Probenvorbereitung zur bioinformatischen Analyse der DNA-Methylierung: Assoziationsstrategie für Adipositas und verwandte Merkmalsstudien

Die vorliegende Studie beschreibt den Workflow zur Verwaltung von DNA-Methylierungsdaten, die durch Microarray-Technologien erhalten werden. Das Protokoll veranschaulicht die Schritte von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse. Alle Verfahren werden detailliert beschrieben, und das Video zeigt die wesentlichen Schritte.

Große Omics-Technologien werden immer häufiger in Studien eingesetzt, die sich auf Fettleibigkeit konzentrieren. Epigenetik kann ein Bindeglied zwischen der Exposition und den gesundheitlichen Ergebnissen sein. Diese Art von Studie generiert eine riesige Menge an Daten.

Vor diesem Hintergrund ist es wichtig, die Protokolle zu standardisieren, um die Daten technisch vergleichbar zu machen. In dieser Studie werden wir eine Pipeline vorschlagen, um DNA-Methylierungsdaten zu erhalten und zu analysieren. Das gleiche Protokoll kann sowohl für 400K- als auch für Epic-Versionen angewendet werden.

Tag eins:Bisulfit-Behandlung. Beginnen Sie mit der Denaturierung genomischer DNA und fügen Sie dann die Konversionsreagenzien hinzu. Es ist notwendig, die Empfehlungen des Kits zu befolgen.

Und behandeln Sie die denaturierende DNA mit Bisphosphat. Dann inkubieren Sie die Proben in einem Thermocycler. Führen Sie die Waschschritte mit dem Waschpuffer durch.

Tag zwei: Amplifikation nach dem Methylierungsassay, manuelles Protokoll. Heizen Sie den Hybridisierungsofen bei 37 Grad Celsius vor und lassen Sie die Temperatur ausgleichen. Dispergieren Sie 20 Mikroliter MA1 in die Vertiefungen der Platte.

Übertragen Sie vier Mikroliter der DNA auf die entsprechenden Vertiefungen auf der Platte. Dispergieren Sie vier Mikroliter Natriumhydroxidlösung in die Plattenvertiefungen. Versiegeln Sie die Platte mit einer Kunststoffdichtung.

Wirbeln Sie die Platte auf, um die Reagenzien mit Proben zu mischen. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dispergieren Sie 68 Mikroliter RPM in jede Vertiefung und dann 75 Mikroliter MSM, ohne die vorherige Lösung zu entfernen.

Verwenden Sie ein neues Siegel, um die Platte abzudecken. Wirbeln Sie die Platte für eine Minute auf. Im Hybridisierungsofen 20 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Tag drei: Hybridisierung nach dem Methylierungsassay, manuelles Protokoll. Heizen Sie den Block vor, indem Sie die Platte bei 37 Grad Celsius einsetzen. Entfernen Sie die Platte vorsichtig aus dem Hybridisierungsofen.

Pulszentrigrieren Sie die Platte. Entfernen Sie das Siegel von der Platte. Geben Sie 50 Mikroliter FMS zu jedem Probenbehälter.

Wirbeln Sie die Platte für eine Minute auf. Zentrifen Sie die Platte benötigt. Legen Sie dann die abgedichtete Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde auf den Heizblock.

Fügen Sie 100 Mikroliter PM1 zu jeder Vertiefung hinzu, die Proben enthält. Versiegeln Sie die Platte erneut. Wirbeln Sie die Platte für eine Minute auf.

Fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Pulsieren Sie dann eine Minute lang in der Zentrifuge und geben Sie dann 300 Mikroliter 100% 2-Propanol in jede Vertiefung mit Probe. Versiegeln Sie die Platte erneut.

Mischen Sie alle Inhalte, indem Sie die Platte mindestens 10 Mal umkehren. Bei vier Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren und dann bei vier Grad Celsius für 20 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie das Siegel von der Platte.

Drehen Sie die Platte schnell an einer geeigneten Stelle um und verwerfen Sie den Überstand. Tippen Sie mehrmals fest, bis Sie bemerkt haben, dass alle Vertiefungen frei von Flüssigkeit sind. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur eine Stunde lang auf dem Kopf stehen und unbedeckt.

Nach dem Trocknen der gesamten Flüssigkeit ist es notwendig, blaue Paletten am Boden der Brunnen zu sehen. Dann fügen Sie 46 Mikroliter RA1 zu jeder Vertiefung hinzu. Tragen Sie die Heißsiegelung auf die Platte auf.

Halten Sie fest, um die Abdichtung gleichmäßig durchzuführen. Legen Sie die Platte für eine Stunde bei 48 Grad Celsius in den Hybridisierungsofen und wirbeln Sie dann eine Minute lang. Pulsieren Sie in der Zentrifuge und erhitzen Sie die Platte eine Stunde lang auf 95 Grad Celsius.

Bereiten Sie die BeadChip Hyb Chambers gemeinsam vor. In diesem nächsten Schritt dispergieren Sie 400 Mikroliter PB2 in die Reservoirs in den Hyb-Kammern. Nachdem Sie die Hyb Chamber Reservoirs mit PB2 gefüllt haben, setzen Sie den Deckel sofort auf.

Laden Sie jede Probe von der Platte vorsichtig in den Probeneintrag des Microarrays. Laden Sie die Hyb-Kammereinsätze mit den Microarrays in die Hyb-Kammer. Schließen Sie die Hyb-Kammer quer, um eine mögliche Verschiebung der Hyb-Kammer zu vermeiden.

Tag vier: Färbung nach dem Methylierungsassay, manuelles Protokoll. Entfernen Sie nach der nächtlichen Inkubation alle Microarrays von den Einsätzen. Und waschen Sie die Microarrays langsam und leicht, insgesamt 10 Mal, auf und ab.

Verschieben Sie die Microarrays in PB1-Container Nummer zwei und wiederholen Sie sie 10 Mal nach oben und unten. Platzieren Sie die Rahmen der Flow Chamber an der richtigen Position und dann jedes Microarray. Verwenden Sie einen transparenten Abstandshalter an der Oberseite jedes einzelnen.

Die Ausrichtungsleiste muss auf dem Ausrichtungszubehör positioniert werden. Eine Glasrückplatte muss auf dem Abstandshalter platziert werden. Befestigen Sie dann Metallklemmen an den Strömungskammern.

Verwenden Sie eine Schere, um die Enden der Flow Chamber Spacer zu trimmen. Platzieren Sie die Flow Chamber mit dem Microarray im Kammerrack. Pipette 150 Mikroliter RA1.

30 Minuten lang inkubieren und fünfmal wiederholen. 450 Mikroliter XC1 pipettieren und 10 Minuten inkubieren. 450 Mikroliter XC2 pipettieren und 10 Minuten inkubieren.

Pipette 200 Mikroliter TEM. 15 Minuten inkubieren. Pipette 450 Mikroliter 95% Formamid.

Eine Minute lang inkubieren und zweimal wiederholen. Fünf Minuten lang inkubieren. Pipette 450 Mikroliter XC3.

Eine Minute lang inkubieren und wiederholen. In diesem Schritt werden die folgenden Reagenzien dosiert: 250 Mikroliter STM, 450 Mikroliter XC3 und 250 Mikroliter ATM. Führen Sie das folgende Wiederholungsschema aus.

Nach all den Wiederholungen und Inkubationen legen Sie die Microarrays auf ein stehendes Gestell und tauchen Sie sie in den Waschbehälter. Sich langsam und leicht mit Auf- und Abwärtsbewegungen bewegen, 10 Mal. Trocknen Sie die Microarrays mit dem Vakuum-Exsikkator 50 bis 55 Minuten lang.

Sobald die Microarrays getrocknet sind, fahren Sie fort, das Microarray mit dem Scan abzubilden. In diesem Bild können wir alle verwendeten Protokolle sehen, von der Auswahl der Teilnehmer bis zur Verarbeitung der IDAT-Dateien, die am letzten Tag des Methylierungsexperiments erhalten wurden. Die Dateien wurden auf den Computer übertragen, auf dem die bioinformatische Analyse durchgeführt wurde.

Die Analysen wurden mit R Studio und dem Bioconductor ChAMP-Gehäuse verarbeitet. Stellen Sie sicher, dass Sie mindestens acht Gigabyte RAM auf Ihrem Computer haben. Andere bioinformatische Analysen, wie die Genanreicherung, wurden durchgeführt, um die Daten dem Leser besser präsentieren zu können.

In dieser Tabelle können wir die beiden in dieser Studie verwendeten Gruppen beobachten, fettleibig und nicht fettleibig. Es gab einen Unterschied zwischen Gruppen für Variablen, Body-Mass-Index, Bauchumfang, Fettmasse in Kilogramm und Fettmasse in Prozent. Unter Berücksichtigung des in dieser Abbildung dargestellten Schemas konnten wir verstehen, dass das vorgeschlagene Protokoll für unsere Daten angemessen war.

Und nach der bioinformatischen Analyse wurden insgesamt 409.887 Sonden präsentiert, nachdem der Filter durchgeführt wurde. Das Dichtediagramm ergab, dass alle Proben ähnliche Dichten der Betaverteilung aufwiesen. Auf der Grundlage dieser Analysen wurden keine Proben ausgeschlossen.

Die Analyse der singulären Wertzerlegung der normalisierten Daten ergab, dass BMI, Doppel-C und FM die Variabilität der DNA-Methylierungsdaten signifikant beeinflussten. Die Zelltypschätzung ergab, dass sowohl natürliche Killerzellen, NK- als auch B-Zellen bei übergewichtigen Frauen höher waren. Die DNA-Methylierungsniveaus zwischen übergewichtigen und nicht fettleibigen Frauen waren vor und nach der Zelltypkorrektur unterschiedlich.

Vor der Korrektur wurden 43, 463 verschiedene Methylierungspositionen beobachtet. Und danach blieben 3.329 CPGs signifikant übrig. Insgesamt waren 162 CPGs hypomethyliert, und 576 waren hypermethyliert bei Fettleibigkeit im Vergleich zu nicht fettleibig.

Die Daten sind in der GEO-Datenbank unter dem Registrierungscode GSE166611 verfügbar. Wir stellen die CPG-Standorte vor, die mit den spezifischen Merkmalen der Teilnehmer in Verbindung gebracht wurden, die in SVD beobachtet wurden. Für Fettmasse wurden 13.222 CPG-Stellen gefunden.

Es gab 6.159 fettmassebezogene CPGs in der Promotorregion. 470 hypomethyliert und 94 hypermethyliert. Die jeweiligen Gene der assoziierten Stellen wurden angereichert und sind nun dargestellt.

Wir haben beobachtet, dass das vorgeschlagene Protokoll in der Lage ist, innerhalb Ihrer Methylierungsmuster zu identifizieren, und es ist richtig, sich innerhalb Ihrer Methylierungen zu beziehen. Unser Ergebnis bestätigt, dass ein fettleibiger Lebensstil epigenetische Veränderungen in der menschlichen DNA fördern kann.