Name: Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Lernen Sie die RNASeq-basierte Genexpressionsanalyse von Zebrafisch-Embryonen und Larven. Diese Methode ermöglicht quantitative Vergleiche und Validierung durch qRT-PCR für Entwicklungsbiologie und Genomik.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll beschriebene Ansatz bietet eine relativ schnelle und kostengünstige Strategie für Transkriptom-Level-Analyse der ganze Tiere oder bestimmte sortierte Zellpopulationen. Der Zebrabärbling bietet eine vorteilhafte Modell für diese Art der Studie wegen der Leichtigkeit und Schnelligkeit beim generieren großer Mengen an Material, die einfache Implementierung von genetischen oder experimentelle Umweltbedingungen und die Verfügbarkeit eines großen ab Spektrum an transgenen Reporter Linien zur Isolation von Z...

Vergleichende Analyse der globalen Genexpression ist ein wertvolles Werkzeug, neuartige Gene zur beobachteten Phänotypen zu identifizieren. Solche Analysen in der Regel verlassen sich auf quantitative Bewertung der Abschrift Fülle im Vergleich zwischen experimentellen und Kontrollproben. Gezielte Ansätze, wie z. B. qRT-PCR sind relativ schnelle und genaue Untersuchung der Veränderungen der einzelnen Genexpression. RNA-Sequenzierung (RNASeq) bietet einen breiten, Hypothese-freie Ansatz um wesentliche Änderungen in der Genexpression zwischen Proben, so dass es nun den Standard für solche Untersuchungen über experimentelle Systeme zu identifizieren.
Zebrafisch entstanden als prominente Modell in vielen Bereichen der Krankheit. Ursprünglich entwickelt für ihre Nützlichkeit in Entwicklungsbiologie Studien aufgrund ihrer hohen Fruchtbarkeit und relativ geringen Kosten für Wartung, experimentellen Einsatz von Zebrafisch entwickelt hat, um umfassen eine Vielzahl von Phänotypen aus embryonalen bis adulten Stadien als auch als ein Vielzahl von molekularen Tests1,2,3. In der Tat, diese Vorteile machen die molekularen mechanistische Studien schnelle und kostengünstige wegen der Leichtigkeit des Erwerbs von großen Mengen an Material kombiniert mit der Leichtigkeit des genetischen und umweltbedingten Manipulation in allen Phasen des Lebens. Darüber hinaus die transparente Art der Zebrafisch-Embryonen und Larven machen es ideal für die Erzeugung von Zell- und gewebespezifische transgenen Reporter Linien in Vivo Visualisierung von diskreten Zelle Bevölkerungen4ermöglicht. Ausbeutung von solchen Linien ermöglicht globale gen Expressionsanalyse in bestimmten isolierten Zelle Arten basierend auf Reporter-gen-Expression.
Hier präsentieren wir Ihnen ein umfassendes Protokoll für globale Genanalyse Ausdruck mit RNASeq nach der Kultur der Zebrafisch-Embryonen. Genetischen experimentelle Manipulationen, einschließlich Morpholino (MO)-aufgrund vorübergehender gen-Knockdown oder CRISPR-vermittelten Genom-Bearbeitung, wurden präsentiert an anderer Stelle5,6,7. Wir daher konzentrieren sich auf ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus ganzen Embryonen oder transgene Reporter exprimierenden Zellen, gefolgt von einfachen numerischen Analyse der RNASeq Ergebnisse mit Weg-Tools und gen Ontology (gehen Sie) Begriffe sortiert. Zu guter Letzt haben wir eine Strategie für die Validierung von Veränderungen der Genexpression durch quantitative Reverse Transkriptase PCR (qRT-PCR) aufgenommen. Diese Protokolle sind für Zebrafisch-Embryonen, die eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen, auch im Vergleich der genetische Mutanten oder Umweltbedingungen ausgesetzt.

<table><tbody><tr><td>Commercial Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriZol</td><td>Thermo Scientific</td><td>15596026</td><td>Lysereagenz</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>Dissoziationspuffer 1</td></tr><tr><td>FACSMax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>Dissoziationspuffer 2</td></tr><tr><td>DEPC-behandeltes Wasser</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>FirstStrand cDNA-Umwandlung</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1621</td><td>cDNA-Umwandlungskit</td></tr><tr><td>2X SYBR Green Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>qRT-PCR Master Mix</td></tr><tr><td>FACS</td><td>Puffer Fisher Scientific</td><td>50-105-9042</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td> Name</td><td>Firma</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Zebrafish Stämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuebingen</td><td>ZIRC</td><td>ZL57</td><td></td></tr><tr><td>ins2a:mCherry</td><td>ZIRC</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 Mikron Zellsieb</td><td>Sigma</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq Illumina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gegentanks 1,0 l Kreuzungstank-Set</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100 FACS-Tube</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polypropylen-Schlauch</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konsensus Pfad DB</td><td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GO Anreicherungsanalyse</td><td>http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

probenvorbereitung und analyse der rnaseq-basierte genexpressionsdaten von zebrafisch

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Die Analyse der Veränderungen der globalen Genexpression ist ein wertvolles Instrument zur Identifizierung von neuartige Wege beobachteten Phänotypen zugrunde liegen. Der Zebrabärbling ist ein hervorragendes Modell für schnelle Beurteilung der ganze Transkriptom vom ganzen Tier oder einzelne Zellpopulationen wegen der Leichtigkeit der Isolierung der RNA aus große Zahl von Tieren. Hier ist ein Protokoll für globale gen Expressionsanalyse in den Zebrafish Embryos mit RNA Sequenzierung (RNASeq) vorgestellt. Wir beschreiben Vorbereitung der RNA aus ganzen Embryonen oder Zell-Populationen mit Zelle Sortierung bei transgenen Tieren erzielt. Wir beschreiben auch einen Ansatz zur Analyse von RNASeq Daten, angereicherte Wege und Gene Ontology (gehen Sie) Begriffe im globalen gen Ausdruck Datensätze zu identifizieren. Zu guter Letzt bieten wir ein Protokoll für die Validierung von Veränderungen der Genexpression mit quantitative Reverse Transkriptase PCR (qRT-PCR). Diese Protokolle können für die vergleichende Analyse der Steuerung und experimentellen Gruppen von Zebrafisch verwendet werden, um Veränderungen der neuartigen Genexpression zu identifizieren und molekulare Einblick in Phänotypen von Interesse.

Sortierung der differenziell ausgedrückt Gene:
Wir gezielte Ermittlung differentiell exprimierten Gene im Larvenstadium von Zebrafisch-Modellen von Alström-Syndrom und Bardet-Bardet-Syndrom (BBS), entweder alms1 oder bbs1 Abschriften durch die Injektion von zuvor validiert Spleiß-blocking MOs in Wildtyp Zebrafish Embryos16,17. 5 Tage nach Befruchtung (Dpf)...

Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die ganze Transkriptom-Analyse von Zebrafisch-Embryonen, Larven, oder Zellen sortiert. Wir gehören Isolierung von RNA, Pathway-Analyse von RNASeq Daten und qRT-PCR-basierte Validierung von Veränderungen der Genexpression.

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Das übergeordnete Ziel dieser RNA-Seq-Analyse an Zebrafisch-Larvenproben besteht darin, Genexpressionsprofile für Zebrafisch-Embryonen und -Larven zu identifizieren und quantitative vergleichende Aussagen über Genexpressionsänderungen zwischen Proben zu treffen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in jedem Forschungsbereich zu beantworten, in dem Zebrafisch-Embryonen oder -Larven aussagekräftig sind, beispielsweise wie die Unterdrückung eines gezielten Gens zu Veränderungen der Genexpression oder einer Störung bestimmter Signalwege im Vergleich zu anderen Bedingungen führt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Zebrafische gut geeignet sind, um große Anzahlen von Tieren zu erzeugen, und dass Transkriptomdaten aus ganzen Organismen leicht gewonnen werden können.Außerdem kann die Isolierung spezifischer Zelltypen durch Sortierung transgener Tiere problemlos erreicht werden. Die Verfahren werden Lain Hostelley, eine Doktorandin, und Jessica Nesmith, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie damit, Embryonen bis zum Alter von drei Monaten zu kultivieren, was der Fortpflanzungsreife entspricht.Trennen Sie zwei adulte männliche und drei weiblic

sample-preparation-analysis-rnaseq-based-gene-expression-data-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die Isolierung von hoher Qualität, ist intakte RNA ein wesentlicher Schritt in vielen Labor-Protokolle. Hier zeigen wir, die RNA-Extraktion aus ganzen Zebrafisch-Embryos und cDNA-Synthese für die spätere Anwendung in verschiedenen experimentellen Verfahren, einschließlich Genexpression Microarray-Analyse.

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Gene Microarrays sind mächtige Werkzeuge in Genexpressions-Profiling bei einer genomweiten Ebene. Diese Technologie findet Anwendung in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen Entwicklungsbiologie und Toxikologie. In diesem Video-, Detail haben wir ein Protokoll für die globale Genexpressionsanalyse mit einem umfassenden Oligonukleotid-Microarray-Plattform für die Zebrafisch.

Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Der Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von Zebrafischembryonen durch natürliche Paarung und Sortierung ihrer Entwicklungsstadien. Das Protokoll wird weiterhin für die Analyse von Pankreas-β-Zellen unter Verwendung transgener Fische verwendet.

Paarung und Eizellimplantation: Eine Methode, um Embryonen zu erzeugen und sie nach Entwicklungsstadien zu sortieren

Herzgenexpressionsprofile bei Zebrafisch Herzentwicklung zu analysieren, wurde Gesamt-RNA aus isolierten Herzen gewonnen werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Sammeln von Funktions / klopfenden Herzen durch schnelle manuelle Dissektion von Zebrafischembryonen zu herzspezifischen mRNA zu erhalten.

Großzebrafisch Embryonale Herz Dissection für Transkriptionsanalyse

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen, zur Anreicherung von Zellen von Interesse, zum Einfangen von Zebrafischzellen in mikrofluidisch basierten Einzelzell-Multiplexsystemen und zur Bewertung der Genexpression von einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Zebrafisch wurden vor kurzem als in Vivo Modellsystem verwendet, um DNA-Replikation Timing während der Entwicklung zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Profil Replikation Timing. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um Replikation Timing in einzelnen Zelltypen, Mutanten, Krankheitsmodelle und andere Arten zu studieren.

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll um Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirn unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu isolieren. Bei der Isolierung wird dieser Zellen zu analysieren, ihre Genexpressionsprofil RNA entzogen. Dieses Protokoll ermöglicht für die Sammlung von qualitativ hochwertigen RNA nachgelagerte Analyse wie qPCR und Transkriptom durchführen.

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Modell menschlichen Tuberkulose in einem Erwachsenen Zebrafisch mit seiner natürlichen Erreger Mycobacterium Marinum. Extrahierte DNA und RNA aus den inneren Organen der infizierten Zebrafisch lässt sich zeigen, dass die Summe mykobakteriellen in die Fische und Immunantwort des Wirtes mit qPCR lädt.

Modellierung von Tuberkulose Mycobacterium Marinum infizierten Erwachsenen Zebrafisch

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) ist eine auf chemischer Biologie basierende Methode zur Untersuchung reaktiver niedermolekularer Signalwege. Diese Technik kann auf lebende Fische in verschiedenen Entwicklungsstadien angewendet werden. Hier koppeln wir Standard-Assays im Zebrafisch mit Z-REX für die Analyse des Signalwegs.

Überwachung von On-Target-Signalantworten in Zebrafischlarven - Z-REX entschlüsselt präzise Mechanismen elektrophiler Wirkstoffe und Metaboliten

Hier stellen wir ein Protokoll zur Markierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzprotein-Tag in Zebrafischlarven vor, ein neu entwickeltes und modifiziertes in vivo-System , das besonders nützlich für die Visualisierung von Proteinen mit geringer Abundanz im Zebrafisch ist.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Lernen Sie die RNASeq-basierte Genexpressionsanalyse von Zebrafisch-Embryonen und Larven. Diese Methode ermöglicht quantitative Vergleiche und Validierung durch qRT-PCR für Entwicklungsbiologie und Genomik.

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

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