Vorbereiten T Cell Growth Factor von Rat Splenozyten

Hallo, ich bin Christine Beaton. Ich bin wissenschaftlicher Assistent im Labor von George Chen in der Abteilung für Physiologie und Biophysik der University of California in Irvine. Und in den nächsten zwei Tagen zeige ich Ihnen, wie Sie TCGF zubereiten können, was für T-Zell-Wachstumsfaktor steht.

Für unsere alltägliche Zellkultur, wenn wir keine genaue Kenntnis der Zusammensetzung der Zytokine im Kulturmedium benötigen, verwenden wir den T-Zell-Wachstumsfaktor, den S-Überstand aus der spl CY-Kultur, der die erforderlichen Zytokine enthält, um die T-Zellen bei der Expansion zu unterstützen. Die Art und Weise, wie wir den TCGF vorbereiten, besteht darin, dass wir gesunde Louis-Ratten töten, ihre Milz nehmen, eine Einzelzellsuspension herstellen, die roten Blutkörperchen loswerden, indem wir sie verschließen, und dann die mononukleären Zellen mit einem Karneval stimulieren, der die T-Zellen dazu bringt, alle für ihr Wachstum erforderlichen Zytokine zu produzieren. Um den TCGF zu erzeugen, müssen wir die Zellen aktivieren.

Die Art und Weise, wie wir es machen, ist, dass wir Lektin conval in a, abgekürzt als Corona A, zu unserer Zellkultur hinzufügen. Wenn wir also das Conc in a zu unserer Zellkultur hinzufügen, wird es an den glykosylierten T-Zell-Rezeptor-Komplex binden und an mehrere Komplexe gleichzeitig binden, es wird das tun, was wir Capping nennen. Es wird sich also zusammenlagern, einen Cluster aller Rezeptoren an der Oberfläche der Zelle bilden, und das wird ein Aktivierungssignal in den T-Lymphozyten induzieren.

Nachdem die Zellen aktiviert wurden, werden sie explodieren. Sie werden sich also vergrößern und dann anfangen, Zytokine zu sezernieren. Ursprünglich dachten wir, dass TCGF hauptsächlich aus Interleukin zwei besteht, aber jetzt wissen wir, dass dies nicht wirklich der Fall ist.

Es enthält auch Interferon, gamma, TNF, alpha und wahrscheinlich auch Zytokine in sehr geringen Mengen, die gerade notwendig sind, um Zellen nach 48 Stunden am Leben zu erhalten. In Kultur haben die Zellen alle Zytokine produziert, die wir brauchen. Wir werden also die Zellen entfernen, und wenn wir die Zellen entfernt haben und wir nur den Überstand haben, haben wir immer noch etwas freies Konal in a im Snat. Und das wird ein Problem sein, denn wir wollen unseren T-Zell-Wachstumsfaktor wirklich nutzen, um das Wachstum der T-Zelllinien aufrecht zu erhalten.

Und wenn wir das Konval in einem freien Raum lassen, wird es die Zellen aktivieren, wenn wir nicht wollen, dass sie aktiviert werden. Um dieses Problem zu umgehen, fügen wir einen Überschuss an Zucker hinzu, der sich an alle freien Conc in a im Ate bindet. Es wird also vollständig inaktiviert und bindet nicht an andere glykosylierte Rezeptoren auf den Zellen, wenn wir das TCGF zur Kultur hinzufügen.

Also lasst uns loslegen. Der erste Schritt für dieses Experiment besteht darin, die Milz von Ratten direkt nach der Euthanasie zu entfernen. Das werde ich also gleich mit sterilen Instrumenten tun.

Und sobald ich die Milz entfernt habe, werde ich sie in PBS geben, ergänzt mit Antibiotika, und als Antibiotika verwende ich Penicillin und Streptomycin. Also lasst uns loslegen. Also sprühe ich die Ratte mit 70% Ethanol ein, um sicherzustellen, dass ich keine große Kontamination meiner Kultur habe.

Und dann werde ich hier mit meinen Instrumenten einen kleinen Schnitt in die Haut machen. Dann entferne ich die Muskelschicht und die Milz kommt genau hier zum Vorschein. Also nehme ich eine andere Pinzette, ziehe die Milz vorsichtig heraus, ohne sie zu beschädigen.

So entferne ich das verbindende Bindegewebe. Jetzt habe ich also eine Milz. Natürlich achte ich sehr darauf, nichts anderes in der Bauchhöhle zu beschädigen, denn jede Schädigung des Darms führt zu einer sofortigen Kontamination meiner Milz.

Und dann werde ich meine Milz in eine Röhre übertragen, die PBS plus Antibiotika enthält. Und diese Röhre halte ich auf Eis. Jetzt habe ich also die Milz von drei Ratten geerntet.

Wir sind also bereit zu gehen und eine einzellige Suspension aus dieser Milz herzustellen. Jetzt, da ich meine Milz habe, habe ich sie in eine Gewebekulturhaube gebracht, um daraus mit 70-Mikron-Zelltrainern eine Einzelzellsuspension herzustellen. Ich brauche also mehrere Dinge, um die einzellige Suspension aus der Milz herzustellen.

Ich brauche sterile Instrumente, eine Pinzette und eine Schere. Dann habe ich den Kolben einer sterilen 1-mil-Spritze in der Petrischale. Ich werde meine Milz in PBS plus Antibiotika stecken.

Und in eine andere Petrischale habe ich ein 70-Mikron-Zellsieb mit 10 Millilitern PBS plus Antibiotika gegeben. Der erste Schritt besteht also darin, sicherzustellen, dass die Milz sauber ist, denn wie Sie hier sehen können, gibt es noch kleine Stücke von Bindegewebe und ich werde sie entfernen, weil sie das Zellsieb sehr schnell verstopfen werden. Dafür schneide ich einfach ab, was ich nicht will, und werfe es in den Deckel der Petrischale.

Jetzt sind meine Milz also größtenteils sauber, also nehme ich die Milz einzeln, lege sie in den Zelltrainer und schneide sie in kleine Stücke. Und ich mische alle drei Falten. Der nächste Schritt besteht darin, eine einzellige Suspension herzustellen. Da ich also alles haben will, berühre ich den Zelltrainer natürlich überhaupt nicht und benutze den Kolben einer sterilen Ein-mil-Spritze, um meine Milzstücke durch den Zelltrainer zu drücken.

Und wie Sie an der Außenseite des Zelltrainers sehen können, werde ich eine einzellige Suspension herstellen. Beim ersten Mal habe ich noch ein paar kleine Milzstücke, aber ich werde schon die einzellige Suspension herausnehmen. Ich habe es bereits in ein 50-mil-Rohr umgefüllt, das ich auf Eis gelagert habe.

Und ich werde mein Zellsieb mit weiteren 10 mil PBS und Antibiotika auffüllen. Also nehme ich ungefähr 10 mil mehr meines PBS mit Antibiotika, es müssen nicht sehr genau 10 Minuten sein, wir waschen uns nur. Ich gebe es in das Zellsieb und verwende dann das gleiche Verfahren.

Ich gehe zurück zu meinem Spritzenkolben und drücke noch ein wenig durch das Ocid. Natürlich wird man nie alles durchbekommen, weil es Bindegewebe und kleine Fettstücke gibt, die ich nicht entfernen konnte und die im Zellsieb verbleiben. Den Großteil der Milz solltest du aber für das Zellsieb holen.

Und dann wiederhole ich genau das, was ich vorhin getan habe. Ich werde meine einzellige Suspension ernten und sie demselben Zahn hinzufügen. Inzwischen ist fast nichts mehr vom Sieb im Zellsieb übrig und das PBS, das herauskommt, ist viel klarer. Und ich werde einfach noch einmal waschen und wir sollten die meisten Zellen jetzt draußen haben.

Jetzt habe ich also meine einzellige Suspension von PLE-Zyten und ich werde sie einfach verkleinern, um sie zu palettieren. Es reicht also aus, acht bis 10 Minuten zu drehen. Jetzt haben wir unsere PLE-Zyten überarbeitet und haben eine schöne Palette.

Was ich also tun werde, ist, den Überstand loszuwerden und dann die roten Blutkörperchen zu entfernen. Ich werde also Myozyten suspendieren und ich werde Ammoniumchlorid verwenden. Es ist also eine SU, eine Lösung von 15 molaren Ammoniumchlorid, und ich werde fünf Milliliter pro Milz verwenden.

Da ich also drei Milz habe, werde ich 15 Milliliter Ammoniumchlorid verwenden und das auf Eis machen. Um also die Erythrozyten zu legen, werde ich sie drei Minuten lang sanft auf und ab spritzen. Okay, wir verwenden diese Einstellung mit der höheren Belichtung hier.

Jetzt habe ich also drei Minuten lang die Elektrozyten analysiert. Ich werde meine Tube mit PBS füllen oder du könntest auch Medium verwenden. Das soll die Osmolarität der Lösung wieder in den normalen Bereich für die Zellen bringen.

Und ich werde die Zellen wie zuvor acht bis 10 Minuten lang herunterdrehen, um sie zu pelletieren. Und dann wasche ich sie zweimal, indem ich das gleiche PBS mit Antibiotika verwende. Jetzt spannen wir also die Zellen nach dem Isieren der Elektrozyten herunter und machen uns keine Sorgen, wir bekommen nie eine hundertprozentige Freisetzung der Elektrozyten.

Die Palette ist also immer noch rot, aber der Überstand ist klarer. Und jetzt werde ich den Überstand leeren, die Palette zerbrechen, etwas PBS bis zu 50 mil hinzufügen, herunterschleudern und diesen Schritt noch einmal wiederholen, damit ich zwei Wäschen habe. Und dann kann ich mich selbst zählen. Ich habe Myozyten zweimal gewaschen und dann in Kulturmedium suspendiert und mit Ihrem Zytometer gezählt.

erwartungsgemäß. Aus drei Milz habe ich etwa 600 Millionen Zellen gewonnen, was zu erwarten ist, da eine Milz normalerweise 200 bis 250 Millionen Zellen liefert. Was ich jetzt also tun werde, ist, dass ich meine Zellen mit 2 Millionen pro Mill in meinem Medium aussäen werde, das mit 10% fetalem kalem Serum ergänzt wurde.

Und zu diesem Medium füge ich zwei Mikrogramm pro Mille Conc A hinzu, um die Zellen zu stimulieren. Und danach lege ich die Zellen einfach für 48 Stunden in den Inkubator. Die Zellen sind jetzt seit 48 Stunden im Brutkasten und wie ich Ihnen zeigen werde, sind sie ziemlich gut gewachsen.

Das Medium hat sich orange verfärbt. Nun sind wir also bereit, unsere Vorbereitungen für den TCGF abzuschließen. Wie Sie sich erinnern, habe ich con carnaval in a in my cell suspension hinzugefügt, um die Zellen zu aktivieren.

Der con carnaval in a ist also Lektin. Es wird den Zucker an alle Rezeptoren der T-Zelle binden und es wird all diese Zellen künstlich aktivieren. Das Problem, das wir jetzt haben, ist, dass wir immer noch einen Teil des Karnevals in a haben, im Überstand der Zelle S.

Und da wir in anderen T-Zellkulturen eine Schlinge verwenden werden, um die Zellen zu expandieren, wollen wir nicht, dass der Karneval in diesen Zellkulturen vorhanden ist. Um es loszuwerden, werde ich also einen Überschuss an Zucker hinzufügen, an den con naval in a bindet, und das ist der hier gezeigte Methyl-Alpha-D-Cyt. Und ich werde einen Überschuss dieses Zuckers hinzufügen, um ihn vollständig aufzulösen.

Und sobald das erledigt ist, werde ich meine Zellüberstände sterilfiltrieren und Ali-Flüssigkeiten einfrieren, um sie in den nächsten Wochen oder Monaten zu verwenden. Beginnen wir also mit diesem letzten Schritt. Also füge ich meinen Zellkulturüberstand zu 50-mil-Röhrchen hinzu, um sie drehen zu können, um die Zellen loszuwerden.

Also fülle ich einfach so viele Röhrchen wie nötig und das mache ich nicht in der Kulturhaube, ich könnte, aber da ich irgendeine Möglichkeit brauche, meine Lösung am Ende zu filtern, weil ich den Zucker hinzufüge, der nicht steril ist, mache ich das einfach auf der Bank. Es ist einfacher. Ich habe jetzt alle meine Zellen und den Überstand in meine 50-mil-Falcon-Röhrchen gegossen.

Also bringe ich sie zur Zentrifuge und schleudere sie etwa 10 Minuten lang. Und der einzige Grund, sie zu drehen, ist, die Zellen zu pelletieren, damit ich klare Überstände habe. Die Zellen sind jetzt nach unten gespannt, so dass der Überstand klar ist und das wollte ich sammeln.

Also werde ich den gesamten Überstand in einen sauberen 150-Quadratzentimeter-Kolben sammeln. Und in diese Flasche gebe ich den Zucker. Während sich die Zellen drehten, ich genug Zucker, um 15 Milligramm pro ml Überstand hinzuzufügen.

Ich lasse es vollständig los, lasse es sich auflösen, und danach werde ich meinen Überstand steril filtrieren. Jetzt füge ich den Zucker 15 Milligramm pro ml Überstand hinzu. Ich setze die Kappe wieder auf und da ich nicht unter sterilen Bedingungen arbeite, ist es egal, ob das Essen in die Kappe kommt, also mische ich, bis sich der gesamte Zucker aufgelöst hat.

Das sollte ziemlich schnell gehen. Ja, der gesamte Zucker ist jetzt aufgelöst. Alles, was ich tun muss, ist, dass der Sterilfilter übersteht und dann aliquotiere ich ihn.

Normalerweise mache ich also 10 bis 15 mil aliquots, die ich bei minus 20 Grad lagere. Solche Aliquots können mehrere Monate gelagert werden. Du kannst deinen TCGF auch im Kühlschrank aufbewahren, aber dann würde ich ihn innerhalb der nächsten 10 bis 15 Tage verwenden.

In den letzten zwei Tagen habe ich Ihnen gezeigt, wie Sie den T-Zell-Wachstumsfaktor herstellen können, und dieser Überstand ist sehr einfach herzustellen und sehr billig in der Zubereitung. Daher verwenden wir es sehr oft im Labor, um unsere T-Zelllinien in Kultur zu erhalten, ohne teure Cocktails aus Zytokinen kaufen zu müssen. Also viel Glück bei Ihren Experimenten.