Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieser RNA-Seq-Analyse an Zebrafisch-Larvenproben besteht darin, Genexpressionsprofile für Zebrafisch-Embryonen und -Larven zu identifizieren und quantitative vergleichende Aussagen über Genexpressionsänderungen zwischen Proben zu treffen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in jedem Forschungsbereich zu beantworten, in dem Zebrafisch-Embryonen oder -Larven aussagekräftig sind, beispielsweise wie die Unterdrückung eines gezielten Gens zu Veränderungen der Genexpression oder einer Störung bestimmter Signalwege im Vergleich zu anderen Bedingungen führt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Zebrafische gut geeignet sind, um große Anzahlen von Tieren zu erzeugen, und dass Transkriptomdaten aus ganzen Organismen leicht gewonnen werden können.

Außerdem kann die Isolierung spezifischer Zelltypen durch Sortierung transgener Tiere problemlos erreicht werden. Die Verfahren werden Lain Hostelley, eine Doktorandin, und Jessica Nesmith, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie damit, Embryonen bis zum Alter von drei Monaten zu kultivieren, was der Fortpflanzungsreife entspricht.

Trennen Sie zwei adulte männliche und drei weibliche Fische der gewünschten Stammeslinie am Abend vor der Sammlung der Embryonen in geteilte Zuchtbecken mit frischem Systemwasser ab. Am folgenden Morgen, nachdem das Licht eingeschaltet wurde, entfernen Sie den Trennsteg und lassen Sie die Fische natürlich paaren, bis Embryonen am Boden des Beckens beobachtet werden. Sammeln Sie die Embryonen in Intervallen von 30 Minuten in separaten Petrischalen mit Embryomedium, bis die gewünschte Anzahl erreicht ist.

Um die Embryonen zu sortieren, kultivieren Sie sie in Gruppen von 50 bis 75 pro 10 cm Petrischale, um eine gleichmäßige Entwicklungsgeschwindigkeit aller Embryonen zu fördern. Danach lagern Sie die Schalen bei 28,5 Grad Celsius. Bestimmen Sie das Embryonalalter anhand der Somitenanzahl nach der Segmentierung bis etwa 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) und trennen Sie die Embryonen entsprechend ihrem Entwicklungsalter.

Nachdem die Embryonen gemäß dem Textprotokoll im gewünschten Stadium euthanasiert wurden, überführen Sie einen Pool von 20 Embryonen in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie anschließend überschüssiges Embryomedium aus dem Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 200 Mikroliter Lysepuffer in das Röhrchen.

Und verwenden Sie einen Pistill, um die Embryonen mechanisch zu homogenisieren. Anschließend geben Sie weitere 800 Mikroliter Lysepuffer hinzu, um das Gesamtvolumen auf ein Milliliter aufzufüllen. Um die RNA zu extrahieren, geben Sie Lysepuffer zur gesammelten Probe hinzu und inkubieren diese 5 Minuten bei Raumtemperatur.

Fügen Sie 0,2 Milliliter Chloroform pro 1 Milliliter verwendeten Lysepuffer hinzu und mischen Sie die Röhrchen per Hand 15 Sekunden lang durch Inversion. Nach einer Inkubation der Proben bei Raumtemperatur für zwei bis drei Minuten zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 × g und 4 °C für 15 Minuten. Überführen Sie die abgetrennte wässrige Phase in ein frisches Röhrchen und geben Sie 0,5 Milliliter Isopropanol pro 1 Milliliter verwendeten Lysepuffer hinzu.

Nach der Inkubation der Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang. Geben Sie anschließend 75 % Ethanol zum RNA-Präparat hinzu und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 7.500 × g und 4 °C für 5 Minuten. Entfernen Sie das Überstandsvolumen vollständig und lassen Sie die Probe zur Lufttrocknung bei Raumtemperatur stehen.

Anschließend das RNA in 15 bis 30 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser erneut suspendieren. Um hochwertige RNA zu reinigen, nachdem das Pellet extrahiert und die Probe gemäß dem Textprotokoll gewaschen wurde, einen Absorptionsspektrophotometer verwenden, um die extrahierte RNA hinsichtlich Konzentration und Reinheit zu analysieren. Sicherstellen, dass der Wert von 260 über 230 etwa 2,0 beträgt, bevor die RNA-Proben an einen Dienstleister oder ein Unternehmen zur RNA-Seq- und Genexpressionsänderungsanalyse basierend auf der Quantifizierung von Sequenzierungsreads gesendet werden.

Um eine einzelne experimentelle Bedingung mit einer Kontrolle zu vergleichen, öffnen Sie die Daten der differentiell exprimierten Gene in einer Tabellenkalkulationssoftware. Wählen Sie den Abwärtspfeil neben der Sortierschaltfläche und anschließend „Benutzerdefiniertes Sortieren“ in der Tabellenkalkulation aus. Wählen Sie im daraufhin angezeigten Fenster das Feld unter „Spalte“ aus und sortieren Sie nach der LFC-Spalte.

Stellen Sie in der Spalte „Sortieren nach“ sicher, dass „Werte“ ausgewählt ist. Wählen Sie in der Spalte „Reihenfolge“ die Sortierung von größten zu kleinsten Werten und klicken Sie auf „OK“. Um differentiell exprimierte Gene, die in zwei experimentellen Bedingungen gefunden wurden, zu bestimmen, klicken Sie in der Tabelle des experimentellen gegenüber der Kontrollbedingung auf die erste Zelle einer leeren Spalte.

Geben Sie dann die folgende Gleichung in die Zelle ein. Drücken Sie die Eingabetaste, um die Gleichung auszuführen. Wählen Sie die Zelle mit der Gleichung aus und klicken Sie auf das Feld in der unteren rechten Ecke der Zelle.

Halten Sie die Maustaste gedrückt und ziehen Sie den markierten Bereich bis zum Ende der Spalte, um die letzte Feature-ID auszuwählen, sodass die Gleichung in jede Zelle der Spalte kopiert wird. Wählen Sie erneut benutzerdefinierte Sortierung und fügen Sie eine zweite Sortierebene hinzu, indem Sie auf das Plus-Symbol in der unteren linken Ecke klicken. Auf der ersten Ebene sortieren Sie nach der Spalte „duplicate“.

Wählen Sie unter Sortieren nach die Option Werte und unter Reihenfolge Z bis A. Auf der zweiten Ebene wählen Sie dann unter Spalte LFC. Unter Sortieren nach wählen Sie Werte und unter Reihenfolge größte zu kleinste und klicken Sie auf OK. Um Klammern aus der Spalte mit Gen-Symbolen zu entfernen, bevor Sie fortfahren, markieren Sie die gesamte Spalte, die die Gen-Symbole enthält.

Wählen Sie Bearbeiten und dann Ersetzen im Dropdown-Menü Datei. Geben Sie im Suchfeld des Ersetzen-Fensters eine öffnende Klammer, Stern, schließende Klammer ein und lassen Sie das Feld Ersetzen durch leer. Wählen Sie Alle ersetzen, um alle Vorkommen von Klammern zu entfernen.

Um angereicherte Signalwege zu bestimmen, kopieren Sie die gewünschten Gensymbole in die Zwischenablage. Gehen Sie zu ConsensusPathDB, wählen Sie dann im linken Seitenmenü der Webseite die Gen-Satz-Analyse und anschließend die Überrepräsentationsanalyse aus. Fügen Sie in das Feld „Liste von Gen- und Proteinidentifikatoren einfügen“ die Liste der Gene ein.

Wählen Sie das Gensymbol im Feld für den Gen/Protein-Identifikatortyp aus und klicken Sie auf „Weiter“. Wählen Sie im Abschnitt „Pfadbasierte Sets“ das Kästchen neben „Pfade, wie sie von Pfaddatenbanken definiert werden“ aus. Wählen Sie „Angereicherte Sets finden“, um die Liste der Pfade zu erhalten, die Gene aus der Eingabeliste enthalten.

Wählen Sie alle angereicherten Signalwege aus, die in einem Signalweg-Netzwerk visualisiert werden sollen, indem Sie entweder jedes Kästchen neben den Signalwegnamen aktivieren oder unter „Auswählen“ in der Spaltenüberschrift über den Auswahlkästchen auf „Alle“ klicken. Danach wählen Sie „Ausgewählte Mengen visualisieren“. Passen Sie die Filter für relativen Überlappungsbereich und gemeinsame Kandidaten an, indem Sie eines der Kästchen in der oberen Mitte der Seite auswählen und den gewünschten Prozentsatz, relativen Überlappungsbereich oder die Anzahl gemeinsamer Kandidaten eingeben und anschließend „Übernehmen“ auswählen.

Um die angereicherten Genontologien zu bestimmen, kopieren Sie die Gensymbole der jeweiligen Gruppe in die Zwischenablage. Rufen Sie das GO-Enrichment-Analyse-Tool im Gene Ontology Consortium auf. Auf der linken Seite der Seite unter „Ihre Gen-IDs hier“ fügen Sie die Liste der Gensymbole in das Feld ein.

Wählen Sie unterhalb des Felds mit den Gen-IDs den GO-Terminus „biologischer Prozess“. Wählen Sie dann unterhalb des Felds mit den GO-Termini „danio rerio“ aus und klicken Sie auf „Absenden“. Führen Sie eine qRT-PCR durch und vergleichen Sie die Ergebnisse mit RNA-Seq gemäß dem schriftlichen Protokoll.

Die Sequenzierung der aus Larven extrahierten RNA, die mit Morpholinos gegen entweder alms1 oder bbs1 injiziert wurden, zeigte die Gene auf, die in den Alström- und BBS-Modellen eindeutig hoch- bzw. herunterreguliert waren, sowie die Gene, die in beiden Modellen signifikant verändert waren. Um das molekulare Profil des Alström-Modells klarer aufzuklären, wurden die in den differentiell exprimierten Genen angereicherten Signalwege und Genontologien identifiziert. Wie hier gezeigt, waren insgesamt 31 Signalwege hochreguliert.

Abgesehen von der allgemeinen Gruppierung des Stoffwechsels waren die am stärksten betroffenen Signalwege das angeborene und das adaptive Immunsystem mit jeweils 32 und 20 Genen. Auch downstream stattfindende Ereignisse der B-Zell-Rezeptor-Signalübertragung waren angereichert. Mehrere Signalwege waren ebenfalls unter den hochregulierten Genen angereichert, was mit der Assoziation des Alström-Syndroms mit einer Dysfunktion des primären Ciliums übereinstimmt.

Zusätzlich wurden drei mit der Insulinsekretion assoziierte Signalwege hochreguliert: Fettsäuren, die an GPR40 binden, freie Fettsäuren und Acetylcholin. Schließlich waren sechs GO-Terme bei den hochregulierten Genen im Alström-Modell angereichert, darunter Erythrozytendifferenzierung, Erythrozytenhomöostase, myeloide Zellhomöostase und homöostatische Prozesse. Sobald die Analyse von Signalwegen und GO-Termen beherrscht ist, kann sie in weniger als einer Stunde durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Auswahl der Pfadparameter und Grenzwerte die wichtigsten Überlegungen bei der Interpretation der Ergebnisse von RNA-Seq-Expressionsvergleichen sind. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden, wie die Anwendung mit Mutantenlinien und die Transkriptomanalyse einzelner Zelltypen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise die Transkriptomprofilerstellung von Zelltypen und Genexpressionsänderungen unter der Kontrolle spezifischer Gene. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mittels RNA-Seq generierte Transkriptomdaten von Zebrafischen nutzen können, um signifikante Genexpressionsänderungen zwischen experimentellen Proben zu identifizieren.