Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieser RNASeq-Analyse in Zebrafischlarvenproben ist es, Genexpressionsprofile für Zebrafischembryonen und -larven zu identifizieren und quantitative Vergleichsaussagen über Genexpressionsänderungen zwischen Proben zu treffen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in jedem Bereich zu beantworten, für den Zebrafischembryonen oder -larven informativ sind, z. B. wie die Unterdrückung eines Zielgens zu Veränderungen der Genexpression oder einer Störung bestimmter Signalwege im Vergleich zu anderen Erkrankungen führt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Zebrafische für die Produktion einer großen Anzahl von Tieren geeignet sind und Transkriptomdaten für ganze Tiere leicht gewonnen werden können.

Darüber hinaus kann die Isolierung bestimmter Zelltypen durch die Sortierung transgener Tiere einfach erreicht werden. Lain Hostelley, eine Doktorandin, und Jessica Nesmith, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, werden die Verfahren demonstrieren. Zu Beginn kultivieren Sie Embryonen bis zu einem Alter von drei Monaten, was der reproduktiven Reife entspricht.

Trennen Sie zwei erwachsene männliche und drei weibliche Fische vom gewünschten Stamm in getrennte Paarungsbecken mit frischem Systemwasser am Abend vor der Embryoentnahme. Entfernen Sie am nächsten Morgen, nachdem die Lichter angegangen sind, die Trennwand und lassen Sie die Fische sich auf natürliche Weise paaren, bis Embryonen am Boden des Tanks beobachtet werden. Entnehmen Sie die Embryonen in 30-Minuten-Intervallen in separaten Petrischalen mit Embryomedium, bis die gewünschte Anzahl entnommen ist.

Um die Embryonen zu inszenieren, kultivieren Sie sie in Gruppen von 50 bis 75 pro 10 Zentimeter Petrischale, um ein konsistentes Entwicklungstiming aller Embryonen zu fördern. Halten Sie die Platten dann bei 28,5 Grad Celsius. Messen Sie das Alter des Embryos anhand der Somitenzahl nach der Segmentierung bis etwa 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) und trennen Sie die Embryonen nach dem Entwicklungsalter.

Nachdem Sie die Embryonen im gewünschten Stadium gemäß dem Textprotokoll eingeschläfert haben, übertragen Sie einen Pool von 20 Embryonen in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie dann überschüssiges Embryomedium aus dem Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 200 Mikroliter Lysereagenz in das Röhrchen.

Und verwenden Sie einen Stößel, um die Embryonen mechanisch zu homogenisieren. Fügen Sie dann weitere 800 Mikroliter Lysereagenz hinzu, um das Gesamtvolumen auf einen Milliliter zu bringen. Um die RNA zu extrahieren, fügen Sie der entnommenen Probe ein Lysereagenz hinzu und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Fügen Sie 0,2 Milliliter Chloroform pro 1 Milliliter verwendetem Lysereagenz hinzu und drehen Sie die Röhrchen 15 Sekunden lang von Hand um. Nachdem Sie die Proben zwei bis drei Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, zentrifugieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 12.000 G und 4 Grad Celsius. Die abgetrennte wässrige Phase wird in ein frisches Röhrchen überführt und 0,5 Milliliter Isopropanol pro 1 Milliliter verwendetem Lysereagenz zugegeben.

Nachdem Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang. Als nächstes fügen Sie der RNA 75%iges Ethanol hinzu und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 7.500 G und 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Der Überstand wird vollständig entfernt und die Probe bei Raumtemperatur an der Luft trocknen lassen.

Dann resuspendieren Sie die RNA in 15 bis 30 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser. Um hochwertige RNA nach der Extraktion des Pellets und dem Waschen der Probe gemäß dem Textprotokoll zu reinigen, verwenden Sie ein Absorptionsspektrophotometer, um die extrahierte RNA auf Konzentration und Reinheit zu untersuchen. Stellen Sie sicher, dass der Wert von 260 über 230 bei etwa 2,0 liegt, bevor Sie die RNA-Proben an einen Händler oder ein Korps senden, um die RNASeq- und Genexpressionsänderungsanalyse auf der Grundlage der Quantifizierung der Sequenzierungs-Reads durchzuführen.

Um eine einzelne experimentelle Bedingung mit einer Kontrolle zu vergleichen, öffnen Sie die Daten differentiell exprimierter Gene in einer Tabellenkalkulationsverwaltungssoftware. Wählen Sie den Dropdown-Pfeil neben der Sortierschaltfläche aus und wählen Sie in der Tabelle die Option Benutzerdefinierte Sortierung aus. Aktivieren Sie im sich öffnenden Fenster das Kontrollkästchen unter Spalte und sortieren Sie nach der LFC-Spalte.

Stellen Sie sicher, dass in der Spalte Sortieren nach Werte ausgewählt sind. Wählen Sie in der Spalte Reihenfolge die Sortierung vom größten zum kleinsten aus und klicken Sie auf OK. Um differentiell exprimierte Gene zu bestimmen, die unter zwei experimentellen Bedingungen gefunden wurden, wählen Sie in der experimentellen Tabelle "Eins versus Kontrolle" die erste Zelle in einer leeren Spalte aus.

Geben Sie dann die folgende Gleichung in die Zelle ein. Drücken Sie die Eingabetaste oder den Zeilenschalter, um die Gleichung auszuführen. Wählen Sie die Zelle mit der Gleichung aus und klicken Sie auf das Feld in der unteren rechten Ecke der Zelle.

Halten Sie die Maustaste gedrückt, und ziehen Sie den ausgewählten Bereich ganz nach unten in der Spalte, bis Sie die letzte Feature-ID auswählen, um die Gleichung in jede Zelle in der Spalte zu kopieren. Wählen Sie erneut die benutzerdefinierte Sortierung aus und fügen Sie eine zweite Sortierstufe hinzu, indem Sie auf das Plus-Symbol in der unteren linken Ecke klicken. Sortieren Sie in der ersten Ebene nach, und wählen Sie unter Spalte die Option Duplizieren aus.

Wählen Sie unter Sortieren nach die Option Werte aus, und wählen Sie unter Reihenfolge die Option Z aus, um die zweite Ebene zu A.In, und wählen Sie dann unter Spalte LFC aus. Wählen Sie unter Sortieren nach die Option Werte aus, und wählen Sie unter Reihenfolge die Option "Größte" bis "Kleinste" aus, und wählen Sie "OK" aus. Wenn Sie alle Klammern aus der Spalte "Gensymbole" entfernen möchten, bevor Sie fortfahren, wählen Sie die gesamte Spalte mit den Gensymbolen aus.

Wählen Sie "Bearbeiten" und dann "Ersetzen" im Dropdown-Menü "Datei" aus. Geben Sie offene Klammern, Stern, geschlossene Klammern in die Leiste "Suchen welch" des Fensters "Ersetzen" ein, und leasen Sie die Leiste "Ersetzen, wobei die Leiste leer ist". Wählen Sie Alle ersetzen aus, um alle Instanzen von Klammern zu entfernen.

Um angereicherte Signalwege zu bestimmen, kopieren Sie die gewünschten Gensymbole in die Zwischenablage. Gehen Sie zu ConsensusPathDB und wählen Sie dann in der linken Seitenleiste der Webseite Gensatzanalyse aus, gefolgt von der Überrepräsentationsanalyse. Fügen Sie im Feld Liste von Gen- und Proteinidentifikatoren einfügen die Liste der Gene ein.

Wählen Sie das Gensymbol im Feld für den Gen-/Proteinkennungstyp aus und klicken Sie auf Weiter. Aktivieren Sie im Abschnitt pfadbasierte Sets das Kontrollkästchen neben Pfade, wie sie in Pfaddatenbanken definiert sind. Wählen Sie "Angereicherte Sätze suchen" aus, um die Liste der Signalwege abzurufen, die Gene in der Eingabeliste enthalten.

Wählen Sie alle angereicherten Pfade aus, die in einem Pfadnetzwerk visualisiert werden sollen, indem Sie entweder die einzelnen Kontrollkästchen neben den Pfadnamen aktivieren oder unter Auswählen in der Spaltenüberschrift über den Auswahlfeldern auf Alle klicken. Wählen Sie dann Ausgewählte Sets visualisieren aus. Passen Sie die Filter für relative Überlappung und gemeinsame Kandidaten an, indem Sie eines der Kontrollkästchen oben in der Mitte der Seite auswählen, den gewünschten Prozentsatz, die relative Überlappung oder die Anzahl der freigegebenen Kandidaten eingeben und dann Anwenden auswählen.

Um die angereicherten Genontologien zu bestimmen, kopieren Sie die Gensymbole der jeweiligen Gruppe in die Zwischenablage. Rufen Sie das Analysetool GO Enrichment im Gene Ontology Consortium auf. Fügen Sie auf der linken Seite der Seite unter Ihren Gen-IDs hier die Liste der Gensymbole in das Feld ein.

Wählen Sie unter dem Feld Gen-IDs den Go-Begriff "biologischer Prozess" aus. Wählen Sie dann danio rerio unter dem Feld für die Go-Bedingungen aus und klicken Sie auf Senden. Führen Sie die QRT-PCR durch und vergleichen Sie sie mit RNASeq gemäß dem Textprotokoll.

Die Sequenzierung von extrahierter RNA von Larven, die mit Morpholinos gegen alms1 oder bbs1 injiziert wurden, enthüllte die Gene, die in den Alstrom- und BBS-Modellen eindeutig hoch- und herunterreguliert waren, sowie die Gene, die in beiden Modellen signifikant verändert waren. Um das molekulare Profil des Alstrom-Modells besser zu verdeutlichen, wurden die Signalwege und Genontologien identifiziert, die mit den differentiell exprimierten Genen angereichert sind. Wie hier gezeigt, wurden insgesamt 31 Signalwege hochreguliert.

Abgesehen von der breiten Gruppierung des Stoffwechsels waren das angeborene und das adaptive Immunsystem mit 32 bzw. 20 Genen die am stärksten betroffenen Signalwege. Nachgeschaltete B-Zell-Rezeptor-Signalereignisse wurden ebenfalls angereichert. Mehrere Signalwege waren auch unter den hochregulierten Genen angereichert, was mit der Assoziation des Alstrom-Syndroms mit der primären Ziliumdysfunktion übereinstimmt.

Darüber hinaus wurden drei Signalwege, die mit der Insulinsekretion assoziiert sind, hochreguliert: Fettsäuren, die an GPR40 gebunden sind, freie Fettsäuren und Acetylcholin. Schließlich wurden sechs GO-Begriffe unter den hochregulierten Genen im Alstrom-Modell angereichert, darunter die Erythrozytendifferenzierung, die Erythrozytenhomöostase, die myeloische Zellhomöostase und homöostatische Prozesse. Einmal gemeistert, kann die Analyse des Pfades und des GO-Begriffs in weniger als einer Stunde durchgeführt werden.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Auswahl der Signalwegparameter und Cutoff-Werte die wichtigsten Überlegungen bei der Interpretation der Ergebnisse von RNASeq-Expressionsvergleichen sind. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Anwendung mit Mutantenlinien und die Transkriptomanalyse einzelner Zelltypen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Erstellung von Transkriptomprofilen von Zelltypen und Genexpressionsänderungen unter der Kontrolle spezifischer Gene. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die von RNASeq generierten Transkriptomdaten von Zebrafischen zur Identifizierung signifikanter Genexpressionsänderungen zwischen experimentellen Proben verwenden können.