Probenvorbereitung für die In-situ-Kryotomographie von Säugetierzellen
15. Dezember 2023
Diese Methode bietet ein zugängliches und flexibles Protokoll für die Herstellung von Elektronenmikroskopie-Gittern (EM) für die zelluläre In-situ-Kryotomographie und die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM).
Ziel dieser Forschung ist es, eine Methodik für die Probenvorbereitung zu entwickeln, die sowohl zugänglich als auch zuverlässig reproduzierbar ist. Auf diese Weise kann die Leistungsfähigkeit der direkten zellulären Kryo-Elektronentomographie genutzt werden, um eine Vielzahl biologischer Fragestellungen zu beantworten. Die Herausforderungen bei der Netzvorbereitung sind groß.
Zellen heften sich nicht ohne weiteres an Gitter, und die Manipulation kann zu einer Beschädigung der Kohlenstoffschicht führen, was zum Verlust von abbildbaren Gitterbereichen führt. Darüber hinaus wird die Prävalenz dünner zellulärer Ausstülpungen reduziert, ohne dass auf die richtigen Bedingungen für die Probenvorbereitung geachtet wird. Derzeitige Protokolle erfordern in der Regel spezielle Geräte, um die größten Engpässe beim Seeding zu lösen, wie z. B. Mikrostrukturierung und 3D-gedruckte Halterungen für die Zellanhaftung bzw. -manipulation.
Dieses Protokoll bietet Lösungen mit besserer Zugänglichkeit, während gleichzeitig die Flexibilität für die Verwendung dieser spezialisierten Tools für nachgelagerte Anwendungen erhalten bleibt.
Überblick
Diese Methode bietet ein zugängliches und flexibles Protokoll für die Vorbereitung von Elektronenmikroskopie-Rastern (EM) für in situ zelluläre Kryo-Tomographie und korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM). Das Protokoll geht auf Herausforderungen bei der Rastervorbereitung ein und gewährleistet die Zellbefestigung bei gleichzeitiger Minimierung der Beschädigung der Kohlenstoffschicht.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Elektronenmikroskopie
Hintergrund
- Direkte zelluläre Kryo-Elektronen-Tomographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die biologische Forschung.
- Die Rastervorbereitung ist entscheidend für erfolgreiche Bildgebung und Analyse.
- Aktuelle Methoden erfordern oft spezialisierte Geräte, was die Zugänglichkeit einschränkt.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, den Prozess zu vereinfachen und gleichzeitig Flexibilität zu erhalten.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer reproduzierbaren und zugänglichen Methodik für die EM-Rastervorbereitung.
- Verbesserung der Nutzbarkeit der Kryo-Elektronen-Tomographie in biologischen Studien.
- Bewältigung häufiger Herausforderungen bei der Zellbefestigung und Rasterintegrität.
Verwendete Methoden
- Glühkathodenentladungsbehandlung von Rastern zur Verbesserung der Zelladhäsion.
- Auftragung von bovinem Fibronektin zur Förderung der Zellbefestigung.
- Zellsaat- und Transfektionsverfahren für HIV-Molekularklonen.
- Einfrieren der Raster durch Eintauchen für Kryo-Elektronen-Tomographie-Bildgebung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Befestigung von Zellen an EM-Rastern mit minimaler Beschädigung.
- Beobachtung von HIV-produzierenden Zellen mittels Kryo-Korrelationsmikroskopie.
- Wirksame Erhaltung der Rasterintegrität während des Vorbereitungsprozesses.
- Demonstration der Reproduzierbarkeit des Protokolls in mehreren Versuchen.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll verbessert die Zugänglichkeit für die EM-Rastervorbereitung.
- Es ermöglicht die effektive Untersuchung zellulärer Prozesse mittels Kryo-Elektronen-Tomographie.
- Zukünftige Anwendungen können dieses Verfahren für verschiedene biologische Untersuchungen nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Robust sample preparation for in situ cryotomography of mammalian cells is critical for enabling high-resolution structural studies in native cellular contexts. This protocol addresses key bottlenecks in grid handling, cell attachment, and reproducibility, directly impacting the reliability of downstream imaging and integrative analyses. Improved accessibility and standardization in sample preparation enhance predictive confidence and portfolio decision-making in early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cellular ultrastructure for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by preserving native cell environments.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of molecular assemblies in situ.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for correlative imaging workflows.
- Standardizes grid preparation to ensure reproducibility and quantitative imaging outputs.
- Improves readiness for high-content screening and integrative microscopy platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Enables structural assessment of viral and cellular interactions in preclinical systems.
- Supports risk-adjusted advancement by providing high-fidelity morphological data.
Pipeline & Workflow Integration
This sample preparation protocol integrates at the interface of discovery biology and advanced imaging, supporting workflows from early mechanistic studies to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Provides reproducible sample preparation for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers standardized, high-quality grids for quantitative imaging and assay development.
- Analytics: Enables acquisition of robust structural data for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by maintaining cellular context in imaging outputs.
- Enterprise Reuse: Establishes a flexible, accessible protocol adaptable to diverse cell types and imaging modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in structural target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of sample preparation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing imaging failures.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, grid handling, and microscopy techniques.
- Needs access to glow discharge devices, biosafety cabinets, and plunge-freezing instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducible grid preparation and imaging quality.
- Adaptable to various adherent mammalian cell types with protocol modifications as needed.
- Grid fragility and manipulation remain practical limitations requiring careful handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Preparing Electron Microscopy (EM) Grids for Cellular Cryotomography
3:34
Cell Seeding and Transfection on Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
5:34
Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
