Name: Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Erfahren Sie die MBD-Sequenzierungsmethode zur Analyse der globalen DNA-Methylierung bei chronischer lymphatischer Leukämie. Diese PCR-unabhängige Technik ermöglicht die Identifizierung differenziell methylierter Regionen für Biomarker.

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Diese Studie wurde vom schwedischen Forschungsrat, der schwedischen Krebsgesellschaft, der Knut- und Alice-Wallenberg-Stiftung (KAW) und den FoU VästraGötalandsregionen unterstützt.

Die ethische Genehmigung für das Sammeln der CLL-Muster ist von 2007-05-21 mit der folgenden Registriernummer: EPN Gbg dnr 239/07. Alle CLL-Patienten wurden nach kürzlich revidierten Kriterien 8 diagnostiziert und die Proben wurden zum Zeitpunkt der Diagnose gesammelt. Die Patienten in der Studie wurden von verschiedenen Hämatologie-Abteilungen im westlichen Teil von Schweden aufgenommen, nachdem schriftliche Zustimmung erhalten worden war. In dieser Studie wurden nur CLL-periphere Blutmononukleäre Zellen (PBMC) mit einem Tumoranteil von Leukämiezellen ≥ 70% ausgewählt. 1. Vorbereitungen <ol><li> Isolieren Sie PBMCs für DNA-Extraktionen von CLL und normale, gesunde periphere Blutproben unter Verwendung eines kommerziellen Isolationskits (siehe Materialtabelle ) gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Autoklav 1,5 mL Röhrchen. Tauschen Sie alle Reagenzien im methylierten DNA-Bindungskit (siehe Materialtabelle ). &lt;/ Li&gt; <li> Verwenden Sie DNase-freies Wasser, um 10 ml 1x Wulstwaschpuffer aus dem 5x Vorratsspülpuffer vorzubereiten, der vom Kit bereitgestellt wird, um Perlen zu waschen und das vom Kit bereitgestellte MBD-Protein zu verdünnen. </li><li> Erhalten oder bereiten die folgenden Gegenstände vor: 3 M Natriumacetat, absolutem Ethanol und 70% Ethanol zur DNA-Präzipitation ( Materials Table ). </li></ol> 2. Genomische DNA-Extraktion und Sonikation <ol><li> Verwenden Sie einen handelsüblichen DNA-Extraktionskit ( Materials Table ), um genomische DNA von Patienten und normalen PBMC-Proben nach dem Protokoll des Herstellers zu isolieren. Quantifizierung der genomischen DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 260 nm. HINWEIS: Die DNA-Extraktionsspaltenkapazität beträgt 5-6 Millionen Zellen, maximal; Daher ist es wichtig, mehr als eine Spalte für Proben mit mehr als 5 Millionen Zellen zu verwenden. Eluieren Sie die DNA zweimal in gleichen Volumina, die 100 μl 10 mM Tris EDTA (TE) Puffer enthält. Das in der Methyl verwendete MBD-Biotin-ProteinMiner-Kit für MBD-Sequenzierung wird nicht an einzelsträngige DNA binden. So ist es sehr wichtig, die eluierte DNA entweder eingefroren oder bei 4 ° C zu halten, um ihre doppelsträngige Natur zu bewahren. </li><li> 5 μg genomische DNA aus jeder Probe auf insgesamt 200 μl unter Verwendung von TE-Puffer (pH 8) verdünnen, wobei eine Endkonzentration von 25 ng / μL erhalten wird. </li><li> Führen Sie die Beschallung in speziell entworfenen Rohren mit einem Ultraschallgerät ( Materialtabelle ) für insgesamt 30 Zyklen (30 s an und 30 s aus pro Zyklus, nach jeweils 5 Zyklen, kurz die Röhrchen drehen, um die Proben nach unten zu sammeln). HINWEIS: Dies führt zu fragmentierter DNA zwischen 150 bp und 300 bp, was für dieses Protokoll optimal ist. </li><li> Überprüfen Sie den Beschallungsbereich für alle Proben, bevor Sie mit dem nächsten Schritt der MBD-Sequenzierung fortfahren, indem Sie 1 μl der fragmentierten DNA-Proben und eine DNA-Größenleiter auf einem handelsüblichen, vorgegossenen 2% Agarosegel unter Verwendung von DNA-Elektrophorese-Bildgebungsgeräten laufen lassen. Visualisierung tEr DNA mit einem Standard-UV-Transilluminator. </li></ol> 3. Perlenpräparation vor der Bindung mit MBD-Biotin-Protein <ol><li> Die magnetischen Streptavidin-Kügelchen aus dem durch den Bausatz bereitgestellten Vorratsschlauch resuspendieren, vorsichtig nach oben und unten pipettieren, um eine homogene Suspension zu erhalten. Verwirren Sie die Perlen nicht oder lassen Sie sie trocknen. </li><li> Legen Sie 50 &amp; mgr; l Perlen (für jede 5 &amp; mgr; g fragmentierte DNA-Probe) in getrennten, sauberen und markierten 1,5 ml Röhrchen. Füge 50 μl 1x Wulstwaschpuffer hinzu, um das Endvolumen von 100 μl zu erreichen. HINWEIS: Bei der Verwendung von kleinen 0,5 mL Polymerase Kettenreaktion (PCR) Streifen zum Waschen von Perlen werden etwa 150-200 &amp; mgr; l Waschpuffer pro Röhrchen verwendet, wie im Kit-Protokoll erwähnt. Im Falle von 1,5 ml Röhrchen werden jedoch mindestens 250 μl zu 300 μl Waschpuffer pro Röhrchen für die Wulstwäsche zugegeben. </li><li> Legen Sie die Röhrchen für eine Minute auf einen Magnetständer, damit sich alle magnetischen Perlen auf die Innenwand des Rohres konzentrieren könnenMit dem Magneten Entfernen Sie die Flüssigkeit, ohne die Perlen zu berühren, mit einer 200 μl Pipette. </li><li> Entfernen Sie die Röhrchen aus dem Magnetständer, fügen Sie 250 μl 1x Wulstwaschpuffer hinzu und mischen Sie die Perlen vorsichtig mit einer Pipette. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.3 und 3.4 mindestens 4-5 mal für alle Proben und schließlich in 250 μl 1x Wulstwaschpuffer resuspendieren. Halten Sie sie auf Eis. </li></ol> 4. Bindung des MBD-Biotin-Proteins an die gewaschenen Perlen <ol><li> Füge 35 μl MBD-Protein (7 μl für 1 μg DNA-Probe) hinzu, um Röhrchen zu trennen und das Gesamtvolumen bis zu 250 μl unter Verwendung von 1x Bead Wash Puffer zu bringen. </li><li> Füge 250 μl verdünntes MBD-Protein zu den 250 μl gewaschenen Perlen hinzu und läßt sie bei Raumtemperatur 1 h bei einer End-to-End-Rotation liegen. </li><li> Nach dem Mischen der Perlen und des Proteins für 1 h, waschen Sie das MBD-Protein-Biotin, das mit magnetischen Streptavidin-Perlen gebunden ist. <ol><li> Legen Sie die Röhrchen 1 min auf den Magnetständer und entfernen Sie tEr fließt, ohne die Perlen mit einer Pipette zu berühren. Füge 250 μl 1x Wulstwaschpuffer hinzu und lege die Röhrchen 5 min bei Raumtemperatur auf einen Rotationsmischer. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.3.1 zwei weitere Male und schließlich die gewaschenen MBD-Biotinperlen in 200 μl 1x Bead-Waschpuffer resuspendieren, wodurch die Perlen für die methylierte DNA-Capture bereit sind. HINWEIS: Waschen 2-3 mal auf diese Weise entfernt alle Hintergrund ungebundenen MBD-Protein-Perlen und verbessert die effiziente Bindung von MBD-Protein-gekoppelten Perlen mit fragmentierten genomischen DNA. </li></ol> 5. Bindung von MBD-Biotin-Perlen mit Fragmentierter Genom-DNA <ol><li> In einem sauberen 1,5 ml DNase-freien Röhrchen werden 100 &amp; mgr; l 5 &amp; times; Perlenwaschpuffer und 180 &amp; mgr; l der fragmentierten genomischen DNA zugegeben (Schritt 2.3). Bringen Sie das Endvolumen auf 500 μl mit DNase freiem Wasser. </li><li> Füge 380 μl DNase-freies Wasser zu den restlichen 20 μl der fragmentierten genomischen DNA hinzu und gefriere sie. Verwenden Sie diese Samples als Eingabe DNEine Kontrolle und fällt sie später zusammen mit den endgültigen eluierten methylierten DNA-Proben (siehe Schritt 7.1). </li><li> Legen Sie die Röhrchen mit gewaschenen MBD-Biotinperlen (Schritt 4.4) auf einen Magnetständer für 1 min und entfernen Sie die Flüssigkeit, ohne die Perlen zu stören. Fügen Sie 500 μl fragmentierte genomische DNA hinzu, die in Perlenwaschpuffer verdünnt ist. </li><li> Alle Röhrchen fest mit Paraffinfolie abdichten und über Nacht bei 4 ° C auf einem End-to-End-Rotationsständer bei 8-10 U / min belassen. ANMERKUNG: Die DNA- und Biotin-Bead-Bindungsreaktion kann für 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt werden, aber bei 4 ° C über Nacht kann die Wiederherstellung der endgültigen methylierten DNA verbessert werden. </li></ol> 6. Entfernen der ungebundenen DNA und Eluieren der methylierten DNA aus den Perlen <ol><li> Nach der DNA- und MBD-Perlen-Bindungsreaktion die Röhrchen für 1 min auf die magnetische Zahnstange stellen, um alle Perlen auf die Innenwand des Röhrchens zu konzentrieren. </li><li> Entfernen Sie die überstehende Flüssigkeit mit einer Pipette, ohne zu berührenDie Perlen und speichern diese ungebundene DNA-Probenfraktion auf Eis. </li><li> Füge 200 μl 1x Wulstwaschpuffer zu den Perlen hinzu und lege die Röhrchen 3 min bei Raumtemperatur auf den rotierenden Ständer. Legen Sie die Rohre auf den Magnetständer und entfernen Sie die Flüssigkeit. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei Mal, um die restliche ungebundene DNA zu entfernen. </li><li> Nach dem abschließenden Waschen werden 200 &amp; mgr; l hochsalziger Elutionspuffer (2.000 mM NaCl) zugegeben, der in dem Kit zur Eluierung der DNA bereitgestellt wird. </li><li> Die Röhrchen 15 min bei Raumtemperatur auf den rotierenden Ständer stellen. Legen Sie sie 1 min auf den Magnetständer und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand sorgfältig auf ein neues, sauberes 1,5 mL Röhrchen zu übertragen. </li><li> 200 μl Hochsalz-Elutionspuffer zugeben und die Elution durch Drehen der Röhrchen bei Raumtemperatur für 15 min wiederholen. Füge die zweite Elute zu demselben Röhrchen hinzu, das die 200 μl des ersten Eluats enthält. HINWEIS: Die endgültigen 400 μl der gesamten eluierten DNA ist nun bereit für die Ethanol-Präzipitation, um die gereinigten zu extrahierenDNA, die für die Sequenzierung der nächsten Generation geeignet ist. </li></ol> 7. Ethanol-Präzipitation und die Anreicherung von methylierter DNA <ol><li> Füge 1 μl Glykogen (20 μg / μL, im Kit enthalten) ein; 40 &amp; mgr; l 3 M Natriumacetat, pH 5,2; Und 800 &amp; mgr; l eiskaltes absolutes Ethanol zu 400 &amp; mgr; l eluierter DNA und auch zu den in Schritt 5.2 hergestellten 400 &amp; mgr; l Input-DNA-Proben </li><li> Mischen Sie die Röhrchen gut durch Vortexen und inkubieren sie bei -80 ° C über Nacht. </li><li> Die Röhrchen mit 12.000 xg (Höchstgeschwindigkeit) und 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand sorgfältig verwerfen, ohne das Pellet zu stören, 500 μl 70% iges Ethanol zuzugeben und die Röhrchen zu verwirbeln. </li><li> 10 Minuten bei 4 ° C mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren und den Überstand sorgfältig mit einer Pipette entfernen. Die Röhrchen mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und das restliche Ethanol vollständig mit einer Pipettenspitze entfernen. </li><li> Das Pellet für 5 min bei Raumtemperatur abtrocknenReifen Füge 10 μl DNase-freies Wasser zum DNA-Pellet hinzu. Weiter mit der methylierten DNA-Quantifizierung (Schritt 7.6), MBD-Sequenzierung (Schritt 7.7) und Analyse (Abschnitte 8 und 9). </li><li> Quantifizieren Sie die endgültig gewonnenen methylierten DNA-Proben unter Verwendung eines handelsüblichen fluorometrischen Quantifizierungskits (siehe Materialtabelle ) gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Anmerkung: Mit diesem Protokoll wurden 30-50 ng endgültige DNA aus jeder Probe gewonnen. DNA-Proben sind bereit, auf Trockeneis für nachgeschaltete Bibliotheksbau und Hochdurchsatz-MBD-Sequenzierung zu senden </li><li> Durchführen einer DNA-Bibliothekskonstruktion und einer Hochdurchsatz-MBD-Sequenzierung unter Verwendung einer kommerziellen Plattform ( Materials Table ), wie in Referenz 9 beschrieben. ANMERKUNG: Für die anfängliche Qualitätskontrolle der endgültigen methylierten DNA führen Sie Bibliothekszubereitungen unter Verwendung von 50-bp-Paar-End-Sequenzierungen für alle Proben durch. Verarbeiten Sie die Rohdaten für die Nachsequenzierung der Qualitätskontrolle, aS, die in Schritt 8.1 ausgearbeitet wurden, und weiterverarbeiten sie mit bioinformatischen Ansätzen und statistischen Methoden, wie unten beschrieben (Schritte 8.2-9.6). </li></ol> 8. Bioinformatik-Analyse Methode 1: Identifizierung von CLL-assoziierten differenziell methylierten Regionen (cllDMRs) <ol><li> Reinigen Sie die erhaltenen 49-bp-Lesungen (FASTQ-Format) für Adapter mit den verfügbaren Qualitätskontrollwerkzeugen wie Trimmomatic 10 oder Cutadapt. Crosscheck die Qualität der getrimmten Lesungen mit dem FastQC Toolkit: Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adapters.fasta: 2: 30: 10 </li><li> Richten Sie die gereinigten FASTQ-Dateien mit dem Kurzlesen-Genom-Aligner Bowtie gegen ein Referenzgenom aus 11 aus . Geben Sie die folgenden Parameter an: <ol><li> Erlaube bis zu zwei Fehlanpassungen (Bowtie-Parameter: -v 2). </li><li> Begrenzung der Berichterstattung auf die sechs besten Ausrichtungen pro Lesen (Bowtie-Parameter: -m 6) zur SteuerungFür Multi-Mapping liest. Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq&gt; SAMPLE.sam HINWEIS: Konvertieren Sie die SAM-Dateien, die für einzelne Samples generiert wurden, nach der Ausrichtung in BAM mit SAMtools. Samtools sehen -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam </li></ol></li><li> Verwenden Sie die modellbasierte Analyse des ChIP-Seq (MACS) Peak Callers auf ausgerichteten Samples (BAM), um angereicherte / methylierte Regionen aus den CLL-Subgruppen 12 vorherzusagen. HINWEIS: Vergleich I: Verwenden Sie das Input-Beispiel als Kontrollgruppe und die Normal- und CLL-Patientenproben als Behandlungsgruppen. Dieser Schritt ist, alle negativen Spitzen zu sammeln (Spitzen, die in Eingang / Hintergrund angereichert sind). Vergleich II: Verwenden Sie die Normal-Probengruppe als Kontrollgruppe und die CLL-Patienten-Probengruppe als Behandlungsgruppe. Erhaltene positive Peaks sind CLL-hypermethylierte Regionen, und negative Peaks sind CLL-hypomethylierte Regionen über normale oder differentiell methylierte Regionen (DMRs). Macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam - Format BAM -g hs </li><li> Vergleiche I-Hintergrund-Peaks aus differentiell methylierten Regionen (DMRs) mit BEDtools 13 . Bedtools subtrahieren -a &lt;CLL_enriched_regions&gt; -b &lt;Input_enriched_regions&gt; </li><li> Vorhersage des Prozentsatzes der Wiederholungselemente (SINE-Alu, LINE, etc. ), angereichert in DMRs. <ol><li> Verwenden Sie Fastacmd, um die FASTA-Sequenz von DMRs durch die chromosomalen Koordinaten aus dem Referenzgenom HG19 zu extrahieren. Fastacmd -d HG19_genome.fa -s Chromosom -L Start, Ende -l 50000&gt; DMRs.fasta </li><li> Verwenden Sie das RepeatMasker-Befehlszeilen-Tool, um den Prozentsatz der Wiederholungselemente, die in der FASTA-Sequenz von DMRs vorhanden sind, vorherzusagen. RepeatMasker -gc -gccalc -s -species mensch -html DMRs.fasta </li></ol></li><li> Annotieren Sie die vorhergesagten DMRs mit Homer &quot;annotatePeaks.pl&quot; mit dem verfügbaren Ensembl [PMC4919035] oR Gencode [PMID 22955987] Transkript-Annotation (Protein-Codierung und nicht-kodierende Transkripte). AnnotatePeaks.pl DMRs.bed &lt;GENOME&gt; -gtf &lt;Ensembl oder Gencode GTF&gt; HINWEIS: Hier finden Sie Informationen über die Verteilung von Peaks über verschiedene genetische Regionen ( zB Promotor, Exon, Intron, 3 &#39;UTRs und 5&#39; UTRs) und intergene Regionen. Transkripte oder Gene, die mit DMRs assoziiert sind, werden als differentiell methylierte Gene (DMGs) bezeichnet. </li><li> Verwenden Sie das Anreicherungswerkzeug mit der aktualisierten oder aktuellen Funktionsdatenbank, um Funktionen zu finden, die mit CLL DMGs angereichert sind (nur Protein-codierende Gene) 14 . HINWEIS: Gene Set Clustering basierend auf Functional Annotation (GeneSCF) 14 ist ein Echtzeit-basiertes Tool zur funktionalen Anreicherungsanalyse, das aktualisierte KEGG und Gene Ontology als Referenzdatenbank verwendet. </li></ol> 9. Bioinformatik-Analyse Methode 2: Identifizierung CLL-assoziiert signifikant DiffErentlich Methylierte Regionen (cll sigDMRs) <ol><li> Befolgen Sie die Schritte 8.1-8.5 von Methode I (Abschnitt 8) und verwenden Sie die Read-Count-basierte Differentialanreicherungsanalyse, indem Sie die verfügbaren Tools verwenden, wie in den Schritten 9.2 - 9.6 ausgearbeitet, um der Analyse-Pipeline eine weitere Statistikebene hinzuzufügen. </li><li> Quantifizieren Sie die Anzahl der Lesevorgänge, die einzelnen Peaks oder DMRs in Normal- und CLL-Patientenproben zugeordnet sind, mit &quot;featureCounts&quot; aus dem &quot;Subread&quot; -Paket 15 . Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam HINWEIS: Ein Mapping-Qualitätsfilter kann eingeführt werden, um eine Bestätigung der schlechten Qualität zu vermeiden ( z. B. -Q 30). Für diesen Schritt bereite ich SAF-Dateien für die erhaltenen DMRs vor. Für weitere Informationen über das SAF-Dateiformat verwenden Sie bitte diesen Link http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. </li><li> Verwenden Sie eine RAW-Lese-Zähler-Tabelle mit der Anzahl der Lesevorgänge für die einzelnen Peaks in Normal anD CLL Patientenprobengruppen in edgeR als Eingang 16 . HINWEIS: Vergleichen Sie normale versus CLL Patientenprobengruppen, um sigDMRs zu finden. Zur differenziellen Anreicherungsanalyse folgen Sie der Anleitung von edgeR für detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitungen (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). </li><li> Filtern Sie die sigDMRs mit der falschen Discovery Rate (FDR) und Log-Fold-Änderung, die von edgeR 16 vorhergesagt wird. </li><li> Annotieren Sie die vorhergesagten SigDMRs mit Homer &quot;annotatePeaks.pl&quot; mit der verfügbaren Ensembl- oder Gencode-Transkript-Annotation (Protein-Codierung und nichtcodierende Transkripte). AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf &lt;Ensembl oder Gencode GTF&gt; -CpG HINWEIS: Hier finden Sie Informationen über die Verteilung von Peaks über verschiedene genetische Regionen ( zB Promotor, Exon, Intron, 3 &#39;UTRs und 5&#39; UTRs) und intergene Regionen. Transkripte oder Gene, die mit si assoziiert sindGDMRs heißen sigDMGs. </li><li> Verwenden Sie ein Anreicherungswerkzeug mit der aktualisierten oder aktuellen Funktionsdatenbank, um mit CLL sigDMGs angereicherte Funktionen zu finden (nur Protein-kodierende Gene) 14 . HINWEIS: GeneSCF, eines der Echtzeit-Tools für die funktionale Anreicherungsanalyse, verwendet KEGG und Gene Ontology als Referenzdatenbanken. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

MBD-seq ist eine kostengünstige, immunpräzipitationsbasierte Technik, die verwendet werden kann, um Methylierungsmuster mit vollständiger genomweiter Abdeckung zu untersuchen. Sowohl MeDIP-Seq (methylierte DNA-Immunopräzipitation als auch Sequenzierung) und MBD-Seq führen zur Anreicherung von CpG-reicher methylierter DNA. Allerdings zeigt MBD-seq mehr Affinität zur Bindung an hoch-cpG-reiche Regionen im Vergleich zu MeDIP seq 19 . Unter Verwendung eines Methyl-bindenden Anreicherungs-Kits kann ma...

Die Verwendung von Sequenztechniken der nächsten Generation zur Analyse globaler DNA-Methylierungsprofile wurde in den letzten Jahren zunehmend populär. Genom-weite Methylierungs-Assays, einschließlich Mikroarray- und Nicht-Mikroarray-basierte Methoden, wurden auf der Grundlage der folgenden entwickelt: die Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA, methylierungsempfindliche Restriktionsenzymverdauungen und die Immunpräzipitation von methylierter DNA unter Verwendung von Methyl-CpG-spezifischen Antikörpern . Aberrant DNA-Methylierung ist eines der Kennzeichen der Leukämie und Lymphome, einschließlich der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL). Früher charakterisierten mehrere Gruppen, einschließlich unserer, die DNA-Methylierungsprofile verschiedener CLL-prognostischer Untergruppen und normale, gesunde B-Zell-Kontrollen unter Verwendung der Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA, gefolgt von Mikro-Array-basierten Methoden oder Voll-Genom-Sequenzierung 1 , 2 , 3 , &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 4. Die Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA führt zur Deamination von unmodifizierten Cytosinen zu Uracil, wobei die modifizierten methylierten Cytosine im Genom zurückbleiben. Nach der Umwandlung kann der Methylierungsstatus der DNA durch PCR-Amplifikation und Sequenzierung unter Verwendung unterschiedlicher quantitativer oder qualitativer Methoden, wie z. B. Mikro-Array-basierte oder Voll-Genom-Bisulfit-Sequenzierung (WGBS), bestimmt werden. Obwohl Bisulfit-umwandlungsbasierte Verfahren viele Vorteile haben und in verschiedenen Krebsarten weit verbreitet sind, um DNA-Methylierungsniveaus zu analysieren, gibt es einige Nachteile, die mit dieser Technik verbunden sind. Die WGBS-Sequenzierung ermöglicht eine Single-Base-Paar-Auflösung mit niedrigeren DNA-Mengen und ist die beste geeignete Option zur Analyse einer großen Anzahl von Proben. Diese Methode unterscheidet jedoch nicht die Modifikationen zwischen den 5 mC und 5 hmC Ebenen im Genom 5 , 6 . Darüber hinaus bieten Microarray-basierte Methoden nicht komplette cÜberleben des Genoms In einer aktuellen Studie aus unserem Labor 7 wurden immunpräzipitationsbasierte Verfahren anstelle von Bisulfit-Umwandlung verwendet, um hochgradig CpG-reiche, differentiell methylierte Regionen auf globaler Ebene bei CLL-Patienten und normalen gesunden Kontrollen zu identifizieren. Inmethyl-CpG-bindende Domäne (MBD) Sequenzierung der nächsten Generation (MBD-seq), die Anreicherung von doppelsträngiger fragmentierter DNA hängt vom Grad der CpG-Methylierung ab. Dieses Verfahren kann die Nachteile des Bisulfit-Umwandlungsverfahrens überwinden und kann auch eine genomweite Abdeckung der CpG-Methylierung in einer unvoreingenommenen und PCR-unabhängigen Weise bereitstellen. Zusätzlich kann im Gegensatz zu auf der Basis von Bisulfit-umwandlungsbasierten Mikroarray-Methoden MBD-seq verwendet werden, um den Methylierungsstatus von sich wiederholenden Elementen zu analysieren, wie z. B. lange durchbrochene nukleare Elemente (LINEs), kurze durchbrochene nukleare Elemente (SINEs), lange terminale Wiederholungen (LTRS) Usw. Im Vergleich zu Bisulfit-Umwandlungsverfahren,Ein MBD-seq-Protokoll erfordert eine relativ große Menge an Input-DNA. Auch die Qualität der Sequenzierung liest und die Daten hängen von der Spezifität, Affinität und Qualität der verwendeten Antikörper ab. Die aktuelle Studie erklärt ein detailliertes MBD-seq-Protokoll, um methylierte DNA für die Sequenzierung der nächsten Generation zu bereichern. Es verwendet ein kommerzielles, methyliertes DNA-Bindungsanreicherungs-Kit (aufgeführt in der Materialtabelle ) sowie eine rechnerische Pipeline zur Visualisierung und Interpretation von Methylierungssequenzdaten zur Identifizierung von CLL-spezifischen hyper- und hypomethylierten Regionen im Vergleich zu normalen gesunden Kontrollen. Grundsätzlich nutzt dieses Verfahren die Fähigkeit des MBD der humanen MBD2-Protein-Wechselwirkung mit methylierten CpGs, um mit Methyl-CpGs angereicherte DNA zu extrahieren, worauf die Hochdurchsatz-Sequenzierung von methylierter DNA folgt.

<table><tbody><tr><td>Dneasy Blut- und Gewebekit</td><td>Qaigen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep solution</td><td>A X I S-S H I E L D</td><td></td><td></td></tr> 1114544 <tr><td>Nano drop 2000</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE Puffer pH 8</td><td>Sigma aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Standard-Beschallungsgerät</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>TPX Bioruptorröhrchen 1,5 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010010-300</td><td></td></tr><tr><td>3 M Natriumacetat-Diagenode</td><td></td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel iBase Safe Imager Kombi-Kit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G6465EU</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel 2% Agarose-Gele</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G441002</td><td></td></tr><tr><td>Methylminer Methylierte DNA-Anreicherungskit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Labquake Tube Shaker/Rotators</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>415110</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-S</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>VWR</td><td>12620-848</td><td></td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanool</td><td>Jedes Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse freies Wasser</td><td>Milli Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA-Fällungsmittel (3M-Natriumacetat)</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>Safe Seal 1,5 mL Eppendorf Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0,5 mL Röhrchen</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Hiseq2000 Plattform</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasser&nbsp; Bath</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizblock-Zuschuss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rohrrotater</td><td>Labquake</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

umfassende dna-methylierungsanalyse unter verwendung einer methyl-cpg-bindenden domänen-capture-basierten methode bei chronischen lymphatischen leukämie-patienten

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Die Rolle der langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) bei Krebs kommt in den Vordergrund, da das Interesse an dem Verständnis ihrer mechanistischen Funktionen während der Krebsentwicklung und -progression zunimmt. Trotzdem wurde die globale epigenetische Regulation von lncRNAs und repetitiven Sequenzen bei Krebs insbesondere bei chronischer lymphozytischer Leukämie (CLL) nicht gut untersucht. Diese Studie konzentriert sich auf einen einzigartigen Ansatz: die immunpräzipitationsbasierte Erfassung von doppelsträngigen, methylierten DNA-Fragmenten unter Verwendung von Methylbindungsdomänen (MBD) -Proteinen, gefolgt von einer Sequenzierung der nächsten Generation (MBD-seq). CLL-Patientenproben, die zu zwei prognostischen Untergruppen gehörten (5 IGVH-mutierte Proben + 5 IGVH-unmutierte Proben), wurden in dieser Studie verwendet. Die Analyse ergab 5.800 hypermethylierte und 12.570 hypomethylierte CLL-spezifische differentiell methylierte Gene (cllDMGs) im Vergleich zu normalen gesunden Kontrollen. Wichtig ist, dass diese Ergebnisse mehrere CLL-spezifische, differentiell methylierte lncRNAs identifiziertenPetitive Elemente und Protein-kodierende Gene mit potenziellem prognostischen Wert. Diese Arbeit skizziert ein detailliertes Protokoll für eine MBD-Seq- und Bioinformatik-Pipeline, die für die umfassende Analyse globaler Methylierungsprofile in hochcpG-reichen Regionen mit CLL-Patientenproben entwickelt wurde. Schließlich wurden ein Protein-kodierendes Gen und eine lncRNA mittels Pyrosequenzierung validiert, was eine hochquantitative Methode zur Analyse von CpG-Methylierungsniveaus ist, um die Befunde aus dem MBD-seq-Protokoll weiter zu bestätigen.

MBD-seq wurde vor kurzem bei CLL-Patienten und abgestimmten, normalen, gesunden Kontrollen durchgeführt, um CLL-spezifische differentiell hyper- und hypomethylierte Gene zu identifizieren 7 . Die experimentelle und bioinformatische Pipeline, die für die Analyse der von CLL und normalen gesunden Proben erzeugten Daten verwendet wird, ist in 1A und 1B gezeigt . Diese Analysen identifizierten mehrere CLL-spezifische diff...

Diese Arbeit beschreibt ein optimiertes Methyl-CpG-Bindungsdomäne (MBD) Sequenzierungsprotokoll und eine rechnerische Pipeline zur Identifizierung von differentiell methylierten CpG-reichen Regionen bei chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) Patienten.

Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die globale Methylierungsprofilerstellung zu untersuchen und unterschiedlich methylierte CpG-reiche Regionen bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie mithilfe der Next-Generation-Sequenzierung zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung potenzieller, spezifischer Signaturgene für die CLL-Krankheitspathogenese und -Prognose. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine vollständige genomweite Abdeckung der CpG-Methylierung unabhängig von PCR und ohne systematische Verzerrungen bietet.Beginnen Sie mit der Isolierung genomischer DNA aus den Proben von Patienten und normalen peripheren mononukleären Blutzellen mithilfe eines handelsüblichen DNA-Extraktionskits gemäß der Herstelleranleitung. Nach der Quantifizierung der genomischen DNA, wie im Textprotokoll beschrieben, verdünnen Sie 5 Mikrogramm genomischer DNA jeder Probe auf insgesamt 200 Mikroliter mit TE-Puffer, sodass eine Endkonzentration von 25 Nanogramm pro Mikroliter erreicht wird. Führen Sie anschließend die Sonolyse in speziell konzipierten Röhrchen mithilfe eines Ultraschallgeräts für insgesamt 30 Zyklen mit jeweils 30 Sekunden Einschalt- und 30 Sekunden Ausschaltzeit durch.Nach jeweils fünf Zyklen die Röhrchen kurz abspinnen, um die Proben am Boden zu sammeln. Überprüfen Sie mithilfe der in der schriftlichen Anleitung beschriebenen DNA-Elektrophorese den Beschallungsbereich aller Proben. Zum Vorbereiten der magnetischen Streptavidin-Kügelchen suspendieren Sie diese zunächst aus dem vom Kit bereitgestellten Stammröhrchen erneut.Pipettieren Sie die Kügelchen vorsichtig mehrmals auf und ab, um eine homogene Suspension zu erhalten. Geben Sie für jeweils fünf Mikrogramm fragmentierte DNA-Probe 50 Mikroliter der Kügelchen in separate, saubere und beschriftete 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 50 Mikroliter 1X Kügelchen-Waschpuffer hinzu, um ein Endvolumen von 100 Mikrolitern zu erreichen.Stellen Sie die Röhrchen eine Minute lang auf einen Magnethalter, damit sich alle magnetischen Perlen an der inneren Wand des Röhrchens, die dem Magneten zugewandt ist, sammeln können. Entfernen Sie die Flüssigkeit, ohne die Perlen zu berühren, mit einer 200-Mikroliter-Pipette. Danach nehmen Sie die Röhrchen vom Magnethalter, geben 250 Mikroliter 1X Waschpuffer für Perlen hinzu und mischen die Perlen vorsichtig mit einer Pipette. Nachdem diese Schritte mindestens viermal für alle Proben wiederholt wurden, resuspendieren Sie die Proben abschließend in 250 µL 1X Bead-Waschpuffer. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf. Um das MBD-Biotin-Protein an die gewaschenen Bärtchen zu binden, geben Sie zunächst 35 µL Protein in separate Röhrchen und stellen das Gesamtvolumen mit 1X Bead-Waschpuffer auf 250 µL ein.Fügen Sie 250 Mikroliter verdünntes MBD-Protein zu den 250 Mikrolitern gewaschenen Kugeln hinzu und lassen Sie sie bei Raumtemperatur im End-over-End-Rotator stehen. Nach einer Stunde Vermischung der Kugeln mit dem Protein waschen Sie die proteinbeladenen magnetischen Streptavidin-Kugeln, indem Sie die Röhrchen für eine Minute auf den Magnethalter stellen. Entfernen Sie die Flüssigkeit, ohne die Kugeln mit einer Pipette zu berühren.Fügen Sie dann 250 Mikroliter 1X Kugelwaschpuffer hinzu und stellen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Rotationsmischer. Wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal, bevor Sie die gewaschenen MBD-Biotin-Kügelchen in 200 Mikrolitern 1X Kugelwaschpuffer erneut suspendieren, wodurch die Kügelchen für die Bindung methylierter DNA bereitstehen. In einem sauberen, DNase-freien 1,5-Milliliter-Röhrchen geben Sie 100 Mikroliter Milliliter Kugelwaschpuffer und 180 Mikroliter der fragmentierten genomischen DNA hinzu.Bringen Sie das Endvolumen mit DNase-freiem Wasser auf 500 Mikroliter. Geben Sie 380 Mikroliter DNase-freies Wasser zu den verbleibenden 20 Litern der fragmentierten genomischen DNA hinzu. Gefrieren Sie die Proben, um sie später weiterzuverarbeiten und als Input-DNA-Kontrollen zu verwenden.Stellen Sie die Röhrchen mit gewaschenen MBD-Biotin-Kügelchen eine Minute lang auf einen Magneten und entfernen Sie die Flüssigkeit, ohne die Kügelchen zu stören. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter fragmentierte genomische DNA, verdünnt in Kügelchen-Waschpuffer, hinzu. Verschließen Sie alle Röhrchen fest mit Parafilm und lassen Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einem kippbaren Rotationsgestell mit 8 bis 10 Umdrehungen pro Minute inkubieren.Nach der DNA- und MBD-Perlen-Bindungsreaktion die Röhrchen eine Minute lang auf den Magnetrack stellen, um die Perlen an der Innenwand des Röhrchens zu sammeln. Die überstehende Flüssigkeit mit einer Pipette entfernen, wobei die Perlen nicht berührt werden dürfen, und diesen ungebundenen DNA-Probenanteil auf Eis aufbewahren. Anschließend 200 Mikroliter 1×-Perlen-Waschpuffer zu den Perlen geben und die Röhrchen drei Minuten lang bei Raumtemperatur auf den rotierenden Ständer stellen.Nachdem die Flüssigkeit mithilfe des Magnethalters entfernt wurde, wiederholen Sie die Waschung noch zwei Mal, um die restlichen ungebundenen DNA zu entfernen. Nach der letzten Waschung fügen Sie 200 Mikroliter Puffer mit hohem Salzgehalt hinzu, der im Kit enthalten ist, um die DNA zu eluieren. Anschließend stellen Sie die Röhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf den Rotationshalter.Nach der Inkubation stellen Sie sie eine Minute lang auf den Magnethalter und überführen vorsichtig den Überstand mit einer Pipette in ein neues, sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter Puffer mit hohem Salzgehalt zur Elution zu den Kügelchen und wiederholen Sie die Elution, indem Sie die Röhrchen 15 Minuten zusätzlich bei Raumtemperatur rotieren lassen. Fügen Sie die zweite Eluierfraktion demselben Röhrchen hinzu, das die 200 Mikroliter der ersten Eluierfraktion enthält.Um die DNA auszufällen, fügen Sie einen Mikroliter Glykogen, 40 Mikroliter dreimolarer Natriumacetat, pH 5,2, und 800 Mikroliter eiskalten absoluten Ethanols zu 400 Mikrolitern eluierter DNA hinzu. Geben Sie die Reagenzien ebenfalls zu den zuvor eingefrorenen 400 Mikrolitern der Input-DNA-Kontrollproben hinzu. Mischen Sie die Röhrchen gründlich durch Vortexen, bevor Sie sie über Nacht bei minus 80 Grad Celsius inkubieren.Am nächsten Tag die Röhrchen bei 12.000 × g und 4 Grad Celsius 30 Minuten lang zentrifugieren. Das Überstandsmittel vorsichtig verwerfen, ohne das Pellet zu stören. Anschließend 500 µL 70 %igen Ethanol hinzufügen und die Röhrchen vortexen.Nach erneutem Zentrifugieren der Röhrchen unter denselben Bedingungen, jedoch für 15 Minuten, entfernen Sie den Überstand vorsichtig mittels einer Pipette. Zentrifugieren Sie anschließend die Röhrchen für eine Minute bei Raumtemperatur mit maximaler Geschwindigkeit und entfernen Sie das restliche Ethanol vollständig mit einer Pipettenspitze. Lassen Sie das Pellet fünf Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.Fügen Sie abschließend 10 µL DNase-freies Wasser zum DNA-Pellet hinzu, bevor Sie mit der Quantifizierung der methylierten DNA, der MBD-Sequenzierung und der Analyse gemäß dem schriftlichen Protokoll fortfahren. Die Analyse identifizierte mehrere unterschiedlich hyper- und hypomethylierte Regionen, die in CLL-Proben im Vergleich zu normalen Kontrollen angereichert waren. Diese unterschiedlich methylierten Regionen wurden verschiedenen Klassen von protein- und nicht-kodierenden Genen zugeordnet.Schließlich zeigte die Datenanalyse eine signifikante Überschneidung zwischen den aus zwei verschiedenen normalen Kontrollvergleichen erhaltenen CLL-assoziierten differentiell methylierten Regionen. Hier wurden alle CpG-Stellen in den Zielregionen zweier differentiell methylierter Gene in einer großen Anzahl von CLL-Proben mittels Pyrosequenzierung validiert. Der optimale Bereich der für diese Methode erforderlichen Sonifikation wird hier veranschaulicht.Dieser Bereich an fragmentierter DNA ist ideal und besser geeignet für die Zwecke der Next-Generation-Sequenzierung. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sind die entscheidenden Faktoren, die die endgültige DNA-Rückgewinnung beeinflussen, die Qualität und Menge der verwendeten Input-DNA sowie der Bereich der fragmentierten DNA nach der Sonifikation.Wir haben uns für diese Methode entschieden, da es die erste globale Methylierungsstudie bei CLL ist, die auf der Immunpräzipitation zur Anreicherung methylierter DNA basiert, wodurch alle methylierten Genomregionen abgedeckt werden. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Prognose oder Therapie, da die identifizierten differentiell methylierten Signaturgene als globale normale Biomarker sowie als epigenetische Therapieziele dienen könnten. Nach dieser Vorgehensweise kann die angereicherte methylierte DNA für weitere nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden, beispielsweise zum Hybridisieren oder Durchführen von Microarrays, um die Methylome zwischen zwei Proben oder Krankheitsentitäten mithilfe eines festgelegten Satzes von CpG-Stellen auf den Arrays einfach zu vergleichen.Es handelt sich schließlich um eine kostengünstige Methode, um eine große Anzahl von Patientenproben auf methylierte Sequenzen im gesamten Genom zu analysieren, einschließlich annotierter Sequenzen, die protein-codierende Gene umfassen, sowie nicht annotierter Sequenzen, die repetitive Elemente und lange nicht-kodierende RNAs umfassen.

comprehensive-dna-methylation-analysis-using-methyl-cpg-binding

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Der Goldstandard für die DNA-Methylierung ist genomische Sequenzierung von Bisulfit-konvertierter DNA. Diese Methode nutzt die erhöhte Empfindlichkeit von Cytosin verglichen mit 5-Methylcytosin (5-MeC) zu Desaminierung unter sauren Bedingungen Bisulfit. Unmethylierte Cytosine kann von methylierter Cytosine nach PCR-Amplifikation der Ziel-genomischer DNA unterschieden werden.

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Dieses Video demonstriert die Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktionstechnik zur gleichzeitigen Quantifizierung von methylierten DNA-Regionen in verschiedenen Populationen weißer Blutkörperchen als frühen Biomarker für die klinische Diagnose und Prognose.

Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion zum Nachweis der DNA-Methylierung in Leukozyten

Enhanced Reduced Representation Bisulfit Sequencing ist eine Methode zur Erstellung von Sequenzierungsbibliotheken für die DNA-Methylierungsanalyse, die auf dem Verdau von Restriktionsenzymen in Kombination mit der Umwandlung von Cytosin-Bisulfit basiert. Dieses Protokoll erfordert 50 ng Ausgangsmaterial und liefert Daten zur Auflösung von Basenpaaren in GC-reichen genomischen Regionen.

Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

Bisulfit-Amplikon-Sequenzierung (BSAS) ist eine Methode zur Quantifizierung der Cytosin-Methylierung in bestimmten genomischen Regionen von Interesse. Bei dieser Methode wird die Bisulfit-Umwandlung in Kombination mit der PCR-Amplifikation von Zielregionen vor der Next-Generation-Sequenzierung verwendet, um eine absolute Quantifizierung der DNA-Methylierung auf basenspezifischer Ebene zu erzielen.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Neu entdeckte oxidierte Formen von 5-Methylcytosine (Oxi-mCs), 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxylcytosine (5caC) kann verschiedene DNA-Modifikationen mit einzigartigen funktionellen Rollen vertreten. Hier ist ein semi-quantitative Workflow zur Visualisierung der räumlichen Verteilung Oxi-mCs, Signal Intensität Profilierung und NS1 beschrieben.

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

Beschrieben wird hier die Verwendung einer methylierungsspezifischen Sondenverstärkungsmethode zur Analyse der Methylierungvon LINE-1-Elementen in mesenchymalen Stammzellen, die mit osteosarkomabgeleiteten extrazellulären Vesikeln behandelt werden. Ultrazentrifugation, ein beliebtes Verfahren zur Trennung extrazellulärer Vesikel vom fetalen Rinderserum, wird ebenfalls demonstriert.

LINE-1 Methylierungsanalyse in mesenchymalen Stammzellen, die mit Osteosarkom-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln behandelt werden

Hierin beschreiben wir ein Verfahren zur genomweiten Analyse der DNA-Methylierung bei Magen-Darm-Krebs. Das Verfahren ist von Bedeutung für Studien, die Zusammenhänge zwischen Methylierungsmustern von Genen und Faktoren untersuchen, die zur Karzinogenese bei Magen-Darm-Krebs beitragen.

Genomweite Analyse der DNA-Methylierung bei Magen-Darm-Krebs

Epigenetische Marker werden für die Untertypisierung von weißen Blutkörperchen (WBC) durch die Quantifizierung von DNA-Methylierungsmustern verwendet. Dieses Protokoll stellt ein Multiplex-Droplet-Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (mdPCR) unter Verwendung eines thermoplastischen Elastomer(TPE)-basierten mikrofluidischen Geräts zur Tröpfchenerzeugung dar, das eine präzise und Multiplexmethylierungsspezifische Zielquantifizierung von WBC-Differentialzählungen ermöglicht.

Methylierung spezifische Multiplex Droplet PCR mit Polymer Droplet Generator Gerät für die hämatologische Diagnostik

Die vorliegende Studie beschreibt den Workflow zur Verwaltung von DNA-Methylierungsdaten, die durch Microarray-Technologien erhalten werden. Das Protokoll veranschaulicht die Schritte von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse. Alle Verfahren werden detailliert beschrieben, und das Video zeigt die wesentlichen Schritte.

Probenvorbereitung zur bioinformatischen Analyse der DNA-Methylierung: Assoziationsstrategie für Adipositas und verwandte Merkmalsstudien

Erfahren Sie die MBD-Sequenzierungsmethode zur Analyse der globalen DNA-Methylierung bei chronischer lymphatischer Leukämie. Diese PCR-unabhängige Technik ermöglicht die Identifizierung differenziell methylierter Regionen für Biomarker.

Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten (Video) | JoVE Journal

Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten

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