Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das globale Methylierungsprofiling zu untersuchen und differentiell methylierte CpG-reiche Regionen bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie mittels Next-Generation-Sequencing zu identifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung der potenziellen CLL-spezifischen Signaturgene, die Krankheitspathogenese und die Prognose. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine vollständige genomweite Abdeckung der CpG-Methylierung auf unvoreingenommene und PCR-unabhängige Weise ermöglicht.

Verwenden Sie zunächst ein kommerziell erhältliches DNA-Extraktionskit, um genomische DNA aus dem Patienten und normalen mononukleären Blutzellproben aus dem peripheren Blut gemäß dem Protokoll des Herstellers zu isolieren. Nach der Quantifizierung der genomischen DNA, wie im Textprotokoll beschrieben, verdünnen Sie 5 Mikrogramm genomische DNA aus jeder Probe auf insgesamt 200 Mikroliter unter Verwendung von TE-Puffer, was eine Endkonzentration von 25 Nanogramm pro Mikroliter ergibt. Führen Sie anschließend die Beschallung in speziell entwickelten Röhren mit einem Ultraschallgerät für insgesamt 30 Zyklen von 30 Sekunden ein und 30 Sekunden aus durch.

Drehen Sie die Röhrchen nach jeweils fünf Zyklen kurz, um die Proben bis zum Boden zu sammeln. Überprüfen Sie den Beschallungsbereich für alle Proben mit DNA-Elektrophorese, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die magnetischen Streptavidin-Kügelchen vorzubereiten, suspendieren Sie sie zunächst wieder an der im Kit enthaltenen Röhre.

Pipettieren Sie die Kügelchen vorsichtig auf und ab, um eine homogene Suspension zu erhalten. Geben Sie für jeweils fünf Mikrogramm fragmentierter DNA-Probe 50 Mikroliter der Kügelchen in separate, saubere und beschriftete 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 50 Mikroliter 1X Bead Wash Puffer hinzu, um ein Endvolumen von 100 Mikrolitern zu erreichen.

Legen Sie die Röhren eine Minute lang auf einen Magnetständer, damit sich alle Magnetperlen auf die Innenwand der Röhre konzentrieren können, die dem Magneten zugewandt ist. Entfernen Sie die Flüssigkeit, ohne die Kügelchen zu berühren, mit einer 200-Mikroliter-Pipette. Nehmen Sie dann die Röhrchen vom Magnetständer, fügen Sie 250 Mikroliter 1X Bead Wash Puffer hinzu und mischen Sie die Kügelchen vorsichtig mit einer Pipette.

Nachdem Sie diese Schritte mindestens viermal für alle Proben wiederholt haben, resuspendieren Sie die Proben schließlich in 250 Mikrolitern 1X Bead Wash Puffer. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf. Um das MBD-Biotin-Protein an die gewaschenen Kügelchen zu binden, geben Sie zunächst 35 Mikroliter Protein in separate Röhrchen und erhöhen Sie das Gesamtvolumen mit 1X Bead Wash Puffer auf 250 Mikroliter.

Geben Sie 250 Mikroliter verdünntes MBD-Protein zu den 250 Mikrolitern gewaschenen Kügelchen und lassen Sie sie bei Raumtemperatur in End-to-End-Rotation. Nachdem Sie die Kügelchen eine Stunde lang mit Protein vermischt haben, waschen Sie die proteingebundenen magnetischen Streptavidin-Kügelchen, indem Sie die Röhrchen eine Minute lang auf den Magnetständer legen. Entfernen Sie die Flüssigkeit, ohne die Kügelchen mit einer Pipette zu berühren.

Fügen Sie dann 250 Mikroliter 1X Bead Wash Puffer hinzu und legen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Rotationsmischer. Wiederholen Sie den Waschschritt zwei weitere Male, bevor Sie die gewaschenen MBD-Biotin-Kügelchen in 200 Mikrolitern 1X Bead Wash Buffer erneut suspendieren, um die Kügelchen für den Einfang methylierter DNA vorzubereiten. Geben Sie in ein sauberes 1,5-Milliliter-DNase-freies Röhrchen 100 Mikroliter Milliliter Bead Wash Puffer und 180 Mikroliter der fragmentierten genomischen DNA.

Bringen Sie das Endvolumen mit DNase-freiem Wasser auf 500 Mikroliter. Fügen Sie 380 Mikroliter DNase-freies Wasser zu den restlichen 20 Litern der fragmentierten genomischen DNA hinzu. Frieren Sie die Proben ein, um sie später weiter zu verarbeiten und als Eingabe-DNA-Kontrollen zu verwenden.

Legen Sie die Röhrchen mit den gewaschenen MBD-Biotin-Kügelchen für eine Minute auf einen Magnetständer und entfernen Sie die Flüssigkeit, ohne die Kügelchen zu stören. Fügen Sie dann 500 Mikroliter fragmentierte genomische DNA hinzu, die in Bead-Wash-Puffer verdünnt ist. Verschließen Sie alle Tuben fest mit Paraffinfolie und lassen Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einem End-to-End-Rotationsständer bei 8 bis 10 Umdrehungen pro Minute.

Legen Sie die Röhrchen nach der DNA- und MBD-Bead-Bindungsreaktion für eine Minute auf das Magnetgestell, um alle Kügelchen auf der Innenwand des Röhrchens zu konzentrieren. Entfernen Sie die überstehende Flüssigkeit mit einer Pipette, ohne die Kügelchen zu berühren, und bewahren Sie diese ungebundene DNA-Probenfraktion auf Eis auf. Geben Sie dann 200 Mikroliter 1X Bead Wash Buffer zu den Perlen und legen Sie die Röhrchen für drei Minuten bei Raumtemperatur auf den rotierenden Ständer.

Nachdem Sie die Flüssigkeit mit dem Magnetständer entfernt haben, wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal, um die verbleibende ungebundene DNA zu entfernen. Fügen Sie nach der letzten Wäsche 200 Mikroliter Salzpuffer hinzu, der im Kit enthalten ist, um die DNA zu eluieren. Legen Sie dann die Röhren für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf den drehbaren Ständer.

Legen Sie sie nach der Inkubation eine Minute lang auf das Magnetstativ und geben Sie den Überstand mit einer Pipette vorsichtig in ein neues, sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie dann 200 Mikroliter Puffer mit hohem Salzgehalt zu den Kügelchen hinzu und wiederholen Sie die Elution, indem Sie die Röhrchen weitere 15 Minuten lang bei Raumtemperatur drehen. Geben Sie die zweite Eluierung in dasselbe Röhrchen, das die 200 Mikroliter der ersten Eluierung enthält.

Um die DNA auszufällen, fügen Sie einen Mikroliter Glykogen, 40 Mikroliter dreimolares Natriumacetat, pH 5,2 und 800 Mikroliter eiskaltes absolutes Ethanol zu 400 Mikrolitern eluierter DNA hinzu. Geben Sie die Reagenzien auch zu den zuvor eingefrorenen 400 Mikrolitern der Eingangs-DNA-Kontrollproben. Mischen Sie die Röhrchen gut durch, indem Sie sie vortexen, bevor Sie sie über Nacht bei minus 80 Grad Celsius inkubieren.

Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 g und 4 Grad Celsius für 30 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu beschädigen. Fügen Sie dann 500 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu und wirbeln Sie die Röhrchen auf.

Nachdem Sie die Röhrchen erneut unter den gleichen Bedingungen, jedoch 15 Minuten lang, zentrifugiert haben, entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur und entfernen Sie das restliche Ethanol vollständig mit einer Pipettenspitze. Trocknen Sie das Pellet fünf Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft.

Fügen Sie schließlich 10 Mikroliter DNase-freies Wasser zum DNA-Pellet hinzu, bevor Sie mit der Quantifizierung der methylierten DNA, der MBD-Sequenzierung und der Analyse fortfahren, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Analyse identifizierte mehrere differentiell hyper- und hypomethylierte Regionen, die in CLL-Proben im Vergleich zu normalen Kontrollen angereichert waren. Diese differentiell methylierten Regionen wurden verschiedenen Klassen von proteinkodierenden und nicht-kodierenden Genen zugeordnet.

Schließlich zeigte die Datenanalyse eine signifikante Überlappung zwischen den CLL-assoziierten differentiell methylierten Regionen, die aus zwei verschiedenen Normalkontrollvergleichen gewonnen wurden. Hier wurden alle CpG-Stellen, die sich in Zielregionen von zwei differentiell methylierten Genen befinden, in einer großen Anzahl von CLL-Proben mittels Pyrosequenzierung validiert. Der optimale Beschallungsbereich, der für dieses Verfahren erforderlich ist, wird hier veranschaulicht.

Dieser Bereich an fragmentierter DNA ist ideal und besser für Next-Generation-Sequencing-Zwecke geeignet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren sind die entscheidenden Faktoren, die die endgültige DNA-Rückgewinnung beeinflussen, die Qualität und die Menge der verwendeten Eingangs-DNA sowie die Reichweite der fragmentierten DNA nach der Beschallung.

Wir haben uns für diese Methode entschieden, da es sich um die erste globale CLL-Methylierungsstudie handelt, die auf der Immunpräzipitation zur Anreicherung methylierter DNA basiert, die alle methylierten Regionen im gesamten Genom abdeckt. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Prognose oder Therapie, da die identifizierten differentiell methylierten Signaturgene als globale normale Biomarker und epigenetische Ziele für die Therapie dienen könnten. Nach diesem Verfahren kann die angereicherte methylierte DNA für andere nachgelagerte Anwendungen wie Hybridisierung oder Microarrays verwendet werden, um die Metalome zwischen zwei Proben oder Krankheitsentitäten unter Verwendung eines festen Satzes von CpG-Stellen, die auf den Arrays vorhanden sind, einfach zu vergleichen.

Schließlich ist dies eine kostengünstige Technik zur Analyse einer großen Anzahl von Patientenproben auf methylierte Sequenzen im gesamten Genom, einschließlich annotierter Sequenzen, die proteinkodierende Gene umfassen, sowie nicht annotierter Sequenzen, die sich über repetitive Elemente und lange nicht-kodierende RNAs erstrecken.