Name: Herstellung einer kristallinen Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Tinte für Knochenmark-abgeleitete Mastzellkultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Biokompatibilität von kristalliner Nanocellulose-Agarose-Bioink für Knochenmark-abgeleitete Mastzellen testen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Zytotoxizitätsprüfung vor 3D-Bioprinting-Experimenten.

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Wir danken Alberta Innovates für die Bereitstellung der CNC und Ken Harris und Jae-Young Cho für ihre technische Beratung bei der Vorbereitung der CNC/Agarose/D-Mannitol-Matrix. Wir danken auch Ben Hoffman, Heather Winchell und Nicole Diamantides für ihre technische Beratung und Unterstützung bei der Einrichtung und Kalibrierung des INKREDIBLE+ 3D-Bioprinters.

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</ol>

Diese Arbeit wurde vom National Research Council Canada und Alberta Innovates unterstützt.

Die Herstellung von biomimetischen 3D-Geweben erfordert die erfolgreiche Verschmelzung der Biotinte, die Komponenten der extrazellulären Matrix nachahmt, mit der zellulären Komponente(n), um physiologische Analoga von In-vivo-Geweben zu erzeugen. Dies erfordert die Verwendung von Primärzellen und nicht von transformierten Zellen bei der Herstellung physiologischer biomimetischer Gewebe. Primäre immunologische Zellen, wie Mastzellen, sind jedoch besonders anfällig für zytotoxische Wirkungen und phänotypische Verä...

Das jüngste Interesse an 3D-Kultursystemen und 3D-Bioprinting hat die Aufmerksamkeit auf Hydrogele und Hydrogel-Verbundwerkstoffe gelenkt. Diese Verbundwerkstoffe dienen als viskose, aber poröse Biomimetik und können aus bis zu 99 Gew.-% Wassergehalt bestehen, was mit biologischen Geweben vergleichbar ist1,2,3. Diese Eigenschaften von Hydrogel-Verbundwerkstoffen ermöglichen somit das Wachstum von Zellen, ohne ihre Lebensfähigkeit und Funktion zu beeinträchtigen. Ein solcher Verbundwerkstoff ist kristalline Nanocellulose (CNC), die als Verstärkungsmaterial in Hydrogel-Verbundwerkstoffen, Zellgerüsten bei der Entwicklung von Biomaterialimplantaten und in zweidimensionaler (2D) und 3D-in-vitro-Zellkultur4,5 verwendet wurde. In den meisten Fällen sind Matrizen, die aus CNC bestehen, nicht offen zytotoxisch für menschliche Hornhautepithelzellen6, Darmepithelzellen7, aus dem menschlichen Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen8 oder neuronenähnliche Zellen9. Die metabolische Aktivität und Proliferation von mesenchymalen Stammzellen aus dem menschlichen Knochenmark nimmt jedoch in Korrelation mit der erhöhten Viskosität von Nanocellulose-Verbundwerkstoffen auf Holzbasis ab, was darauf hindeutet, dass die Zusammensetzung der Matrix sorgfältig auf ihre schädlichen Auswirkungen auf die Zellfunktionen getestet werden muss8.
In ähnlicher Weise kann CNC bei der Internalisierung Entzündungsreaktionen in Makrophagen hervorrufen, die schwerwiegende Folgen in 3D-Immunzellkultursystemen haben könnten10,11. Tatsächlich gibt es nur sehr wenige Daten darüber, wie CNC andere Immunzellantworten beeinflussen kann, insbesondere allergische Entzündungsreaktionen, die von Mastzellen initiiert werden. Mastzellen sind granulierte Leukozyten, die den hochaffinen IgE-Rezeptor FceRI exprimieren, der für die Aktivierung von Entzündungsreaktionen auf Allergene verantwortlich ist. Ihre Proliferation und Differenzierung sind abhängig vom Stammzellfaktor (SCF), der den Tyrosinrezeptor Kit bindet. Mastzellen werden aus Vorläuferzellen des Knochenmarks gewonnen, die in den Kreislauf gelangen und anschließend peripher wandern, um sich ubiquitär in allen menschlichen Geweben zu verteilen12. Da Mastzellen in einer 3D-Gewebeumgebung funktionieren, sind sie ein idealer Immunzellkandidat für die Untersuchung immunologischer Prozesse in in vitro 3D-Gewebemodellen. Bis heute gibt es jedoch kein brauchbares in vitro 3D-Gewebemodell, das Mastzellen enthält.
Aufgrund der hochempfindlichen Natur von Mastzellen und ihrer Neigung, entzündungsfördernde Reaktionen auf äußere Reize hervorzurufen, ist eine sorgfältige Berücksichtigung der 3D-Matrixbestandteile und der Bioprinting-Methode zur Einführung von Mastzellen in das 3D-Gerüst erforderlich, wie weiter diskutiert. Gewebekonstrukte können aus zwei großen Kategorien von Biomaterialien biofabriziert werden, nämlich Biotinten und Biomaterialtinten. Der Unterschied liegt in der Tatsache, dass Biotinten zellbeladene Hydrogel-Verbundwerkstoffe sind, während Biomaterial-Tinten Hydrogel-Komposite sind, die frei von Zellen sind, wie von Groll et al.13,14 definiert. Daher enthalten 3D-Konstrukte, die mit Biotinten gedruckt werden, Zellen, die in die Hydrogelmatrix eingebettet sind, während 3D-Konstrukte, die mit Biomaterialtinten gedruckt werden, mit Zellen nach dem Drucken ausgesät werden müssen. Die Biofabrikation von Kulturgerüsten aus Hydrogel-basierten Biotinten/Biomaterialtinten wird am häufigsten mit Extrusions-3D-Bioprintern durchgeführt, die die Bioink-/Biomaterialtinte durch eine mikroskalige Düse unter Druck entweder über einen pneumatisch oder mechanisch angetriebenen Kolben extrudieren14. Extrusionsbioprinter stellen 3D-Gerüste her, indem sie die Bioink in 2D-Querschnittsmustern ablegen, die nacheinander in einem "Bottom-up" -Ansatz aufeinander gestapelt werden.
Um mit dem Extrusions-Bioprinting kompatibel zu sein, muss die Hydrogel-basierte Bioink/Biomaterial-Tinte thixotrope (scherverdünnende) Eigenschaften besitzen, wobei die konstituierenden Hydrogelpolymere der Bioink/Biomaterial-Tinte bei Scherspannung wie eine Flüssigkeit durch eine Mikrokanaldüse fließen, aber bei Entfernung der Scherspannung in einen viskosen, gelartigen Zustand zurückkehren15 . Aufgrund ihres hohen Wassergehalts müssen die Polymere von Hydrogel-basierten Biotinten / Biomaterialtinten entweder physikalisch oder kovalent vernetzt werden, um die Architektur und strukturelle Integrität der 3D-biogedruckten Struktur zu erhalten. Bei zellbeladenen Biotinten werden die Zellen während des Vernetzungsprozesses direkt chemischen Belastungen ausgesetzt. Der Prozess der Extrudierung von Zellen, die in der Bioink-Hydrogel-Matrix eingekapselt sind, setzt die Zellen auch Scherstress aus, was zu einer verminderten Lebensfähigkeit und / oder zum Zelltod führen kann. Sobald das 3D-Gewebemodell biogedruckt wurde, ist es schwierig, zwischen dem Grad der Zytotoxizität, der durch die Hydrogelmatrix selbst hervorgerufen wird, und den Extrusions- bzw. Vernetzungsprozessen zu unterscheiden. Dies ist besonders herausfordernd im Zusammenhang mit 3D-Gerüsten, bei denen die Zellen in die Hydrogelmatrix eingebettet sind, was es schwierig macht, die Zellen für nachfolgende Analysen zu entfernen, was die Lebensfähigkeit von Mastzellen beeinträchtigen würde.
Ein schonenderer Ansatz zur Erzeugung von 3D-Gewebekonstrukten, die Mastzellen enthalten, besteht darin, die Zellen in vorgedruckte, poröse Biomaterial-Tinten-3D-Gerüste aus einer Zellkultursuspension zu säen, die die angeborene Fähigkeit von Mastzellen nutzt, aus dem Kreislauf in periphere Gewebe zu wandern. Die Vorteile dieses Zellsaatansatzes sind zweifach: (i) Die Mastzellen werden keiner Scher- bzw. chemischen Belastung durch die Extrusions- bzw. Vernetzungsprozesse ausgesetzt, und (ii) die Zellen können nach der Exposition durch sanftes Waschen zur Analyse leicht aus dem 3D-Gerüst entfernt werden, ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Der zusätzliche Vorteil der Aussaat und Analyse der Zelllebensfähigkeit von Mastzellen auf 3D-biogedruckten, porösen Hydrogel-Gerüsten im Gegensatz zu 2D-Hydrogel-Scheiben besteht darin, dass die 3D-biogedruckten Hydrogel-Gerüste mikroskalige topographische Merkmale von In-vivo-Geweben rekapitulieren, die in großen, planaren 2D-Hydrogelscheiben nicht vorhanden sind. Dieser Ansatz ist ein geeigneter, schneller und kostengünstiger Ansatz, um die potenziell katastrophalen zytotoxischen Wirkungen von Bioink-Hydrogel-Matrices auf Mastzellen sowie andere immunologische Zellen zu bestimmen, bevor in kostspielige 3D-Tissue-Engineering-Experimente investiert wird.

<table><tbody><tr><td><stark>A</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure (eiskalt)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AX0074-6</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (OmniPur)</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>2125-500GM</td><td></td></tr><tr><td>Armenischer Hamster IgG Isotyp Kontrolle, APC (Klon: eBio299Arm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-4888-82</td><td></td></tr><tr><td><stark>B</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>b-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Natriumsalz (NAD)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>BD 5 mL Spritze (Luer-Lok-Spitze)</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Nadel 26G x 1/2 Zoll</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 24 Well Multidish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>930-186</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96 Well Multidish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130-188</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 175 cm2 Trinkflasche belüftet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130-191</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank Klasse II</td><td>Microzone Corp., Kanada</td><td>BK-2-6-B3</td><td></td></tr><tr><td>BSA, Fraktion V (OmniPur)</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>2930-100GM</td><td></td></tr><tr><td>C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>CD117 (c-Kit) Monoklonaler Antikörper, PE (Klon: 2B8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-1171-82</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Kartusche)</td><td>CELLINK LLC</td><td>IK1020000303</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK CaCl2 Vernetzungsmittel - Sterile Flasche 1 x 60 mL</td><td>CELLINK LLC</td><td></td><td></td>CL1010006001</tr><tr><td>CELLINK Leere Patronen 3cc mit End- und Spitzenkappen</td><td>CELLINK LLC</td><td>CSC0103000102</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK HeartWare für PC</td><td>CELLINK LLC</td><td>Version 2.4.1</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER</td><td>CELLINK LLC</td><td>S-10003-001</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK Sterile Standard Konische Bioprinting-Düsen 22G</td><td>CELLINK LLC</td><td></td><td></td> NZ4220005001</tr><tr><td>CELLINK Sterile Standard Konische Bioprinting-Düsen 25G</td><td>CELLINK LLC</td><td></td><td></td></tr> NZ4250005001 <tr><td>CELLINK Sterile Standard Konische Bioprinting-Düsen 27G</td><td>CELLINK LLC</td><td></td><td></td></tr> NZ4270005001 <tr><td>Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11465015001</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge (Tisch)</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar&nbsp; 96 Well Klarer flacher Boden unbehandelte PS-Mikroplatte</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3370</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>Binder GmbH, Deutschland</td><td>9040-0113</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Durchflusszytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>A00-1-1102</td><td></td></tr><tr><td>D</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-390-7100GM</td><td></td></tr><tr><td>F</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL konische Röhrchen aus Polystyrol, sterile</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL konische Röhrchen aus Polystyrol, steriler monoklonaler</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FceR1 alpha Antikörper, APC (Klon: MAR-1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5898-82</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS), qualifiziert, Hitze inaktivierte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12484028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>Becton Dickinson & Co. USA</td><td>Version 10.6.2</td><td></td></tr><tr><td>G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, LLC</td><td>Version 8.4.3</td><td></td></tr><tr><td>H</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer (Verbessert Neubauer 0,1 mmm Tiefenabgabe)</td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Natriumsalz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodnitrotetrazoliumchlorid (INT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I10406-5G</td><td></td></tr><tr><td>L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Lithium-L-Laktat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2250-100G</td><td></td></tr><tr><td>M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäuren 100 mL 100x (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1-Methoxy-5-methylphenaziniummethylsulfat (MPMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8640</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen (1,7 mL klar)</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen (2,0 mL klar)</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Academic (für die Herstellung von MilliQ Reinstwasser)</td><td>Millipore</td><td>ZMQS60001</td><td></td></tr><tr><td>N</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow Filtereinheit 90 mm (0,2 mm Porengröße, 500 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Spritzenvorsatzfilter (0,2 mm PES, 25 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>725-2520</td><td></td></tr><tr><td>P</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4, ohne Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid, 1,0 mg/ml (Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>R</td>Rat IgG2b Kappa-Isotyp-Kontrolle<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, PE (Klon: eB149/10H5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IL-3</td><td>PeproTech, Inc.&nbsp;</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1X + 2,05 mM L-Glutamin (HyClone)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sarstedt 96 Well runde Basis PS transparente Mikro-Testplatte (82.1582.001)</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC9913213</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid, 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM) 100X (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (2-Amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propandiol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung (0,4%, für die Mikroskopie)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>V</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VARIOSKAN LUX Mikroplatten-Spektralphotometer (Typ: 3020)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00D0</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung einer kristallinen nanocellulose embedded agarose biomaterial tinte für knochenmark-abgeleitete mastzellkultur

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

Das dreidimensionale (3D) Bioprinting verwendet Hydrogel-basierte Verbundwerkstoffe (oder Biomaterialtinten), die in einem Muster abgeschieden werden und ein Substrat bilden, auf dem Zellen abgeschieden werden. Da viele Biomaterialtinten potenziell zytotoxisch für Primärzellen sein können, ist es notwendig, die Biokompatibilität dieser Hydrogel-Verbundwerkstoffe vor ihrer Verwendung in kostspieligen 3D-Tissue-Engineering-Prozessen zu bestimmen. Einige 3D-Kulturmethoden, einschließlich Bioprinting, erfordern, dass Zellen in eine 3D-Matrix eingebettet werden, was es schwierig macht, die Zellen auf Veränderungen der Lebensfähigkeit und Biomarkerexpression zu extrahieren und zu analysieren, ohne mechanische Schäden hervorzurufen. Dieses Protokoll beschreibt als Proof of Concept eine Methode zur Bewertung der Biokompatibilität eines kristallinen Nanocellulose (CNC) eingebetteten Agarose-Verbundwerkstoffs, der zu einem 24-Well-Kultursystem mit aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Mastzellen (BMMCs) unter Verwendung von durchflusszytometrischen Assays für zelllebensfähigkeit und Biomarkerexpression hergestellt wird.
Nach 18 h Exposition gegenüber der CNC/Agarose/D-Mannitol-Matrix war die BMMC-Lebensfähigkeit unverändert, gemessen anhand der Propidiumiodidid (PI)-Permeabilität. BMMCs, die auf dem CNC/Agarose/D-Mannitol-Substrat kultiviert wurden, schienen jedoch ihre Expression des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) und des Stammzellfaktorrezeptors (Kit; CD117), obwohl dies nicht von der Menge an CNC im Bioink-Verbundwerkstoff abhängig zu sein scheint. Die Lebensfähigkeit von BMMCs wurde auch nach einer zeitlichen Exposition gegenüber Hydrogelgerüsten bewertet, die aus einer kommerziellen Biomaterialtinte hergestellt wurden, die aus fibrillerer Nanocellulose (FNC) und Natriumalginat unter Verwendung eines 3D-Extrusionsbioprinters hergestellt wurde. Über einen Zeitraum von 6-48 h beeinträchtigten die FNC/Alginat-Substrate die Durchflusszytometrie und Mikrotiterassays (XTT und Laktatdehydrogenase) ermittelte Lebensfähigkeit der BMMCs nicht. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode, um die biochemische Kompatibilität von Kandidaten-Biomaterialtinten schnell auf ihren Nutzen als 3D-Gerüste für das Post-Print-Seeding mit Mastzellen zu überprüfen.

Eine der wichtigsten Eigenschaften einer erfolgreichen Biomaterialtinte oder eines Kultursubstrats ist die Biokompatibilität. In erster Linie darf das Substrat keinen Zelltod induzieren. Es gibt mehrere mikrotiterbasierte und durchflusszytometrische Methoden zur Quantifizierung der Zelllebensfähigkeit und Nekrose; Diese Methoden sind jedoch nicht für die Analyse von Zellen geeignet, die in eine Hydrogelmatrix eingebettet sind. In diesem Protokoll wird die oben genannte Einschränkung umgangen, indem die BMMCs auf das Hydr...

Dieses Protokoll hebt eine Methode zur schnellen Bewertung der Biokompatibilität einer kristallinen Nanocellulose (CNC)/Agarose-Verbundhydrogel-Biomaterialtinte mit aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Mastzellen in Bezug auf die Zelllebensfähigkeit und die phänotypische Expression der Zelloberflächenrezeptoren Kit (CD117) und des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) hervor.

Herstellung einer kristallinen Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Tinte für Knochenmark-abgeleitete Mastzellkultur

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

Dieses Protokoll bietet einen einfachen und schnellen Ansatz, um Kandidaten-Biomaterialtinten vor komplexen 3D-Bioprinting-Experimenten auf mögliche zytotoxische Wirkungen gegen empfindliche Primär- und Immunzellen zu untersuchen. Nach der Inkubation der Immunzellen auf den Biomaterial-Tintenkonstrukten können die Zellen durch sanftes Waschen leicht aus den Konstrukten entnommen werden, um nachgeschaltete Zytotoxizitäts- oder Biomarkeranalysen durchzuführen. Dieses Protokoll ist direkt relevant für das Tissue Engineering, bei dem biogedruckte Gewebe, die für die Transplantation bestimmt sind, aus Primärzellen und biokompatiblen Biomaterialtinten hergestellt werden müssen.Bereiten Sie zunächst eine Bio-Tintenpatrone für die Installation auf dem INKREDIBLE+3D-Bioprinter vor. Entfernen Sie zunächst die blauen Endkappen von der drei Milliliter großen Biomaterial-Tintenpatrone und befestigen Sie eine sterile konische 22-Gauge-Bioprinting-Düse am Luer-Lock-Ende der Bio-Tintenpatrone. Schließen Sie den Luftdruckzufuhrschlauch für Druckkopf eins oder PH1 an das gegenüberliegende Ende der Patrone an und setzen Sie die Patrone mit der angeschlossenen konischen Bioprinting-Düse in den vertikalen Schlitz von PH1 ein.Setzen Sie als Nächstes die Patrone fest in PH1 mit einer konischen Bioprinting-Düse ein, die sich unter den Druckkopf erstreckt. Ziehen Sie die Schraube am PH1 im Uhrzeigersinn fest, bis der Finger fest sitzt, um die Bio-Tintenpatrone zu verriegeln. Beachten Sie, dass der 3D-Bioprinting mit ph2 durchgeführt werden kann, der leer bleibt.Schalten Sie den Bioprinter ein und starten Sie die Bioprinter-Software auf einem PC, der über ein USB 2.0-Kabel mit dem 3D-Bioprinter verbunden ist. Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche Verbinden, um sie mit dem 3D-Bioprinter zu synchronisieren. Beachten Sie drei Optionen im Hauptsteuerungsmenü des 3D-Bioprinters.Bereiten Sie zunächst den Bioprint vor. Zweitens, Dienstprogramme Menü. Und drittens, Statusbildschirm.Wählen Sie die Option Bioprint vorbereiten aus, scrollen Sie dann nach unten und wählen Sie die Option Home-Achsen aus. Nach erfolgreicher Kalibrierung der XYZ-Achsen sinkt die Höhe des Druckbetts leicht ab und die Druckköpfe verschieben sich über den Mittelpunkt des Druckbetts. Um mit der Ausgangspunktkalibrierung für das Bioprinting in 24-Well-Platten fortzufahren, entfernen Sie eine sterile 24-Well-Kulturplatte aus der versiegelten Plastikverpackung und markieren Sie einen Punkt auf dem Mittelpunkt von Well D1 auf der Unterseite der Platte mit einem Permanentmarker.Entfernen Sie die Plattenabdeckung und legen Sie die 24-Well-Kulturplatte auf das Druckbett mit der Vertiefung D1 in der vorderen linken Ecke des Druckbetts. Wählen Sie im Hauptsteuerungsmenü das Menü Dienstprogramme aus, und verschieben Sie dann die Achse. Bewegen Sie die Druckköpfe in Schritten von einem Millimeter entlang der X- und Y-Achse, bis sich die konische Bioprinting-Düse von PH1 direkt über dem Punkt befindet, der unter vertiefung D1 markiert ist. Passen Sie bei Bedarf die Position der konischen Bioprinting-Düse über dem Punkt ab, indem Sie die Druckköpfe in Schritten von 0,1 Millimetern bewegen.Zeichnen Sie die X- und Y-Koordinaten der konischen Bioprinting-Düse auf, wenn Sie sich direkt über der Mitte der Vertiefung D1 befinden, wie im Bedienfeldbildschirm des 3D-Biodruckers angegeben, und markieren Sie die Koordinaten. Als nächstes heben Sie das Druckbett in Schritten von einem Millimeter an, bis der Boden der Vertiefung D1 fast die konische Bioprinting-Düse berührt, die im ersten Druckkopf installiert ist. Feinabstimmung der Bewegung des Druckbettes in 0,1-Millimeter-Schritten, falls erforderlich.Wählen Sie im Dienstprogrammmenü die Option Z-Achsen-Kalibrierung und wählen und bestätigen Sie die Option Z-Kalibrierung speichern. Kehren Sie zum Hauptmenü zurück und wählen Sie die Option Bioprint vorbereiten. Scrollen Sie nach unten zu und wählen Sie die Option Z kalibrieren aus.Aktualisieren Sie den geometrischen Code der 24-Well-Platte oder den G-Code mit den richtigen Startpunktkoordinaten. Öffnen Sie die mitgelieferte 24-Well-G-Code-Datei in der Bioprint-Software. Aktualisieren Sie die X- und Y-Koordinaten in Zeile eins mit den in den vorherigen Schritten erhaltenen Werten und speichern Sie die Datei unter einem neuen Namen.Stellen Sie sicher, dass die pneumatische Pumpe fest mit dem hinteren Luftansauganschluss des INKREDIBLE+3D-Biodruckers verbunden ist, und schalten Sie ihn ein. Ziehen Sie den vorderen Steuerknopf auf der rechten Seite des INKREDIBLE+3D-Biodruckers heraus. Stellen Sie sicher, dass die digitalen Manometer für PH1 und PH2, die sich auf der Vorderseite des Biodruckers befinden, jeweils nahezu null Kilopascal lesen.Drehen Sie den vorderen Steuerknopf langsam im Uhrzeigersinn, bis der auf dem linken Messgerät für PH1 angezeigte Druck 12 Kilopascal erreicht. Legen Sie ein gefaltetes Seidenpapier oder ein Stück wasserdichte Dichtungsfolie unter die Druckdüse der installierten Patrone und achten Sie darauf, die Druckdüse nicht zu berühren. Wählen Sie im Hauptsteuerungsmenü des 3D-Bioprinters die Option Bioprint vorbereiten aus.Navigieren Sie zu PH1 aktivieren, und wählen Sie PH1 aktivieren aus. Beachten Sie, dass die Bio-Tinte aus der Druckdüse zu extrudieren beginnt. Erhöhen Sie bei Bedarf den Extrusionsdruck, indem Sie den Steuerknopf im Uhrzeigersinn drehen, bis die Biotinte in einem kontinuierlichen Filament extrudiert ist, und zeichnen Sie die neue Druckeinstellung auf.Wählen Sie PH1 deaktivieren, um die Extrusion der Biotinte zu stoppen. Entfernen Sie Seidenpapier oder -folie, die die extrudierte Biotinte enthält, aus dem Druckbett und schließen Sie die Bioprinter-Tür. Um den 3D-Biodruck von geradlinigen Hydrogelsubstraten in einem 24-Well-Plattenformat durchzuführen, wählen Sie das Dienstprogrammmenü aus dem Hauptsteuerungsmenü und wählen Sie dann SD-Druck deaktivieren, damit die Bioprinter-Software G-Code-Dateien zum Drucken an den 3D-Bioprinter übertragen kann.Klicken Sie auf die Schaltfläche Laden in der Bioprinter-Software und wählen Sie die aktualisierte 24-Well-Platten-G-Code-Datei aus. Wählen Sie im rechten Bedienfeld der Software die Registerkarte Druckvorschau und klicken Sie auf die Schaltfläche Drucken, um mit dem Bioprinting in Bohrloch D1 zu beginnen. Nach Abschluss des Bioprintings der geradlinigen Konstrukte decken Sie die 24-Well-Platte mit ihrem Deckel ab und bringen Sie sie in eine Biosicherheitswerkbank der Klasse II. Tauchen Sie jedes geradlinige Konstrukt in zwei Tropfen steriler 50-millimoler Calciumchloridlösung und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Saugen Sie die Calciumchloridlösung vorsichtig aus jedem Bohrlochkonstrukt ab und spülen Sie sie einmal in einem Milliliter 1X PBS ab, um überschüssiges Calciumchlorid zu entfernen. Um eine Austrocknung der biogedruckten Hydrogelkonstrukte zu verhindern, halten Sie die 3D-biogedruckten geradlinigen Konstrukte in frischem 1X PBS, bis die aus dem Knochenmark stammenden Mastzellen bereit sind, auf die Konstrukte gesät zu werden. Basierend auf den Vorwärts- und Seitenstreuparametern der mittels Durchflusszytometrie analysierten BMMCs wurde beobachtet, dass das Hydrogelsubstrat mit der höchsten CNC-Konzentration die native Größe oder Granularität der BMMCs im Vergleich zu den BMMCs, die in Abwesenheit der CNC-Agarose D-Mannitol-Hydrogel-Substrate kultiviert wurden, nicht veränderte.Die durchflusszytometrische Analyse der Permeabilität der BMMCs gegenüber Propidiumiodid zeigte, dass keine der getesteten CNC-Konzentrationen nachteilige Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit von BMMC hatte. Das CNC-Agarose-Substrat erhöhte die Expression der Mastzell-Biomarker bei CNC-Konzentrationen größer oder gleich 2,5%, die Expressionsniveaus dieser Rezeptoren blieben jedoch relativ konstant zwischen 2,5% und 12,5% CNC, was auf einen Effekt hindeutet, der unabhängig von der Konzentration von CNC ist. Der XTT-Assay zeigte, dass die metabolische Aktivität der auf den 3D-biogedruckten Hydrogelgerüsten kultivierten BMMCs über alle getesteten Zeitpunkte hinweg relativ konstant bei etwa 100% blieb.Ebenso zeigten die LDH-Freisetzungs- und PI-Farbstoffausschluss-Assays keine signifikanten Veränderungen in der Lebensfähigkeit der BMMCs. Sorgfältige Aufmerksamkeit bei der Auswahl des Druckdüsenmessgeräts, der Kalibrierung der Achsen des 3D-Biodruckers und der Extrusionsdruckeinstellung gewährleistet einen reproduzierbaren Druck hochwertiger 3D-Konstrukte. Die Leichtigkeit, mit der die Mastzellen abgerufen werden können, ermöglicht es, sie durch eine breite Palette biologischer Assays zu untersuchen, um jeden Aspekt ihrer zellulären Funktionen weiter zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Quelle: Arias, S. L., et al. Herstellung einer funktionalisierten magnetischen bakteriellen Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikeln.  J. Vis. Exp. (2016).Dieses Video demonstriert die Herstellung von Nanocellulose durch die Kultivierung zelluloseproduzierender Bakterien in einem nährstoffhaltigen Medium mit Mannitol. Die Bakterien metabolisieren Mannitol zu Glukose, das dann polymerisiert und als Glukoseketten extrudieren wird, die zu Zellulosefolien kristallisieren und so eine...

Herstellung von bakteriellen Nanocellulose-Pellikeln aus zelluloseproduzierenden Bakterien

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung einer bakteriellen Nanocellulose (BNC) magnetisch für Anwendungen bei der Rekonstruktion geschädigter Blutgefäße. Das BNC wurde durch den Stamm G. xylinus synthetisiert. Andererseits wurde die Magnetisierung des BNC durch in situ Ausfällung von Fe2+ und Fe3+ Eisenionen innerhalb des BNC-Netzes realisiert.

Die Herstellung einer funktionalisierter magnetischer bakterielle Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikel

Knorpel und Haut Analoga wurden Bioprinted mit einem Nanocellulose-Alginat-basierten Bioink. Die Bioinks wurden vor dem Druck über einen einzigen Schritt passive Mischeinheit cellularized. Die Konstrukte wurden demonstriert werden gleichmäßig cellularized, haben hohe Rentabilität und günstige Marker der Differenzierung aufweisen.

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Dieses Protokoll beschreibt eine Plattform für die Herstellung von selbst-zusammengebauten Gewebe Ringe in variablen Größen mit einer angepassten 3D-gedruckten Kunststoff-Formenbau. PDMS-negative sind in der Form 3D-gedruckten geheilt; dann wird Agarose in die ausgehärtete PDMS negative gegossen. Zellen sind in die resultierende Agarose-Brunnen gesät, wo sie ins Gewebe Ringe aggregieren.

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Die drei kritischen Schritte dieses Protokolls i) entwickeln die richtige Zusammensetzung und Konsistenz der Zellulose Hydrogel Tinte, Ii) 3D Drucken von Gerüsten in verschiedenen Strukturen mit guter Form Treue und Dimensionen und (Iii) Demonstration der pore der mechanische Eigenschaften im simulierten Körper Bedingungen für die Knorpelregeneration.

3D-Druck poröse Zellulose Nanocomposites Hydrogel Gerüste

Präsentiert hier ist eine Methode für den 3D-Bioprinting von Gelatine Methacryloyl.

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Hier berichten wir über eine Methode des 3D-Bioprintings muriner kortikaler Astrozyten zur Bioschmierung neuraler Gewebe, um die Funktionalität von Astrozyten im zentralen Nervensystem und die Mechanismen von Gliazellen bei neurologischen Erkrankungen und Behandlungen zu untersuchen.

3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten für die Entwicklung von neuralähnlichem Gewebe

Dieses Protokoll beschreibt eine 3D-Drucktechnik zur Herstellung knochenähnlicher Strukturen durch Abscheiden einer Calciumphosphat-Tinte in einem körnigen Träger auf Gelatinebasis. Gedruckte Knochenanaloga werden in Freiform abgeschieden, mit Flexibilität für die direkte Ernte des Drucks oder die Vernetzung innerhalb einer lebenden Zellmatrix für mehrphasige Konstrukte.

Keramisches omnidirektionales Bioprinting in zellbeladenen Suspensionen zur Erzeugung von Knochenanaloga

Die Scherverarbeitung während der Hydrogelbildung führt zur Herstellung von Mikrogelsuspensionen, die scherdünn sind, sich aber nach Beseitigung der Scherkräfte schnell restrukturieren. Solche Materialien wurden als Stützmatrix für das Bioprinting komplexer, zellbeladener Strukturen verwendet. Hier werden Verfahren zur Herstellung des Stützbettes und kompatibler Biotinten beschrieben.

Agarose-Flüssiggele, die durch Scherverarbeitung während der Gelierung für suspendierten 3D-Biodruck gebildet werden

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für den Freiform-eingebetteten 3D-Druck von neuralen Stammzellen in selbstheilenden, annealbaren Partikel-extrazellulären Matrixkompositen. Das Protokoll ermöglicht die programmierbare Strukturierung von miteinander verbundenen menschlichen Nervengewebekonstrukten mit hoher Genauigkeit.

Mikrogel-extrazelluläre Matrix-Komposit-Unterstützung für den eingebetteten 3D-Druck menschlicher neuronaler Konstrukte

Erfahren Sie, wie Sie die Biokompatibilität von kristalliner Nanocellulose-Agarose-Bioink für Knochenmark-abgeleitete Mastzellen testen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Zytotoxizitätsprüfung vor 3D-Bioprinting-Experimenten.

Herstellung einer kristallinen Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Tinte für Knochenmark-abgeleitete Mastzellkultur

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