Name: Vorbereiten T Cell Growth Factor von Rat Splenozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T22:24:33.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von T-Zell-Wachstumsfaktor aus Ratten-Splenozyten für die In-vitro-Expansion antigen-spezifischer T-Lymphozyten. Diese effiziente Methode nutzt Concanavalin A zur Zellstimulation.

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<ol><li> Nehmen Sie Lewis Ratte Milz (Ratten zwischen 160-200g sind am besten). Dilacerate auf Eis in einer Petrischale mit PBS + Antibiotika (PBS-PS) unter Verwendung einer Zelle Sieb. Setzen Sie in einer 50 ml Tube. Füllen mit PBS-PS. </li><li> Spin für 10 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal. </li><li> Das Pellet in NH 4 Cl 0,15 M (5 ml pro Milz). Vorsichtig mischen und kontinuierlich mit einer Pipette für 3 min auf Eis, um die Erythrozyten zu lysieren. Füllen Sie das Röhrchen mit Medium. </li><li> Spin für 10 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal. </li><li> Zählen Sie die Zellen. Eine Ratte Milz gibt 200 bis 250.000.000 Zellen. </li><li> Seed die Zellen bei 2 Millionen pro ml in komplettem Medium: 50 ml pro 75 cm 2-Kolben. </li><li> Lassen Sie wachsen für 48 Stunden in den Brutschrank. </li><li> Spin 15 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren. </li><li> Sammeln Sie die überstehende, entsorgen Sie die Zellen. </li><li> Add 15 mg / ml eine Methylmannosid den Überstand. Gründlich mischen. </li><li> Filter (0,2 mm) </li><li> Aliquotieren und bei -20 ° C. Kann bei 4 ° C für 10 Tage, wenn nötig gehalten werden. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. 166, 936-944 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockade+of+T+lymphocyte+K%2B+channels+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%2C+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad%22%5BJournal%5D)">Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).</li>
<li>Mor, F., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Lewis+rat+encephalitogenic+T+cell+lines%3A+T-cell-growth-factor+is+superior+to+recombinant+IL-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2.</a> J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Offenlegungspflichten.

Wir bereiten TCGF von Lewis Ratte Splenozyten da wir einschläfern regelmäßig naive Ratten von dieser Sorte zu ernten Serum und Thymi zu Lewis Ratten T-Zelllinien in vitro zu stimulieren. Diese TCGF kann verwendet werden, um das Wachstum und Überleben von T-Zell-Linien aus anderen Zuchtlinien gefördert werden. TCGF können auch von anderen Stämmen von Ratten vorbereitet werden.

Zur Vorbereitung komplettem Kulturmedium fügen Sie die folgenden zu einer 500 ml Flasche RPMI 1640 und sterile-Filter: 10% FCS, 1 Flasche PSG; 5 ml RPMI Vitamine, 5 ml Natriumpyruvat, 5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren, 50 uM beta-Mercaptoethanol, 2 ug / ml Concanavalin A.

vorbereiten t cell growth factor von rat splenozyten

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Wartung von Antigen-spezifischen T-Zell-Linien oder Klone in Kultur erfordert Runden von Antigen-induzierte Aktivierung von Phasen der Zellexpansion 1,2 getrennt. Die Zugabe von Interleukin-2 zum Kulturmedium während der Expansionsphase ist notwendig, um den Zelltod zu verhindern und ausreichend, um kurzfristige T-Zell-Linien zu erhalten, hat aber gezeigt, dass Th1 Polarisierung 3 zu erhöhen. Ersatz von Interleukin-2 durch T-Zell-Wachstumsfaktor (TCGF), die eine Mischung von Zytokinen enthält, ist effektiver als Interleukin-2 in die Pflege langfristiger T-Zelllinien in vitro 3. Darüber hinaus können TCGF leicht in großen Mengen im Labor hergestellt werden und ist viel billiger als rekombinante Interleukin-2. Hier zeigen wir, wie man TCGF aus Ratten-Splenozyten Kulturüberständen vorzubereiten. Für dieses Verfahren, ernten wir Milzen von naiven Lewis Ratten Thymus und Blutentnahme getötet. Wir bereiten Einzel-Zellsuspensionen aus der Milz, lysieren die Erythrozyten durch osmotischen Schock und Saatgut die Splenozyten in Kulturmedium. Die Zellen werden mit Concanavalin A, ein Mitogen, dass nicht-selektiv aktiviert alle Ratten T-Lymphozyten, induziert die Produktion von Zytokinen stimuliert. Die Kultur supernantant 48 Stunden später ist andexcess Concanavalin gesammelt A ist alpha Methylmannosid gebunden, um es von der Aktivierung T-Zell-Linien, auf die TCGF hinzugefügt werden verhindern. Die TCGF wird dann sterilfiltriert, aliquotiert und bei -20 ° C.

Wir beschreiben die Herstellung von T-Zell-Wachstumsfaktor für die in vitro Expansion von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten-Ratte-Linien verwendet.

Vorbereiten T Cell Growth Factor von Rat Splenozyten

Die Erhaltung von antigenspezifischen T-Zelllinien oder -Klonen in Kultur erfordert Runden einer antigeninduzierten Aktivierung, die durch Phasen der Zellexpansion unterbrochen werden 1,2. ...

Hallo, ich bin Christine Beaton. Ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor von George Chen am Department für Physiologie und Biophysik der University of California in Irvine. In den nächsten zwei Tagen werde ich Ihnen zeigen, wie man TCGF herstellt, was für T-Zell-Wachstumsfaktor steht.Bei unserer alltäglichen Zellkultur, wenn wir keine genaue Kenntnis über die Zusammensetzung der Zytokine im Kulturmedium benötigen, verwenden wir einen T-Zell-Wachstumsfaktor, also ein Überstand aus der Milzzellenkultur von Louis-Ratten, der die erforderlichen Zytokine enthält, um die Vermehrung der T-Zellen zu unterstützen. Die Herstellung des TCGF erfolgt folgendermaßen: Nach dem Töten gesunder Louis-Ratten entnehmen wir ihre Milzen, stellen eine Einzelzell-Suspension her, entfernen die roten Blutkörperchen durch Lyse und stimulieren anschließend die mononukleären Zellen mit Concanavalin A, wodurch die T-Zellen zur Produktion aller notwendigen Wachstumszytokine angeregt werden. Um das TCGF zu erzeugen, müssen wir die Zellen aktivieren.Die Methode, die wir anwenden, besteht darin, dass wir unserer Zellkultur Lectin Concanavalin A, abgekürzt als ConA, hinzufügen. Wenn wir ConA zu unserer Zell

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ex vivo Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen mittels Bryostatin 1/Ionomycin und der Gemeinsamen gamma-Kette Zytokine Formulation

Dieses Video zeigt das Screening von immunmodulatorischen Verbindungen mittels fluoreszenzbasiertem Assay. Transgene T-Lymphozyten aus der Maus mit grün fluoreszierenden Proteinexpressionskassetten werden mit diesen Verbindungen behandelt. Die verstärkten und reduzierten GFP-Signale ermöglichen die Identifizierung der stimulierenden bzw. hemmenden Wirkungen der Verbindungen.

Ein fluoreszenzbasierter Assay mit gentechnisch veränderten Lymphozyten zum Screening immunmodulatorischer Verbindungen

Das Video zeigt einen auf Durchflusszytometrie basierenden Assay zur Bestimmung der Immundominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten oder CTL-Antworten. Injizierte fluoreszierende Zielzellen weisen eine unterschiedliche Fluoreszenz auf, die immunogenen Epitopen entspricht. Die Sammlung und Sortierung nach der Milz zeigt eine Verringerung der hochintensiven Fluoreszenzzellen, was die Immundominanz bei CTL-Antworten bestätigt.

Ein Assay zur Bewertung der Immundominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten-Antworten

Dieses Video demonstriert eine Technik zur ex vivo Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA tragen, werden mit Milzzellen in einem mit Interleukin-2 supplementierten Medium gemischt, um das Überleben und die Proliferation von T-Zellen zu fördern. Das Gemisch wird dann auf eine mit rekombinanten menschlichen Fibronektinfragmenten beschichtete Platte überführt und zentrifugiert, um die Fusion des Virus mit der Zelle...

Eine ex vivo-Technik zur Erzeugung tumorspezifischer chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Erzeugung antigenspezifischer chimärer Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen durch retrovirale Transduktion. Aktivierte murine CD8+ T-Zellen werden in eine Mikrotiterplatte gegeben, die mit rekombinanten Fibronektinfragmenten beschichtet ist. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA enthalten, die für einen antigenspezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) kodieren, werden dann eingeführt, und die Platte wird zentrifugiert, um die Transduktion zu erleichtern.

Eine Technik zur Erzeugung antigenspezifischer CAR-T-Zellen

Die lymphodepletiven und immunmodulatorischen Effekte von Chemotherapie und Bestrahlungsstandard können genutzt werden, um die Antitumorwirksamkeit der T-Zell-Immuntherapie zu verbessern. Wir skizzieren eine Methode zur Erzeugung von EGFRvIII-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen und deren Verabreichung im Rahmen der Glioblastom-Standardtherapie.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM)-Helferzellen von naiven CD4 + T-Zellen, einschließlich Isolierung von naiven CD4 + T-Zellen, Differenzierung von THGM, zu differenzieren und Analyse von differenzierten Zellen THGM. Diese Methode kann auf Studien der Verordnung und Funktion von THGM Zellen angewendet werden.

In-vitro- Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) Maus-Herstellung von T-Helferzellen (THGM)

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll, um schnell und reproduzierbar generieren biologisch inspirierten, biologisch abbaubaren künstlichen antigenpräsentierende Zellen (aAPC) mit einstellbaren Größe, Form und Oberfläche Protein Präsentation für T-Zell Erweiterung ex Vivo oder in-vivo .

Herstellung von anisotropen Polymeren künstliche antigenpräsentierende Zellen für CD8 + T-Zell-Aktivierung

MALT1 regelt die angeborene Immunität, aber wie in diesem Fall bleibt unklar. Wir verwendet die selektive MALT1 Paracaspase Inhibitor MLT-827 um zu entwirren den Beitrag von MALT1 zur angeborenen Signalisierung von Toll-Like oder C-Art Lectin-Like-Rezeptoren, zeigen, dass MALT1 die Produktion der myeloischen Zytokine reguliert, vor- und nachgelagerten der C-Art Lectin-Like-Rezeptoren selektiv.

Myeloische angeborene Signalisierung Pathway Verordnung von MALT1 Paracaspase Tätigkeit

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Wir stellen verbesserte Protokolle für die retrovirale Transduktion von Transportrezeptoren und kompetitives Homing vor, um die Rezeptor-vermittelte organ- und mikroumgebungsspezifische Lymphozytenpositionierung zu untersuchen. Diese Methode bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen des Transports von Immunzellen und hat potenzielle Anwendungen in der zukünftigen Grundlagen- und Therapieforschung.

Effiziente retrovirale Transduktion und kompetitives Homing zur Untersuchung der GPCR-vermittelten T-Zell-Lokalisierung in verschiedenen Gewebemikroumgebungen

Lernen Sie die Herstellung von T-Zell-Wachstumsfaktor aus Ratten-Splenozyten für die In-vitro-Expansion antigen-spezifischer T-Lymphozyten. Diese effiziente Methode nutzt Concanavalin A zur Zellstimulation.

Vorbereiten T Cell Growth Factor von Rat Splenozyten

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