Probenvorbereitung für die In-situ-Kryotomographie von Säugetierzellen
December 15th, 2023
Diese Methode bietet ein zugängliches und flexibles Protokoll für die Herstellung von Elektronenmikroskopie-Gittern (EM) für die zelluläre In-situ-Kryotomographie und die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM).
Ziel dieser Forschung ist es, eine Methodik für die Probenvorbereitung zu entwickeln, die sowohl zugänglich als auch zuverlässig reproduzierbar ist. Auf diese Weise kann die Leistungsfähigkeit der direkten zellulären Kryo-Elektronentomographie genutzt werden, um eine Vielzahl biologischer Fragestellungen zu beantworten. Die Herausforderungen bei der Netzvorbereitung sind groß.
Zellen heften sich nicht ohne weiteres an Gitter, und die Manipulation kann zu einer Beschädigung der Kohlenstoffschicht führen, was zum Verlust von abbildbaren Gitterbereichen führt. Darüber hinaus wird die Prävalenz dünner zellulärer Ausstülpungen reduziert, ohne dass auf die richtigen Bedingungen für die Probenvorbereitung geachtet wird. Derzeitige Protokolle erfordern in der Regel spezielle Geräte, um die größten Engpässe beim Seeding zu lösen, wie z. B. Mikrostrukturierung und 3D-gedruckte Halterungen für die Zellanhaftung bzw. -manipulation.
Dieses Protokoll bietet Lösungen mit besserer Zugänglichkeit, während gleichzeitig die Flexibilität für die Verwendung dieser spezialisierten Tools für nachgelagerte Anwendungen erhalten bleibt.
Überblick
Diese Methode bietet ein zugängliches und flexibles Protokoll für die Vorbereitung von Elektronenmikroskopie-Rastern (EM) für in situ zelluläre Kryo-Tomographie und korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM). Das Protokoll geht auf Herausforderungen bei der Rastervorbereitung ein und gewährleistet die Zellbefestigung bei gleichzeitiger Minimierung der Beschädigung der Kohlenstoffschicht.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Elektronenmikroskopie
Hintergrund
- Direkte zelluläre Kryo-Elektronen-Tomographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die biologische Forschung.
- Die Rastervorbereitung ist entscheidend für erfolgreiche Bildgebung und Analyse.
- Aktuelle Methoden erfordern oft spezialisierte Geräte, was die Zugänglichkeit einschränkt.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, den Prozess zu vereinfachen und gleichzeitig Flexibilität zu erhalten.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer reproduzierbaren und zugänglichen Methodik für die EM-Rastervorbereitung.
- Verbesserung der Nutzbarkeit der Kryo-Elektronen-Tomographie in biologischen Studien.
- Bewältigung häufiger Herausforderungen bei der Zellbefestigung und Rasterintegrität.
Verwendete Methoden
- Glühkathodenentladungsbehandlung von Rastern zur Verbesserung der Zelladhäsion.
- Auftragung von bovinem Fibronektin zur Förderung der Zellbefestigung.
- Zellsaat- und Transfektionsverfahren für HIV-Molekularklonen.
- Einfrieren der Raster durch Eintauchen für Kryo-Elektronen-Tomographie-Bildgebung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Befestigung von Zellen an EM-Rastern mit minimaler Beschädigung.
- Beobachtung von HIV-produzierenden Zellen mittels Kryo-Korrelationsmikroskopie.
- Wirksame Erhaltung der Rasterintegrität während des Vorbereitungsprozesses.
- Demonstration der Reproduzierbarkeit des Protokolls in mehreren Versuchen.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll verbessert die Zugänglichkeit für die EM-Rastervorbereitung.
- Es ermöglicht die effektive Untersuchung zellulärer Prozesse mittels Kryo-Elektronen-Tomographie.
- Zukünftige Anwendungen können dieses Verfahren für verschiedene biologische Untersuchungen nutzen.
