikroskop in sehr kleine Stücke von etwa 0,5 Millimeter Kantenlänge schneiden. Wenn Sie eine Mausniere verwenden, schneiden Sie sie entlang der längsten Achse in zwei Hälften. Nehmen Sie die eine Hälfte und bereiten Sie verschiedene anatomische Regionen wie eine Nierenrinde und renale Medulla.
Die kleinen Stücke zur Austrocknung auf eine neue Petrischale übertragen. Dehydrieren Sie die Proben mit einer Reihe von Ethanol-Lösungen nach Manuskriptrichtungen, die jeden Dehydrierungsschritt für eine Stunde durchführen. Übertragen Sie die dehydrierten Proben in die mikroporöse Kapsel und schließen Sie sie.
Halten Sie die Proben jederzeit mit 100% Ethanol in Kontakt. Dann kritischen Punkt trocknen die kleinen Gewebestücke. Sobald die Gewebeproben vorbereitet sind, bewahren Sie sie vor der weiteren Verwendung in einer neuen Petrischale in einem Trockenhaus auf.
Montieren Sie die Gewebeteile an einem geeigneten Probenhalter, um eine enge Passform zu gewährleisten. Für eine Mausniere überkleben Sie die Stücke mit einem Stereomikroskop an einen Probenhalter. Wählen Sie nach sorgfältiger Ausrichtung der Probe Erfassungsparameter für die beste Bildqualität aus.
Für die vorgestellten Nano-CT-Daten erfassen Sie Projektionen mit einer Spitzenspannung von 60 Kilovolt mit 1599 Projektionen, die gleichmäßig über 360 Grad und eine Voxelgröße von etwa 400 Nanometern verteilt sind. Dieses Protokoll wurde zur 3D-Visualisierung mikroskopischer Gewebestrukturen einer Mausniere verwendet. Mikro-CT-Messungen mit niedriger Auflösung ermöglichten einen Überblick über das gesamte Organ und halfen, Interessensmengen für hochauflösende Messungen zu identifizieren.
Die gleiche Mausniere wurde verwendet, um eine hochauflösende Mikro-CT-Daten zu erhalten. Eine detailliertere Sicht auf die anatomischen Strukturen wie der Kortex, äußere Medulla und innere Medulla unter anderem erreicht. Ein Volumen von Interesse Rendering zeigt die Medulla-Region und einen virtuellen Abschnitt durch das Schiff.
Der Nano-CT wurde verwendet, um eine detaillierte Ansicht der Nierenprobe auf zellulärer Ebene zu erhalten. Ein kleines Stück Gewebe aus der ganzen Mausniere wurde verwendet, um die dick aufsteigenden Gliedmaßen der Schleife von Henle mit einer Voxelgröße von etwa 400 Nanometern abzubilden. Eine vergleichende Studie wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Nano-CT vollständig mit der Histopathologie kompatibel ist.
Der multimodale Bildgebungsansatz bestätigte die mit beiden Methoden erzielten Ergebnisse. Während des Inkubationsschritts ist es entscheidend, dass die Probe vollständig von der Färbelösung umgeben ist. Auch bei der Durchführung von CT-Röntgenaufnahmen ist es am wichtigsten, die Probenstabilität bei der Datenerfassung zu gewährleisten.
Die mit unserem Protokoll analysierten Weichteilproben können mit hilfe der standardhistologischen Technik wie der Gegenfärbung von Hämatoxylin weiter analysiert werden. Unser Färbeprotokoll wird wesentlich zur Weiterentwicklung der 3D-Röntgenhistologie beitragen. Die medizinische Forschung wird insbesondere von dieser zerstörungsfreien 3D-Bildgebungstechnik profitieren.
Übersicht
Dieser Artikel präsentiert ein Protokoll für die 3D-Visualisierung von Zellstrukturen mittels Röntgencomputertomographie und Eosin-Färbung. Die Methode ist in verschiedenen biologischen Bereichen anwendbar und zielt darauf ab, klinische Arbeitsabläufe zu verbessern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Medizinische Bildgebung
Hintergrund
- Die Röntgencomputertomographie ermöglicht eine detaillierte Darstellung von Gewebestrukturen.
- Die Eosin-Färbung erhöht die Sichtbarkeit von Zellkomponenten.
- Die Technik eignet sich für größere Gewebeproben.
- Potenzielle Anwendungen erstrecken sich auf die Zoologie und Entwicklungsbiologie.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls für die 3D-Visualisierung von Gewebestrukturen.
- Integration dieser Methode in klinische Arbeitsabläufe zur verbesserten Pathologie.
- Nachweis der Kompatibilität von Röntgenbildgebung mit Histopathologie.
Verwendete Methoden
- Fixierung von Weichgewebeproben in Formaldehyd und Essigsäure.
- Färbung mit Eosin Y Lösung für zelluläre Sichtbarkeit.
- Mikro-CT-Scanning für niedrig- und hochauflösende Bildgebung.
- Vorbereitung von Gewebeproben für detaillierte Bildgebung auf zellulärer Ebene.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von Mausnierenstrukturen in 3D.
- Identifikation von Regionen von Interesse für hochauflösende Scans.
- Kompatibilität von Nano-CT mit histopathologischen Techniken bestätigt.
- Methode verbessert das Verständnis der Gewebearchitektur und Pathologie.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll treibt die 3D-Röntgenhistologie erheblich voran.
- Es bietet eine zerstörungsfreie Bildgebungstechnik, die für die medizinische Forschung vorteilhaft ist.
- Zukünftige Anwendungen können die diagnostische Genauigkeit in der Pathologie verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
High-resolution 3D imaging of soft-tissue samples using X-ray-specific staining and nanoscopic computed tomography enables detailed morphological characterization critical for early discovery and translational research. This approach bridges the gap between traditional histology and advanced imaging, supporting more predictive and risk-adjusted decisions in biopharma R&D. The method's compatibility with standard histopathology ensures continuity across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables 3D visualization of cellular and subcellular structures for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by revealing tissue architecture in situ.
- Facilitates hypothesis testing through direct morphological assessment.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream quantitative imaging workflows.
- Improves assay reproducibility by standardizing sample preparation and imaging conditions.
- Enables identification and selection of regions of interest for high-resolution analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns 3D imaging outputs with histopathological standards for translational continuity.
- Provides nondestructive assessment of tissue morphology, supporting biomarker discovery.
- Facilitates risk-adjusted advancement by confirming structural endpoints in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates from early discovery through preclinical validation, enabling seamless transition between morphological assessment and functional studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven exploration of tissue structure and cellular organization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative 3D data for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides high-resolution volumetric datasets for statistical and morphological evaluation.
- Translational Research: Ensures compatibility with standard histology for biomarker and endpoint alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable imaging capability for diverse tissue types and research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in tissue-based target validation.
- Operational Value: Streamlines sample preparation and imaging for high-throughput, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making by providing robust morphological evidence.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, staining, and advanced imaging instrumentation.
- Demands access to microCT and nanoCT platforms with precise sample alignment capabilities.
- Necessitates standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various soft-tissue types with protocol optimization as needed.
- Sample stability and complete staining coverage are critical for data quality.
