Name: Demonstrieren einer linearen Beziehung zwischen vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor und Luteinizing Hormone in Nieren-Cortex-Extrakte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Lernen Sie eine ELISA-basierte Methode zur Korrelation von VEGF und LH in Nierenkortex-Extrakten von Rindern und Schweinen. Diese Technik ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse für die Nierenphysiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Scholl es Slaughterhouse (Blissfield, MI) für die Bereitstellung der Rinder- und Schweinenieren. Für diese Studie wurden keine Fördermittel in Höhe von zuschüssen mitteln verwendet.

Für diese Studie wurden keine lebenden oder experimentellen Tiere verwendet.
1. Gewebehandhabung
<ol><li>Beschaffen Sie Rinder und Schweine ganze Nieren unmittelbar nach der Schlachtung aus einem Schlachthof. Transport auf Eis zum Labor.</li>
	<li>Bei der Ankunft im Labor die Nieren mit 50 ml eiskaltem Phosphat gepufferter Saline (PBS) abspülen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um Blut vollständig zu entfernen.</li>
	<li>Halten Sie die Nieren bis zur weiteren Extraktion auf Eis (oder gekühlt).</li>
</ol>2. Dissektion der Nieren
<ol><li>Verwenden Sie sterile Schere, Zangen, ein Messer und Petrischalen, um die Nieren zu sezieren und die erforderliche Gewebeportion zu verbrauchen.</li>
	<li>Bereiten Sie RIPA-Lysepuffer vor der Nierensektion vor. 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH = 8,0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), 10% Natriumdesoxycholat und 10% SDS in doppelt destilliertem Wasser auflösen, dann gründlich mischen. Kühlen Sie den RIPA-Lysepuffer, wenn er nicht verwendet wird.</li>
	<li>Schneiden Sie die Niere vorsichtig in die Hälfte (sagittale Ebene) und schneiden Sie ein Stück Gewebe (50-70 mm2) aus dem Kortexbereich in der Mitte der Niere (mit einem Gewicht von 80-100 mg durch Nassgewicht).</li>
	<li>Den Gewebeblock mit einem Messer in kleine Stücke zerkleinern, um den Homogenisierungsprozess zu unterstützen.</li>
	<li>Nach dem Zerminieren des Gewebes in ein Mikrofugenrohr mit 1 ml eiskaltem 1x RIPA-Lyseextraktionspuffer. Legen Sie die Rohre bis zur weiteren Extraktion in Eis.</li>
</ol>3. Gewebehomogenisierung
<ol><li>Beschriften Sie die Mikrofugenröhrchen mit spezifischen Probendetails für die Gewebeüberstandsammlung.</li>
	<li>Mit einem Handhomogenisator mit einer sterilen Sonde, dann homogenisieren Sie das Gewebe für 1-2 min bei kalten Bedingungen (Proben auf Eiskübel), bis keine Teile von Geweben sichtbar sind.</li>
	<li>Die Gewebeextrakte sofort zur Zentrifugierung in der gekühlten Zentrifuge bei 9.600 x g für 5 min bei 4 °C unterziehen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf den Eiskübel.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand in einem neuen beschrifteten Mikrofugenrohr und lagern Sie auf Eis. Entsorgen Sie das Pellet.</li>
	<li>Bereiten Sie separate Aliquots der Überstande für LH- und VEGF-A-Enzym-linked Immunosorbent Assays (ELISA) bzw. die gesamte Proteinanalyse vor, um Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.</li>
</ol>4. Rinder und Schweine LH ELISA Assay
<ol><li>Bewahren Sie alle ELISA-Assay-Komponenten im handelsüblichen luteinisierenden Hormon (LH) ELISA-Kit (siehe Materialtabelle) bei 2-8 °C auf. Dazu gehören Antikörper, HRP-Konjugat, Assayplatte (96 gut), Kalibratoren, Waschpuffer (20x Konzentrat), Substrat A, Substrat B und Stop-Lösung. Bereiten Sie alle Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.</li>
	<li>Bevor Sie mit dem Test beginnen, bringen Sie alle Reagenzien und Assayplatten auf Raumtemperatur (RT). Verwenden Sie die erforderliche Anzahl von Brunnen für den Assay, Versiegeln und halten Sie die ungenutzten Brunnen bei 4 °C bis zum Gebrauch.</li>
	<li>Den Waschpuffer (15 ml 20x Konzentrat) mit doppelt destilliertem Wasser auf 300 ml verdünnen</li>
	<li>Richten Sie die leeren Brunnen ohne Lösung ein.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Standard oder Probe hinzu (n = 2), und fügen Sie dann jedem Brunnen weitere 50 l Meerrettichperoxidase (hrp)-Konjugat hinzu. Fügen Sie sofort weitere 50 L Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzu. Die Platte versiegeln, gut mischen und 1 h bei 37 °C bebrüten.</li>
	<li>Waschen Sie die Brunnen mit 1x Waschpuffer (200 l/well) und wiederholen Sie 4x.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Substrat A und 50 l Substrat B hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie die Platte an der Seite sanft anzapfen. Die Platte versiegeln und 15 min bei 37 °C im Dunkeln 15 min inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Stop-Lösung hinzu, tippen Sie vorsichtig auf die Platte und lesen Sie die Platte mit dem Spektralphotometer, das auf eine Wellenlänge von 450 nm eingestellt ist.</li>
	<li>Normalisieren Sie den LH-Gehalt von Rindern und Schweinen auf das Gesamtprotein (siehe Abschnitt 6).</li>
</ol>5. Rinder- und Schweine-VEGF-A ELISA-Test
<ol><li>Bewahren Sie alle ELISA-Assay-Komponenten in den handelsüblichen Vascular Endothelial Growth Factor-A ELISA-Kits (siehe Materialtabelle)bei 2-8 °C auf. Dazu gehören Antikörper, HRP-Konjugat, Assayplatte (96 gut), Kalibratoren, Waschpuffer (20x Konzentrat), Substrat A, Substrat B und Stop-Lösung. Bereiten Sie alle Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.</li>
	<li>Bevor Sie mit dem Test beginnen, bringen Sie alle Reagenzien und Assayplatten auf RT. Verwenden Sie die erforderliche Anzahl von Brunnen für den Assay, versiegeln und halten Sie die ungenutzten Brunnen bei 4 °C bis zum Gebrauch.</li>
	<li>Den Waschpuffer (15 ml 20x Konzentrat) mit doppelt destilliertem Wasser auf 300 ml verdünnen</li>
	<li>Fügen Sie jedem Bohrwert 100 l des Standards oder der Probe hinzu (n = 2). Die Platte versiegeln, gut mischen und 2 h bei 37 °C bebrüten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Flüssigkeit in jedem Brunnen und fügen Sie 100 l Detektionsreagenz A zu jedem Brunnen hinzu, versiegeln Sie die Platte und brüten sie 1 h bei 37 °C.</li>
	<li>Waschen Sie die Brunnen mit 1x Waschpuffer (400 l/well) und wiederholen Sie 4x.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen 100 l Detektionsreagenz B hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie die Platte an der Seite sanft anzapfen. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie die Platte für 1 h bei 37 °C.</li>
	<li>Waschen Sie die Brunnen mit 1x Waschpuffer (400 l/well) und wiederholen Sie 4x.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen 90 L Substratlösung hinzu, tippen Sie vorsichtig auf die Platte und brüten sie 1 h bei 37 °C.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Stop-Lösung hinzu, tippen Sie vorsichtig auf die Platte und lesen Sie die Platte mit dem Spektralphotometer, das auf eine Wellenlänge von 450 nm eingestellt ist.</li>
	<li>Renormalisieren Sie den VEGF-A-Gehalt von Rindern und Schweinen auf das Gesamtprotein (Abschnitt 6).</li>
</ol>6. Proteinschätzung insgesamt
<ol><li>Schätzen Sie das Gesamtprotein der Rinder- und Schweinenierenextrakte anhand des Standard-Serumalbumins (BSA) anhand eines kommerziellen Kits (siehe Materialtabelle) gemäß den Empfehlungen des Herstellers.</li>
</ol>7. Statistische Analyse
<ol><li>Berechnen Sie den Mittelwert, den Median und die Standardabweichung jedes Analyten.</li>
	<li>Testen Sie die Divergenz der Probenverteilung von der normalen Verwendung Kolmogorov-Smirnov Test zu entscheiden, nach der Verwendung, zwischen parametrischen vs. nicht-parametrischen statistischen Tests. Wenn die Daten normal verteilt sind, führen Sie statistische Tests über parametrische Tests durch.</li>
	<li>Unter geeigneten Umständen (z. B. normaler Datenverteilung) sollten Regressionsmodelle die lineare Beziehung zwischen LH und VEGF-A untersucht werden.</li>
</ol>

<ol><li>Advani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+VEGF+in+maintaining+renal+structure+and+function+under+normotensive+and+hypertensive+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).</li>
<li>Majumder, S., Advani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+the+diabetic+kidney%3A+More+than+too+much+of+a+good+thing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).</li>
<li>Liu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+kidney+leads+to+progressive+impairment+of+glomerular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).</li>
<li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li>
<li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor%3A+basic+science+and+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress.</a> Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).</li>
<li>Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+Levels+of+Luteinizing+Hormone+and+VEGF+are+Strongly+Correlated+in+Healthy+Mammalian+Eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes.</a> Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).</li>
<li>Babitha, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteinizing+hormone%2C+insulin+like+growth+factor-1%2C+and+epidermal+growth+factor+stimulate+vascular+endothelial+growth+factor+production+in+cultured+bubaline+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).</li>
<li>Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+Primate+Ovulatory+Follicle+Is+Stimulated+by+Luteinizing+Hormone+via+Prostaglandin+E2%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2.</a> Biology of Reproduction. 92 (1), 15(2015).</li>
<li>Movsas, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+Luteinizing+Hormone+%28LH%29+in+Living+Human+Vitreous+and+the+Effect+of+LH+Receptor+Reduction+on+Murine+Electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram.</a> Neuroscience. 385, 1-10 (2018).</li>
<li>Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+Signaling+by+the+Luteinizing+Hormone+Receptor+Reduces+Ocular+VEGF+and+Retinal+Vascularization+during+Mouse+Eye+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development.</a> Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).</li>
<li>Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+luteinizing+hormone%2Fchorionic+gonadotropin+%28LH%2FCG%29+receptor+precursor+in+a+human+kidney+cell+line+stably+transfected+with+the+rat+luteal+LH%2FCG+receptor+complementary+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA.</a> Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).</li>
<li>Lei, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+luteinizing+hormone%2Fhuman+chorionic+gonadotropin+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene.</a> Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).</li>
<li>Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF%29+in+renal+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology.</a> Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).</li>
<li>Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+mature+luteinizing+hormone+receptor+in+rodent+urogenital+and+adrenal+tissues+is+developmentally+regulated+at+a+posttranslational+level%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level.</a> Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).</li>
<li>Ondruschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-mortem+in+situ+stability+of+serum+markers+of+cerebral+damage+and+acute+phase+response%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response.</a> International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).</li>
<li>Swain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+post-mortem+interval%3A+A+comparison+between+cerebrospinal+fluid+and+vitreous+humour+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+and+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry.</a> Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).</li>
<li>Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+method+for+the+detection+of+residues+of+amphenicol+antibiotics+in+bovine%2C+ovine+and+porcine+kidney+by+optical+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor.</a> Talanta. 172, 120-125 (2017).</li>
<li>Konstantinou, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-Linked+Immunosorbent+Assay+%28ELISA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).</a> Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).</li>
<li>Levesque, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+urine+vascular+endothelial+growth+factor+levels+are+associated+with+mechanical+ventilation%2C+bronchopulmonary+dysplasia+and+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity.</a> Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).</li>
<li>Leviton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antecedents+and+early+correlates+of+high+and+low+concentrations+of+angiogenic+proteins+in+extremely+preterm+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns.</a> Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).</li>
<li>Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+vitreous+fluid+analysis+in+the+translational+research+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy.</a> Mediators of Inflammation. , 872978(2012).</li>
<li>Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+molecular+and+genomic+biomarkers+of+retinal+drug+efficacy%3A+use+of+ocular+fluid+sampling+to+evaluate+VEGF%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF.</a> Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).</li>
</ol>

Zietchick Research Institute (ZRI) ist ein privates (gewinnorientiertes) Forschungsinstitut, und Dr. Tammy Movsas (Gründer und Direktor von ZRI) hat eine anhängige Patentanmeldung und validierte Patente für die Verwendung von Gonadotropin-Antagonisten bei der Behandlung von Augenerkrankungen diabetes. Abgesehen davon, dass Dr. A. Muthusamy Mitarbeiter (Biochemiker) bei ZRI ist, hat er keine anderen finanziellen Konflikte zu melden. A. Arivalagan (Sommerpraktikant an der ZRI, Student an der University of Michigan) hat keine anderen finanziellen Konflikte zu melden.

Die Beschaffung von Nieren aus dem Schlachthof unmittelbar nach dem Tod der Tiere ist der Schlüssel zum Erfolg in dieser Methodik. Dies ist der Hauptvorteil der Verwendung von Organen von Kühen und Schweinen anstelle von menschlichen Leichen. Es gibt in der Regel mindestens eine Verzögerung von 12-24 h vom Zeitpunkt des Todes bis zur Beschaffung menschlicher Kadaverorgane. Da sich die chemische Zusammensetzung der Körperorgane innerhalb von 2 h postmortal15,16sig...

Vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor A (VEGF-A), hilft, Angiogenese und vaskuläre Permeabilität in der Niere und anderen Organen1,2 (im Folgenden WIRD VEGF-A als VEGF bezeichnet werden) zu regulieren. VEGF-Spiegel in der Niere sind unter strenger panostatischer Kontrolle. Wenn die VEGF-Spiegel der Nieren erhöht oder depressiv sind, kann die Niere fehlamwerden. Zum Beispiel entwickeln Mäuse mit podozytspezifischer Heterozygosität für VEGF innerhalb von 3 Wochen nach der Geburt Endotheliose und blutlose Glomeruli (d. h. Nierenläsionen, die bei menschlicher Präeklampsie beobachtet werden), und Nierenversagen im Endstadium tritt in diesen Heterozygoten im Alter von 3 Monaten auf. Podozyten-spezifische homozygote Knockouts sterben an Hydrops und Nierenversagen innerhalb von 1 Tag nach der Geburt3,4.
Auf der anderen Seite verursacht überexpression von renalem VEGF Proteinurie und glomeruläre Hypertrophie3,4. Zum Beispiel zeigen transgene Kaninchen, die VEGF überexpressen, progressive Proteinurie mit erhöhten glomerulären Filtrationsraten in frühen Stadien der Nephropathie, gefolgt von verringerten glomerulären Filtrationsraten in späteren Stadien3. Diabetische Nephropathie, eine Hauptursache für Nierenerkrankungen im Endstadium bei diabetischen Erwachsenen, ist stark mit VEGF-Dysregulation2,5verbunden. Der Rolle der Hypoxie bei der Induktion der VEGF-Expression unter pathologischen Bedingungen wurde große Aufmerksamkeit gewidmet5. Die Faktoren, die VEGF unter physiologischen Bedingungen (sowohl in der Niere als auch in anderen Organen) beeinflussen, sind jedoch nicht gut verstanden2,6. Die Identifizierung dieser Faktoren (mit Ausnahme von Sauerstoff), die an der physiologischen und pathologischen VEGF-Regulierung beteiligt sind, ist ein wichtiges Unterfangen.
Luteinisierendes Hormon (LH), ein pro-angiogenes Hormon, hilft, die physiologische VEGF-Expression in Fortpflanzungsorganen wie Eierstock und Hoden7,8zu regulieren. Frühere Studien haben Beweise dafür erbracht, dass LH auch hilft, VEGF in nicht-reproduktiven Organen zu regulieren, wie die Augen6,9,10. LH-Rezeptoren finden sich in der Medulla und Demkorteder der Niere11,12. Bemerkenswert ist, dass nierenröhrenförmige Epithelzellen sowie der LH-Rezeptor VEGF11,12,13,14ausdrücken. Unter Berücksichtigung dieser beiden Beobachtungen haben wir vermutet, dass LH auch hilft, die VEGF-Expression in derNiere zuregulieren 13,14. Um Beweise für diese LH/VEGF-Beziehung zu liefern, soll das vorgestellte Protokoll zeigen, dass LH-Spiegel in der Lage sind, VEGF-Spiegel in der Niere vorherzusagen. Viele frühere VEGF-bezogene Untersuchungen mit der Niere haben Säugetiermodelle niedrigerer Ordnung verwendet (d. h. Nagetiere und Kaninchen)2. Um diese Arbeit auf den menschlichen Körper zu übersetzen, untersucht die Studie die Beziehung zwischen VEGF und LH bei Säugetieren höherer Ordnung (hier Rinder- und Schweinemodelle). Um dieses Ziel zu erreichen, wurde das Gesamteproteinlysat aus der Kortexregion von Rinder- und Schweinenieren hergestellt.

<table><tbody><tr><td>LH-ELISA-Kit für Rinder</td><td>MyBiosource, San Diego, Kalifornien.</td><td></td><td></td>MBS700951</tr><tr><td>Rinder VEGF-A ELISA Kit</td><td>MyBiosource, San Diego, Kalifornien.</td><td></td><td></td>MBS2887434</tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Schweine-LH-ELISA-Kit</td><td>MyBiosource, San Diego, Kalifornien.</td><td></td><td></td>MBS009739</tr><tr><td>Schweine VEGF-A ELISA</td><td>Ray Biotech, Norcross, GA.</td><td>ELP-VEGFA-1</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lyse- und Extraktionspuffer</td><td>ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.</td><td>Nr. 89901</td><td></td></tr></tbody></table>

demonstrieren einer linearen beziehung zwischen vaskulären endotheliaalen wachstumsfaktor und luteinizing hormone in nieren-cortex-extrakte

Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts

Vaskulärer endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) hilft, Angiogenese und vaskuläre Durchlässigkeit in der Niere zu kontrollieren. Nierenerkrankungen, wie diabetische Nephropathie, sind mit VEGF-Dysregulation in der Niere verbunden. Die Faktoren, die VEGF unter physiologischen Bedingungen in der Niere regieren, sind nicht gut verstanden. Luteinizing Hormon (LH), ein pro-angiogenes Hormon, hilft, physiologische VEGF-Expression in Fortpflanzungsorganen zu regulieren. Da LH-Rezeptoren in der Niere gefunden werden, haben wir am Zietchick Research Institute hier vermutet, dass LH auch hilft, die VEGF-Expression in der Niere zu regulieren. Um Beweise zu liefern, wollten wir zeigen, dass LH-Spiegel in der Lage sind, VEGF-Spiegel in der Säugetierniere vorherzusagen. Bei den meisten VEGF-bezogenen Untersuchungen mit der Niere wurden Säugetiere niedrigerer Ordnung als Modelle verwendet (d. h. Nagetiere und Kaninchen). Um diese Arbeit auf den menschlichen Körper zu übersetzen, wurde beschlossen, die Beziehung zwischen VEGF und LH bei Säugetieren höherer Ordnung (d. h. Rinder- und Schweinemodelle) zu untersuchen. Dieses Protokoll verwendet das gesamte Proteinlysat aus dem Nierenkortex. Zu den Schlüsseln zum Erfolg dieser Methode gehören die Beschaffung von Nieren von Schlachthoftieren unmittelbar nach dem Tod sowie die Normalisierung des Analytspiegels (im Nierenextrakt) durch das Gesamtprotein. Diese Studie zeigt erfolgreich eine signifikante lineare Beziehung zwischen LH und VEGF sowohl bei Rinder- als auch in Schweinenieren. Die Ergebnisse sind in zwei verschiedenen Arten reproduzierbar. Die Studie liefert Belege dafür, dass die Verwendung von Nierenextrakten von Kühen und Schweinen eine ausgezeichnete, wirtschaftliche und reichlich vorhandene Ressource für die Untersuchung der Nierenphysiologie ist, insbesondere zur Untersuchung der Korrelation zwischen VEGF und anderen Analyten.

Der Mittelwert und der Median von LH und VEGF nach Tiertyp und Geschlecht sind in Tabelle 1dargestellt. Nach der Überprüfung der Normalität der Daten durch Kolmogorov-Smirnov Prüfung der Normalität, lineare Regressionsmodelle wurden verwendet, um die Beziehung zwischen LH und VEGF zu untersuchen. LH erwies sich als starker und signifikanter Prädiktor von VEGF sowohl bei Rinder- als auch bei Schweinenieren (Rindernierenmodell: n = 7, R2 = 0,86, p = 0,002; Schwei...

Präsentiert hier ist ein Protokoll für die Verwendung einer kortikalen Nierenextrakt Präparat und Gesamtprotein Normalisierung, um die Korrelation zwischen vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor und luteinisierendes Hormon in der Säugetierniere zu demonstrieren.

Demonstrieren einer linearen Beziehung zwischen vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor und Luteinizing Hormone in Nieren-Cortex-Extrakte

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic ...

Unser Protokoll stellt fest, dass die Verwendung von Nierenextrakten von Kühen und Schweinen eine ausgezeichnete und wirtschaftliche Ressource für die Untersuchung der Nierenphysiologie ist, insbesondere die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen vaskulären endothelialem Wachstumsfaktor und anderen Analyten. Es war schon immer eine Herausforderung, VEGF, einen wesentlichen Wachstumsfaktor in der Organangiogenese, mit anderen Proteinen zu korrelieren. Diese Technik ermöglicht es uns, den Zusammenhang zwischen VEGF und Analyten wie Hormonen zu untersuchen.Dies wird sicherlich unsere Wissensbasis in Bezug auf diesen wichtigen Wachstumsfaktor erweitern. Diese Methode kann nützlich sein, um andere Analyten in Nierenkortika-Extrakten neben den in diesem Video erwähnten zu korrelieren. Visuelle Demonstration hilft anderen, reproduzierbare Ergebnisse ohne Stichprobenfehler zu erzielen.Die Verwendung von frischem Gewebe ist entscheidend für den Erfolg dieser Technik. Es ist wichtig, frische ganze Nieren unmittelbar nach der Schlachtung von einem Tier zu erhalten. Übertragen Sie das Gewebe immer auf Eis ins Labor.Verwenden Sie sterile Schere, Zangen, ein Messer und Petri-Gerichte, um Nieren zu sezieren und die erforderliche Gewebeportion zu verbrauchen. Schneiden Sie die Niere vorsichtig entlang der sagittalen Ebene und schneiden Sie ein Stück Gewebe aus dem Kortexbereich in der Mitte der Niere. Das Gewebe mit dem Messer in kleine Stücke zerkleinern und mit einem Milliliter eiskaltem 1X RIPA-Lyseextraktionspuffer in ein Mikrofugenrohr geben.Beschriften Sie das Rohr mit spezifischen Probendetails und legen Sie es auf Eis. Verwenden Sie einen Handhomogenisator mit einer sterilen Sonde, um das Gewebe für ein bis zwei Minuten zu homogenisieren, bis keine Brocken sichtbar sind, und zentrieren Sie das Rohr dann sofort bei 9, 600 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation verschiedene Aliquots der Probe für ELISA und die gesamte Proteinanalyse vorbereiten, um mehrere Gefrier-/Tauzyklen zu vermeiden.Bevor Sie mit dem Test beginnen, bringen Sie alle Reagenzien und die Assayplatte auf Raumtemperatur, um die überschüssigen Brunnen zu entfernen und sie bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung aufzubewahren. Den 20X Waschpuffer mit doppelt destilliertem Wasser auf 300 Milliliter verdünnen und die Rohbrunnen lösungslos aufstellen. Fügen Sie 50 Mikroliter Standard oder Probe und weitere 50 Mikroliter Meerrettichperoxidase konjugieren zu jedem Brunnen, dann fügen Sie sofort 50 Mikroliter Antikörperlösung zu jedem Brunnen und versiegeln Sie die Platte.Mischen Sie die Platte und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Nach der Inkubation jeden Brunnen mit 200 Mikroliter Waschpuffer waschen. Fügen Sie 50 Mikroliter Substrat A und Substrat B zu jedem Brunnen hinzu, mischen Sie die Platte sanft, indem Sie auf die Seite tippen, dann versiegeln und inkubieren Sie es im Dunkeln für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius.Fügen Sie 50 Mikroliter Stop-Lösung zu jedem Brunnen. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte und lesen Sie die Absorption bei 450 Nanometern mit einem Spektralphotometer ab. Bereiten Sie die Reagenzien und Waschpuffer wie zuvor beschrieben, dann fügen Sie 100 Mikroliter Standard oder Probe zu jedem Brunnen, versiegeln Sie die Platte, mischen Sie gut, und inkubieren Sie es für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius.Entfernen Sie die Flüssigkeit in jedem Brunnen und fügen Sie 100 Mikroliter Detektionsreagenz A.Seal die Platte und inkubieren Sie es für eine weitere Stunde. Als nächstes waschen Sie jeden Brunnen mit 400 Mikroliter Waschpuffer, fügen Sie dann 90 Mikroliter Substratlösung zu jedem Brunnen, tippen Sie vorsichtig auf die Platte, und inkubieren Sie es für eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius. Nach der letzten Inkubation 50 Mikroliter Stop-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen, sanft auf die Platte tippen und die Absorption bei 450 Nanometern mit einem Spektralphotometer ablesen.Schätzen Sie das Gesamtprotein der Rinder- und Schweinenierenextrakte mit einem Standard-BSA-Test und verwenden Sie diese Schätzung, um die LH- und VEGF-A-ELISA-Ergebnisse zu normalisieren. Der Mittelwert und der Median von LH und VEGF wurden sowohl für Tiere als auch für Geschlechter berechnet. Nach der Überprüfung der Normalität der Daten wurden lineare Regressionsmodelle verwendet, um die Beziehung zwischen LH und VEGF zu untersuchen.LH erwies sich als starker und signifikanter Prädiktor von VEGF sowohl bei Rinder- als auch bei Schweinenieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, identische Bereiche in jedem Gewebe zu proben. Ein ähnliches Verfahren kann verwendet werden, um jede Art von Gewebe zu extrahieren.Denken Sie daran, Analyten durch Total-Protein-Extrakt von welchem Gewebe Sie verwenden normalisieren.

demonstrating-linear-relationship-between-vascular-endothelial-growth

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine einfache zellbasierten Bioassay zum Nachweis, zur Quantifizierung und Überwachung der Aktivität der Mitglieder der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Familie von Liganden. Der Assay verwendet chimären Rezeptoren in einem Faktor-abhängigen Zelllinie exprimiert eine semi-quantitative oder quantitative Bewertung der Rezeptorbindung bereitzustellen, und die Vernetzung durch den Liganden.

Eine einfache Bioassay für die Beurteilung von Vascular Endothelial Growth Factors

Dieses Manuskript beschreibt einen Röhrenbildungsassay, um die Auswirkungen einer gegebenen Verbindung oder Bedingung auf die Angiogenese zu quantifizieren, indem die Bildung von Endothelzellröhren in einer kontrollierten Umgebung verwendet wird.

Strategische Endothelzell Tubusbildung Assay: Ein Vergleich extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktor Reduzierte Extrazellulärmatrix

Die Verabreichung von Medikamenten für die Wiederherstellung der Nierenfunktion erfordert die Kontrolle der Lokalisierung und Verteilung der therapeutischen Verbindung. Hier beschreiben wir im Detail eine einfache Technik für intrarenalen Abgabe von Arzneimitteln in Ratten. Dieses Verfahren kann ohne Mortalität und hoher Reproduzierbarkeit leicht durchgeführt werden.

Die intravaskuläre Lieferung von Biologics zur Rattenniere

Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige Niere Aufarbeitung, die in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung durchgeführt werden soll. Die Methoden können für funktionelle, strukturelle und mechanistische Detailanalyse der glomerulären Funktion, die auf alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden kann.

Beurteilung der Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung

Hier präsentieren wir ein Schwanzspitze Blut-Probenahme-Protokoll für häufige Musterkollektion in hemmungslose Mäuse. Diese Methode ist nützlich für die Beurteilung der Muster der pulsierender Luteinisierendes Hormon-Sekretion und könnte für die Analyse von anderen zirkulierenden Faktoren angepasst werden.

Häufige Schwanzspitze Blutabnahme bei Mäusen zur Beurteilung der pulsierender Luteinisierendes Hormon-Sekretion

Das follikelstimulierende Hormon (FSH) in verschiedenen extragonadalen Geweben und Organen wird mit der Pathogenese mehrerer Krankheiten in Verbindung gebracht. Das ovariektomierte und FSH-behandelte Mausmodell (OVF) kann verwendet werden, um die extragonadalen Wirkungen von FSH zu untersuchen.

Untersuchung unabhängiger Effekte des follikelstimulierenden Hormons in vivo in einem Mausmodell

Hier stellen wir Protokolle vor, die Anweisungen für die Implementierung von 3D-Zellkulturen unter Verwendung von Kollagen- und Kollagen-Agarose-Matrizen in einem mikrophysiologischen System enthalten. Diese Protokolle unterstützen die Co-Kultur von Sphäroiden mit Nierentubuli und Nierenzellkarzinom, simulieren In-vivo-Bedingungen und ermöglichen eine fortschrittliche Untersuchung von Wechselwirkungen mit Nierenkrebszellen.

Mikrofluidische Co-Kultur von gesunder Niere und Tumorepithel zur Modellierung des Fortschreitens von Nierenkrebs

Dieses Video zeigt zwei Methoden für die Erstellung und Platzierung Perlen, die mit Wachstumsfaktor beschichtet wurden, auf Explantate der Entwicklungsländer Großhirnrinde. Diese Perlen können verwendet werden, um räumlich begrenzte Genexpression auf die Entwicklung von neuronalen Gewebe wie Vorderhirn Explantate induzieren. Es werden Methoden für die Verwendung sowohl Affi-Gel Perlen und Heparin Acryl Perlen gegeben.

Growth Factor-Coated Bead Platzierung auf Dorsal Vorderhirnneuronen Explantate

Eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Proteinen interagieren zu induzieren Zellen auf verschiedene Zell-Schicksal während der Entwicklung zu nehmen. Hier zeigen wir die Verwendung eines in-ovo-Vorbereitung auf mögliche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen in der Entwicklung, indem sie Perlen auf E2.5 Hühnerembryonen Adresse.

Platzieren Growth Factor-Coated Perlen auf Early Stage Hühnerembryonen

Wir beschreiben die Herstellung von T-Zell-Wachstumsfaktor für die in vitro Expansion von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten-Ratte-Linien verwendet.

Vorbereiten T Cell Growth Factor von Rat Splenozyten

Lernen Sie eine ELISA-basierte Methode zur Korrelation von VEGF und LH in Nierenkortex-Extrakten von Rindern und Schweinen. Diese Technik ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse für die Nierenphysiologie.

Demonstrieren einer linearen Beziehung zwischen vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor und Luteinizing Hormone in Nieren-Cortex-Extrakte (Video) | JoVE Journal

Demonstrieren einer linearen Beziehung zwischen vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor und Luteinizing Hormone in Nieren-Cortex-Extrakte

Weitere Videos entdecken