Frequenzverschiebungen Eingabe Genom Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von einem einzigen Tardigrade Exemplar

Kontamination während der Genom-Sequenzierung von mikroskopisch kleinen Organismen bleibt ein großes Problem. Hier zeigen wir eine Methode um das Genom der Bärtierchen aus einem einzigen Exemplar mit so wenig wie 50 Pg genomic DNA ohne Verstärkung des gesamten Genoms zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu sequenzieren.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Genom eines mikroskopisch kleinen Organismus namens Bärtierchen zu sequenzieren. Wir haben eine Methode entwickelt, um das Genom eines Bärtierchens, Hypsibius dujardini, aus einer einzigen Probe mit nur 50 Pikogramm genomischer DNA zu sequenzieren. Nach der Isolierung eines einzelnen Bärtierchens minimieren wir die bakterielle Kontamination durch den Einsatz von Antibiotika und visuelle Inspektion.

Wir haben auch zwei Homogenisierungsmethoden verwendet. Erstens und am häufigsten bei C.elegans mit Gefrier- und Auftauzyklen verwendet, und zweitens durch manuelles Zerkleinern des Bärtierchens mit einer Pipettenspitze. Die DNA wird dann verwendet, um eine Sequenzierungsbibliothek zu erstellen, und dann in einem MiSeq-Instrument sequenziert.

Eine Gesamtzusammenfassung des Protokolls. Nach der Isolierung eines einzelnen Individuums wird es drei Gefrier- und Auftauzyklen zur Homogenisierung unterzogen. Die genomische DNA wird extrahiert und gereinigt und durch Ultraschall fragmentiert.

Dann wird eine Sequenzierungsbibliothek erstellt, und nach Validierung der Bibliotheksgrößenverteilung wird sie mit einem Sequenzierungsinstrument sequenziert. Bereiten Sie 2 % Agarosegel mit destilliertem Wasser als Lösungsmittel in einer 90-Millimeter-Kunststoffkulturschale und 10 Millimeter 1 % Penicillin-Streptomycin mit destilliertem Wasser vor. Das Gel kann zwei bis drei Wochen in einem auf 18 Grad eingestellten Inkubator gelagert werden.

Sammeln Sie ein einzelnes Bärtierchen und legen Sie es auf die vorbereitete Agarplatte und waschen Sie es zwei- bis dreimal mit destilliertem Wasser, um die restlichen Partikel zu entfernen. Legen Sie das einzelne Bärtierchen für zwei bis sechs Stunden in Penicillin-Streptomycin-Antibiotika, um die bakterielle Kontamination zu entfernen, und legen Sie das dekontaminierte Tier mit einer P10-Pipette auf ein sauberes Objektträgerglas. Beobachten Sie das Bärtierchen unter dem Mikroskop bei 500-facher Vergrößerung und vergewissern Sie sich, dass keine Bakterien mehr vorhanden sind.

Entnehmen Sie die Person mit einer P10-Pipette mit maximal fünf Mikrolitern Flüssigkeit und geben Sie sie in ein PCR-Röhrchen mit geringer Bindung, und entfernen Sie so viel überschüssige Flüssigkeit wie möglich. Homogenisierung und DNA-Extraktion. Homogenisieren Sie das Tier, um genomische DNA mit einer der folgenden Methoden zu erhalten.

Homogenisierung mit Gefrier- und Auftauzyklen. Unmittelbar nach Schritt 2.5 werden 100 Mikroliter Lysepuffer in das PCR-Röhrchen mit dem Bärtierchen gegeben. Legen Sie das PCR-Röhrchen 10 Minuten lang in flüssigen Stickstoff und stellen Sie es in einen Heizblock, der 10 Minuten lang auf 37 Grad erwärmt wird.

Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Manuelles Zerkleinern. Zerkleinern Sie das Individuum unter einem Stereomikroskop mit einer P10-Pipettenspitze, indem Sie das Tier gegen die Wand des PCR-Röhrchens drücken, und fügen Sie sofort 100 Mikroliter Lysepuffer hinzu.

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, damit die Lyse stattfinden kann. Übertragen Sie das gesamte Volumen des Lysegemisches in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit geringer Bindung. Geben Sie 100 Mikroliter Lysepuffer in das niedrig bindende PCR-Röhrchen, das zur Homogenisierung verwendet wird und nun leer ist.

Und nach dem Pipettieren geben Sie die Mischung in ein 1,5-Mikroröhrchen mit geringer Bindung. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Geben Sie 300 Mikroliter Lysepuffer in ein PCR-Röhrchen mit niedriger Bindung und geben Sie die Mischung nach dem Pipettieren in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit niedriger Bindung.

Geben Sie die insgesamt 600 Mikroliter Lysemischung in die Spin-Säule im Sammelröhrchen und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 10.000 g. Wenden Sie den Durchfluss erneut an die Säule an und zentrifugieren Sie ihn eine Minute lang bei 10.000 g. Dieser Schritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass der größte Teil der genomischen DNA an die Säule gebunden ist.

Geben Sie 500 Mikroliter Waschpuffer in die Schleudersäule und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 10.000 g. Übertragen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen. Tragen Sie 20 Mikroliter 10 millimolare erste ACL auf die Spin-Säule auf und warten Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Eine Minute lang bei 10.000 g zentrifugieren. Der Verdünnungspuffer darf kein EDTA enthalten, da es die Enzyme der Laborvorbereitung beeinträchtigt. Wenden Sie den Durchfluss erneut an die Spin-Säule an und zentrifugieren Sie nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur eine Minute lang bei 10.000 G. Aufbau der Sequenzierungsbibliothek.

DNA-Fragmentierung. Übertragen Sie 15 Mikroliter genomische DNA-Eluierung zur DNA-Fragmentierung in ein 15-Mikroliter-Mikroröhrchen und zentrifugieren Sie eine Minute lang mit einer Tischzentrifuge. Fragmentieren Sie die genomische DNA in 550 Basenpaare.

Übertragen Sie nach dem Pipettieren 10 Mikroliter fragmentiertes DNA-Gemisch in ein sauberes, niedrig bindendes PCR-Röhrchen. Das Experimentieren kann hier gestoppt werden. Bewahren Sie die DNA bei vier oder minus 20 Grad auf.

Aufbau von Sequenzbibliotheken. Es ist absolut wichtig, das angegebene Kit in den folgenden Verfahren zu verwenden, da die DNA nur einen geringen Input hat. Bereiten Sie die erforderlichen Reagenzien gemäß dem Protokoll des Herstellers vor und erstellen Sie die Sequenzierungsbibliothek ohne Änderungen.

Nach dem Auftragen der Bibliotheksamplifikationsmischung auf eine Bibliothekssynthesemischung führen Sie die PCR-Reaktion in einem Thermocycler durch. Die PCR-Reaktion wurde wie gezeigt durchgeführt. Reinigung der PCR-Reaktion.

Fügen Sie 50 Mikroliter magnetische Kügelchen hinzu und pipettieren Sie 10 Mal und zentrifugieren Sie kurz mit einer Tisch-Mikrozentrifuge. Zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Auf einem magnetischen Ständer fünf Minuten lang inkubieren oder bis die Lösung vollständig klar ist, und den Überstand entfernen.

Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers. Übertragen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, in ein neues PCR-Röhrchen mit geringer Bindung. DNA-Qualitätsprüfung, -Quantifizierung und -Sequenzierung.

Validierung der Größenverteilung der DNA-Bibliotheken. Fügen Sie drei Mikroliter Probenwasser mit einem Mikroliter Sequenzierbibliothek hinzu und mischen Sie es eine Minute lang gründlich mit einem Wirbel und zentrifugieren Sie kurz mit einer Tischzentrifuge. Führen Sie eine Elektrophorese durch und validieren Sie die Verteilung der Bibliotheksgröße mit der zugehörigen Software.

Der Hauptfragment-Peak sollte grob zwischen 300 und 1.000 Basenpaaren liegen. DNA-Quantifizierung. 796 Mikroliter des Lösungspuffers und vier Mikroliter des Fluoreszenzreagenzes zugeben und gründlich mischen.

Sie 190 Mikroliter der Arbeitslösung in zwei Analyseröhrchen und 197 Mikroliter in ein Analyseröhrchen. Es werden 10 Mikroliter Standards mit bekannten DNA-Konzentrationen in jedes Analyseröhrchen gegeben, das 190 Mikroliter Arbeitslösung enthält, und drei Mikroliter der vorbereiteten Bibliothek in ein Analyseröhrchen mit 197 Mikrolitern Arbeitslösung gegeben. Kurz vortexen und auf der Tischzentrifuge zentrifugieren.

Quantifizieren Sie die DNA mit einem Fluorometer mit drei Mikrolitereinstellungen. Sequenzierung der DNA-Bibliothek. Bereiten Sie die Sequenzierungsbibliothek basierend auf dem Protokoll des Herstellers vor.

Setzen Sie die Reagenzkassette und die Durchflusszelle in das Sequenziergerät ein und geben Sie die Informationen zum Sequenziervorgang gemäß dem Protokoll des Herstellers ein. Führen Sie die Sequenzierung aus. Dargestellte Ergebnisse.

Die Exposition von Kontaminanten bei der hochwertigen DNA-Extraktion bleibt der kritische Punkt in unserem Protokoll. Um visuell zu untersuchen, ob es sich um eine Verunreinigung handelt, haben wir das Bärtierchen in Antibiotika inkubiert, bei denen es sich um Penicillin und Streptomycin handelt, und das Individuum auch unter einem 500-fachen Mikroskop untersucht. Wie hier gezeigt, sind sichtbare Mikroben um die Bärtierchen herum vollständig beleuchtet.

Nach effizienter Homogenisierung, DNA-Extraktion, Fragmentierung und Bibliotheksvorbereitung. Die Größenverteilung der Bibliothek wird mit einer hochempfindlichen Elektrophorese zur Qualitätskontrolle validiert. Die violetten und grünen Linien zeigen die obere und untere Markierung bei 1, 500 bzw. 25 Basenpaaren.

Bahn L ist ein Leitermarkierer, Bahn S und Spur S bis N4 sind fünf Wiederholungen desselben Experiments, die alle von einer einzigen Bärtierchenprobe ausgehen. Wie man an der breiten Gleichmäßigkeit und der Verteilung zwischen 200 und 1.000 Basenpaaren erkennen kann, ist unser Protokoll auch bei extrem niedrigem Input sehr gut reproduzierbar. Hier ist das Ergebnis der schnellen Qualitätskontrolle für synchronisierte Lesevorgänge, die aus einem einzigen Sequenzierungslauf erhalten wurden.

Die Lesevorgänge werden als Ersatzenden von 300 Basenpaaren erhalten, wobei die Vorwärts- und Rückwärtslesevorgänge oben bzw. unten angezeigt werden. Die hier gezeigte Verteilung ist typisch für 300-Paar-End-Reads, mit sehr hoher Qualität bei Base-Calls oberhalb von Q30 für die ersten 200 Base-Paare und allmählich abnehmend bis zum Ende. Bei dieser Methode wird also nur ein einziges Individuum für eine Probe verwendet.

Es gibt keine Anforderungen an große Mengen an Tieren, wie sie in früheren Projekten zur Sequenzierung des Bärtierchen-Genoms erforderlich waren. Für die meisten Bärtierchen gibt es noch keine Zuchtmethoden. Daher wird die Ermöglichung der Genomsequenzierung von einem einzigen Individuum, wie sie direkt aus der Feldarbeit stammt, einen großen Einfluss auf die Molekularbiologie von Bärtierchen und möglicherweise auch auf andere Kleintiere haben.

Unsere DNA-Sequenzierungsmethoden ermöglichen die Analyse zahlreicher mikroskopisch kleiner Organismen, die noch nicht sequenziert wurden, wie z. B. seltene Bärenklau-Arten, Nematoden, Wassertannen und andere Optionen, indem sie den Teil der Zonen mit einem breiteren öffentlichen Bereich verbinden und so das Umfeld fördern, in dem verschiedene biologische Mechanismen möglich sein können.