Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Veränderungen der Proteinunlöslichkeit mit zunehmendem Alter in C.elegans zu detektieren und zu bewerten, wie ein gezielter Gen-Knockdown diesen Alterungsmarker beeinflusst. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Alterns und der Proteostase zu beantworten, z. B. warum Organismen im Alter kein gesundes Proteom aufrechterhalten können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, die Proteinaggregation während des normalen Alterns ohne Krankheitsprozesse zu untersuchen.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Proteinaggregation in C.elegans geben kann, kann sie auch an andere Modellorganismen angepasst werden, zum Beispiel zur Untersuchung der altersbedingten Proteinunlöslichkeit in der Maus. Zu Beginn der Behandlung werden 207,45 Milliliter S Basalmedium mit zusätzlichen Reagenzien, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, in einen 2.800 Milliliter Fernbach-Kulturkolben gegeben. Es wird eine Endkonzentration von 50 μg je Milliliter Carbenicillin und ein Millimolar IPTG zugegeben und der Kolben mit einem Membranschraubverschluss verschlossen.

Nehmen Sie die L1 aus dem 25 Grad Celsius Inkubator und füllen Sie sie in 15 Milliliter Röhrchen um. Zentrifugieren Sie die L1 bei 1.900 mal g für drei Minuten. Nach dem Schleudern den Überstand entfernen.

Zählen Sie unter einem Mikroskop die L1 pro zwei Mikroliter und mitteln Sie die Zahlen, die Sie aus mindestens neun Tropfen erhalten haben. Als nächstes werden 50.000 Würmer für die Sammlung junger Würmer und 100.000 Würmer für die Sammlung gealterter Würmer in vier Fernbach-Kulturfläschchen gegeben, die im vorherigen Schritt vorbereitet wurden. Fügen Sie dann Kontroll-RNAi-Bakterien und RNAi-Bakterien für das interessierende Gen proportional zur Anzahl der Würmer hinzu.

Nach der Zugabe von Bakterien die Wurmkultur mit S Basal abschließen, um das Gesamtvolumen auf 300 Milliliter zu bringen. Inkubieren Sie die Wurmkultur bei 25 Grad Celsius in einem Schüttelbrutkasten mit 150 U/min bis zur Entnahme. Sammeln Sie junge Würmer am zweiten oder dritten Tag, um die Basalwerte der Proteinlöslichkeit zu messen.

Gießen Sie die Würmer aus einem Kolben in einen Trenntrichter und lassen Sie die Würmer 10 Minuten bei Raumtemperatur sedimentieren. Nachdem sich die Würmer abgesetzt haben, öffnen Sie den Absperrhahn und tropfen Sie die Würmer in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes teilen Sie das Wurmpellet in zwei 15-Milliliter-Röhrchen auf.

Füllen Sie die Röhrchen auf 15 Milliliter mit M9 und zentrifugieren Sie die Schnecken. Um die Würmer zu waschen, entfernen Sie den Überstand und füllen Sie das Röhrchen bis zu 15 Milliliter mit M9. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Sobald der Waschvorgang abgeschlossen ist, geben Sie die Würmer in zwei 50-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie das Gesamtvolumen mit eiskaltem M9 auf 20 Milliliter auf.

Um Bakterien und tote Würmer zu entfernen, geben Sie die beiden 20 Milliliter verdünnten Wurmpellets in zwei 50 Milliliter Röhrchen, die mit 20 Millilitern eiskalter 60%iger Saccharose gefüllt sind. Zentrifugieren Sie die Röhrchen schnell. Entfernen Sie mit einer 25-Milliliter-Pipette vorsichtig bis zu 15 Milliliter der obersten Wurmschicht.

Legen Sie die oberste Wurmschicht direkt in 37 Milliliter M9 plus Octoxynol-9, das auf Eis zubereitet wurde. Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2.700 g für drei Minuten bei vier Grad Celsius Beschleunigung neun und Verzögerung sieben. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, füllen Sie das Pellet in vier 15-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie sie zweimal mit eiskaltem M9 plus Octoxynol-9.

Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen. Entfernen Sie den Überstand und füllen Sie die Röhrchen bis zur 15-Milliliter-Markierung mit eiskaltem M9 plus Octoxynol-9. Waschen Sie die Würmer mit eiskaltem M9 und kombinieren Sie die vier Röhrchen zu zwei Röhrchen.

Füllen Sie die Röhrchen auf 15 Milliliter und zentrifugieren Sie. Entfernen Sie den Überstand, füllen Sie die beiden Röhrchen mit M9 bei Raumtemperatur auf ein Gesamtvolumen von vier Millilitern und drehen Sie sie auf einem Nuktionsmischer bei 25 Grad Celsius für 40 Minuten. Nach dem Nutieren die Würmer zweimal mit eiskaltem M9 plus Octoxynol-9 waschen.

Waschen Sie sie dann zweimal mit M9 und geben Sie die Würmer in eine Tube. Waschen Sie die Würmer vor der Entnahme im Reassemblierungs- oder RAB-Puffer mit hoher Salzextraktion ohne Inhibitoren. Entferne den Überstand, bis sich keine Flüssigkeit mehr auf dem Wurmpellet befindet.

Schätzen Sie dann das Volumen des Wurmpellets und fügen Sie ein identisches Volumen RAB mit Inhibitoren hinzu. Bereiten Sie ein 50-Milliliter-Röhrchen vor, das zur Hälfte mit flüssigem Stickstoff auf Trockeneis gefüllt ist, und verwenden Sie eine Pasteurpipette, ziehen Sie die Würmer auf und tropfen Sie sie langsam in das Röhrchen. Lassen Sie den flüssigen Stickstoff verdampfen und lagern Sie die gefrorenen Würmer bis zur Weiterverarbeitung bei minus 80 Grad Celsius.

Kühlen Sie den Mörser mit flüssigem Stickstoff ab und führen Sie die Tierzerstörung auf Trockeneis durch. Die gefrorenen Würmer in den vorgekühlten Mörser geben und 2,5 Minuten zerkleinern. Geben Sie 100 Milliliter flüssigen Stickstoff in das Pulver und mahlen Sie es weitere 2,5 Minuten lang.

Überprüfe mit einem Mikroskop, ob die Wurmkörper in kleine Stücke zerbrochen sind. Dann füllst du das Pulver in zwei Milliliter-Röhrchen um und lagerst sie bei minus 80 Grad Celsius. Auf Trockeneis wiegen Sie zwei mal 350 Milligramm gemahlene Würmer pro Zeitpunkt und pro RNAi-Bakterien in zwei Milliliter-Röhrchen ab.

Um die hochsalzigen löslichen Proteine zu entfernen, fügen Sie jedem Röhrchen zwei Volumen pro Gewicht bereits vorbereiteter RAB mit Inhibitoren, ein Millimolare PMSF, 200 Einheiten pro Milliliter DNase I und 100 Mikrogramm pro Milliliter RNase A hinzu und lösen Sie das Pulver auf Eis auf. Ziehen Sie die Suspension 15 Mal in eine Ein-Milliliter-Spritze auf und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie bei 18, 400 mal g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.

Gehen Sie durch die Fettschicht und sammeln Sie den Überstand mit hochsalzlöslichen Proteinen in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen pro Zustand. Entfernen Sie das Fett und entsorgen Sie es. Aliquot hochsalzige lösliche Proteine, um bei minus 80 Grad Celsius einzufrieren.

Um Lipide zu verwerfen, solubisieren Sie das Pellet mit 700 Mikrolitern RAB mit Inhibitoren, die eine molare Saccharose ohne DNase I und RNase A enthalten. Ziehen Sie die Suspension 10 Mal in eine Spritze auf und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf Eis. Achten Sie darauf, alle Überstände und Lipide zu entfernen und zu entsorgen. Um SDS-lösliche Proteine zu entfernen, lösen Sie das Pellet mit 700 Mikrolitern RIPA-Puffer auf.

Ziehen Sie die Suspension 10 Mal in eine Spritze und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis. Bei 18.400 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Der Überstand mit den SDS-löslichen Proteinen wird aufgefangen und für das Einfrieren bei minus 80 Grad Celsius aliquotiert.

Nach der Solubilisierung jedes Pellets mit 500 Mikrolitern RIPA-Puffer werden zwei Proben jeder Bedingung zusammen gepoolt und die Suspension 10 Mal in eine Spritze aufgezogen. Achten Sie darauf, den gesamten Überstand zu entfernen und zu entsorgen. Solubilisieren Sie das endgültige Pellet mit leicht löslichen Proteinen mit 400 Mikrolitern 70%iger Ameisensäure und ziehen Sie die Suspension 20 Mal in eine Spritze auf.

Inkubieren Sie die Suspension 20 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Suspension in Ultrazentrifugenröhrchen, um Wurmhautreste zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand, der leicht lösliche Proteine enthält, und frieren Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius ein.

Die Gesamtproteinfärbung des Gehalts an unlöslichen Proteinen von jungen und gealterten Würmern ergab einen starken altersbedingten Anstieg der Spiegel an hochunlöslichen Proteinen bei Kontrolltieren und nicht bei langlebigen Tieren. Die Antikörperfärbung von PAB-1, einem RNA-bindenden Protein mit einer vorhergesagten prionenähnlichen Domäne, bestätigte massenspektrometrische Daten, dass langlebige Tiere PAB-1 mit zunehmendem Alter löslich hielten. In vivo wurde eine Analyse von transgenen Tieren durchgeführt, die tagRFP PAB-1 in den Pharynxmuskeln exprimierten.

Bei Jungtieren war tagRFP PAB-1 hauptsächlich diffus im gesamten Pharynx lokalisiert. Mit zunehmendem Alter kommt es zu einer fortschreitenden Anhäufung in hellen Punkten, beginnend im hinteren Rachenbulbus. Während des Alterns beobachteten wir auch bei einer zunehmenden Anzahl von Tieren eine Aggregation im vorderen Rachenkolben.

Die Quantifizierung verschiedener tagRFP PAB-1 Aggregationsniveaus mit dem Alter im Wildtyp und dem daf-2 mutierten Hintergrund zeigt eine stark verzögerte tagRFP PAB-1 Aggregation mit dem Alter bei langlebigen Tieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine große Anzahl von Würmern für die Proteinextraktion sammelt und wie man hochunlösliche große Aggregate für die weitere Analyse durch Massenspektrometrie oder SDS-Seite isoliert