Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Nutzern den Aufbau einer Hochdurchsatz-Sammlungs- und Verarbeitungspipeline für die Kryo-Elektronentomographie zu erleichtern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Kryo-Elektronentomographie zu beantworten, beispielsweise: Wie gehe ich mit Daten um, die mithilfe von Detektoren der neuen Generation aufgezeichnet wurden, und wie verarbeite ich die große Datenmenge, die von automatisierter Software zur Tilt-Serie-Aufnahme erzeugt wird? Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass der Nutzer mehrere Softwarepakete einheitlich konfigurieren kann, um eine effiziente Pipeline für die automatisierte Verarbeitung von Tilt-Serien zu finden, wodurch mehr Zeit für die Analyse von Tomogrammen zur Verfügung steht.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in der Kryo-ET sind, Schwierigkeiten, da viele mühsame Schritte erforderlich sind, um die großen Datenmengen zu verarbeiten, die vom Elektronenmikroskop erzeugt werden. Vor fünf Jahren hatten wir erstmals die Idee zu dieser Entwicklung, als wir hunderte von Arbeitsschritten manuell durchlaufen mussten, um eine 3D-Rekonstruktion eines einzigen Bakteriums zu erhalten. Konsultieren Sie vorab den Text-Protokoll zur Vorbereitung der Shigella flexneri-Minizellen.

Danach bereiten Sie die Elektronenmikroskopie-Gitter gemäß einer bereits veröffentlichten JoVE-Publikation sowie wie im Textprotokoll beschrieben vor. Nachdem die EM-Stage mit der Sammlung von Minizellen in vitrifiziertem Eis beladen wurde, beginnen Sie mit der Aufnahme von Niedrigvergrößerungs-Aufnahmen für die Kipp-Serie. Suchen Sie bei Betrachtung des Fluoreszenzschirms mit einer niedrigen Vergrößerung von etwa 2300x Gitterfelder, die für die Abbildung geeignet sind.

Dieser Bereich sollte dünnes Eis sowie das gewünschte Objekt ohne Verunreinigungen enthalten. Danach die Ansicht auf die Mitte des Gitterfelds ausrichten und auf die Schaltfläche „Stage Position hinzufügen“ klicken, um die Position zu speichern. Anschließend den Vorgang wiederholen, bis die Positionen aller geeigneten Gitterfelder gespeichert wurden.

Der nächste Schritt beginnt mit dem Öffnen einer neuen Montage-Datei. Legen Sie im Einrichtungsdialog X und Y so fest, dass das gesamte Gitterquadrat erfasst wird. Verwenden Sie für ein Standardgitter mit 200 Maschen einen Bereich von 10 mal 10 mit einem hohen Binning-Wert, beispielsweise acht.

Schalten Sie außerdem die Option zum Verschieben der Bühne anstelle der Bildverschiebung und die Option zum Überspringen der zur Ausrichtung der Stücke verwendeten Korrelationen um. Wählen Sie nun im Navigator-Fenster die erste Bühnenposition, die mit dem Erfassungsschalter erfasst werden soll. Fahren Sie fort, dies für jede Bühnenposition zu tun.

Klicken Sie anschließend im Navigator-Menü auf „Acquire at Points“. Aktivieren Sie im sich öffnenden Dialogfeld die Optionen „acquire map image“ und „rough eucentricity“. Deaktivieren Sie alle anderen Optionen.

Klicken Sie dann auf „Weiter“, und für jede Stellung der Probenebene wird eine Montage erstellt. Arbeiten Sie weiterhin mit der SerialEM-Software. Wählen Sie im Navigator die erfassten Karten aus, und klicken Sie auf „Karte laden“.

Klicken Sie anschließend auf „Punkte hinzufügen“ und wählen Sie die Punkte auf der Karte aus, an denen die Kippserie aufgenommen werden soll. Nach der Auswahl klicken Sie auf „Hinzufügen von Punkten beenden“ und wiederholen den Vorgang für jede aufgenommene Karte. Öffnen Sie danach die Parameter im Menü „Kamera“ und stellen Sie die Modi „Fokus“, „Test“ und „Aufnahme“ ein.

Die Möglichkeit, dosisgefraktionierte Daten aufzuzeichnen, könnte von besonderem Interesse sein; dies kann unter den Aufnahmeoptionen angegeben werden. Um fortzufahren, wählen Sie einen der Punkte in der derzeit angezeigten Karte aus und schalten Sie die Kippreihen-Option im Navigator-Fenster um. Wählen Sie im daraufhin erscheinenden Dialogfenster die Parameter für die Kippreihe aus.

Wiederholen Sie anschließend den Vorgang des Umschaltens der Tilt-Serie-Option für jeden der ausgewählten Punkte in der Karte. Starten Sie danach im Navigator die Option „An Punkten aufnehmen“. Aktivieren Sie im Dialogfeld die vorläufigen Aufgaben, die Neuausrichtung zum Objekt, die automatische Fokussierung und die grobe Euzentrik.

Dann legen Sie die Primäre Aufgabe auf die Aufnahme von Kipp-Serien fest und wählen Sie am Ende Schließung der Säule, um die Säule zu schließen, sobald alle Punkte erfasst wurden. Wenn der Vorgang ausgeführt wird, wird eine Kipp-Serie an jedem Punkt erfasst, der für die Kipp-Serien-Aufnahme in jeder Karte aktiviert wurde. Mit der ursprünglichen Kipp-Serie, dem Ausgabeprotokoll von SerialEM und den einzelnen dosisgefilterten Bildern im aktuellen Arbeitsverzeichnis führen Sie in einer Konsole den folgenden Befehl aus, um den strahlinduzierten Bewegungsartefakt zu entfernen.

Fahren Sie mit der Ausrichtung und Rekonstruktion der Kippreihe fort. Geben Sie im Terminal den Befehl tomoauto wie folgt ein. Fügen Sie dem Befehl den Dateinamen der zu verarbeitenden Kippreihe hinzu, gefolgt vom Durchmesser des Markers in Nanometern.

Wenn die CTF-Verarbeitung nicht gewünscht ist, lassen Sie die Option einfach aus dem Befehl weg. Dieser Befehl stellt die Hauptanwendung von tomoauto dar und ermöglicht es den Nutzern, alle Prozesse zur Ausrichtung einer Kippreihe, die ursprünglich manuelle Eingriffe erforderten, mit einem einzigen Befehl auszuführen, wodurch eine schnelle Skript-basierte Batch-Verarbeitung ermöglicht wird. Öffnen Sie nun mit dem 3dmod-Befehl die ausgerichtete Kippreihe und prüfen Sie sie auf offensichtliche Fehler.

Hierbei ist Dateiname der Name der Kipp-Serie ohne Suffix. Anschließend überprüfen Sie die geschätzte CTF mit dem hier gezeigten Befehl. Auch hier ist Dateiname der Name der Kipp-Serie ohne Suffix.

Prüfen Sie außerdem im Ausgabeprotokoll, das durch den tomoauto-Befehl erzeugt wird, den Restfehler der Ausrichtung. Dies ist ein quantitatives Maß für die Gesamtqualität der Ausrichtung. Falls die Ausrichtung akzeptabel ist, fahren Sie mit der Berechnung der Rekonstruktion fort.

Dieser Befehl dient zur Korrektur der CTF und zum Entfernen der in der Ausrichtung verwendeten Referenzpunkte aus der Kipp-Serie. Um die visuelle Überprüfung zu überspringen und direkt zur Rekonstruktion überzugehen, verwenden Sie diesen Befehl. Tomoauto bietet viele verfügbare Optionen.

Eine besondere Funktion ist die Möglichkeit, lokale Konfigurationen einzubinden, die durch eine Hilfsdatei gemäß der tomoauto-Dokumentation beschrieben werden. Fügen Sie den Namen dieser Datei in das Befehlszeilenfenster ein, indem Sie die Option für die lokale Konfiguration verwenden, bevor Sie den Dateinamen der Kippreihe anhängen. Die Möglichkeit, lokale Konfigurationsdateien zu erstellen, ist die leistungsstärkste Funktion von tomoauto und ermöglicht es den Nutzern, jeden verwendeten Befehl vollständig zu konfigurieren und die Ausführung an spezielle oder anspruchsvolle Datensätze anzupassen, während die automatisierte Verarbeitung beibehalten wird.

Im Testprotokoll befinden sich zusätzliche Anweisungen zur Durchführung der Sub-Tomogramm-Mittelung. Gemäß der beschriebenen Protokolle wurden zwei ausgerichtete Kippreihen mit tomoauto erstellt. Die feine Ausrichtung wird aus einem Modell berechnet, das idealerweise die Koordinaten der Referenzmarken definiert.

Bei 50 Grad verfolgte eine Kippreihe die Goldpartikel korrekt, was auf eine akzeptable Ausrichtung hinweist. Bei der zweiten Kippreihe hingegen wichen mehrere Modellpunkte, dargestellt in Rot, von ihren entsprechenden Goldmarkern ab, was zeigt, dass das Modell keine geeignete Ausrichtung erzeugte. Wenn Kippreihen aufgezeichnet werden, gelingt es tomoauto, 80 bis 90 % der aufgezeichneten Kippreihen erfolgreich auszurichten.

Nach der Rekonstruktion ist das endgültige Tomogramm ein 3D-Volumen der Bildprobe. Dieses kann anschließend für die zelluläre Annotation durch Segmentierung oder für die Sub-Tomogramm-Mittelung verwendet werden, um hochauflösende Informationen über die molekulare Maschinerie innerhalb der Probe zu erhalten. Der 2,7 Nanometer Sub-Tomogramm-Durchschnitt des angehefteten Shigella flexneri, der in der EMDB hinterlegt ist, zeigt die deutliche Verbesserung dieser Technik gegenüber der Betrachtung des Injectisoms in einem einzelnen Tomogramm.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kryo-Elektronentomographiedaten mithilfe von SerialEM und tomoauto automatisiert und mit hohem Durchsatz sammelt und verarbeitet. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann man bei ordnungsgemäßer Durchführung fast 100 Kippreihen an einem Tag aufnehmen und eine Kippreihe innerhalb von 20 Minuten ausrichten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets die Qualität der Ausrichtung der Kippreihen zu überprüfen.

Wenn sich ein Satz von Kippserien nicht gut ausrichtet, versuchen Sie eine manuelle Ausrichtung und übertragen Sie die Parameter auf eine lokale Konfiguration. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Sub-Tomogramm-Mittelung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Bestimmung der Struktur makromolekularer Komplexe mit höherer Auflösung. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern im Bereich der Kryo-EM den Weg, um hochauflösende In-situ-Strukturen in Bakterien, Viren und anderen Organismen zu untersuchen.