Isolierung von aktivem Caenorhabditis elegans Kernextrakt und Rekonstitution für in vitro Transkription

Dieses Protokoll füllt eine technische Lücke für die biochemische Untersuchung von C.elegans und erweitert ihre Nützlichkeit als Modellorganismus. Diese Technik ist sowohl einfach als auch robust und ermöglicht eine konsistente Isolierung von funktionell aktivem C.elegans-Kernextrakt. Legen Sie zunächst die synchronisierten L1-Tiere auf 10 150-Millimeter-Nematoden-Wachstumsmedienplatten, die mit Escherichia coli OP50 ausgesät sind, und lassen Sie die Tiere 48 Stunden bei 20 Grad Celsius wachsen, bis sie das L4-Stadium erreichen.

Sobald die hypotonen und hypertonen Puffer vorbereitet sind, reinigen Sie den Balch-Homogenisator, indem Sie die Mahlkammer mit 70% Ethanol überfluten. Dann spülen Sie die Kammer mit entionisiertem Wasser ab, um das überschüssige Ethanol zu entfernen. Setzen Sie die Hartmetallkugel in die Mahlkammer ein.

Schließen Sie die Enden des Fasses des Balch Homogenisators ab und sichern Sie die Kappen mit den mitgelieferten Rändelschrauben. Bereiten Sie dann fünf Milliliter der vollständigen hypotonen und hypertonen Puffer pro Probe vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Als nächstes füllen Sie eine sterile Zwei-Milliliter-Spritze mit einem Milliliter vollständigem hypotonischen Puffer und spülen Sie vorsichtig die Mahlkammer des Balch-Homogenisators, wobei etwa 500 Mikroliter des vollständigen hypotonischen Puffers in der Kammer verbleiben.

Bewahren Sie den gespülten Homogenisator auf Eis auf und lassen Sie ihn 30 Minuten abkühlen. Sammeln Sie die gut gefütterten L4-Tiere mit M9-Puffer in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Tiere drei Minuten lang bei 1.000 g. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Tierpellet weiter, bis der Überstand klar ist.

Als nächstes waschen Sie die Tiere mit drei Millilitern kaltem hypotonen Puffer und zentrifugieren Sie erneut wie gezeigt. Nachdem Sie den überstehenden hypotonischen Puffer entfernt haben, fügen Sie dem Tierpellet einen Milliliter vollständigen hypotonischen Puffer hinzu und übertragen Sie die Tierische Suspension auf eine neue sterile Zwei-Milliliter-Spritze. Um die auf Eis gehaltenen Tiere zu homogenisieren, schieben Sie die Tiere vorsichtig durch die Mahlkammer des mit der Wolframkugel beladenen Balch-Homogenisators.

Sammeln Sie dann die Tiere wieder in der Spritze und wiederholen Sie diesen Vorgang 30 Mal. Sammeln Sie nach 30 Homogenisierungszyklen die maximale Tiersuspension aus dem Balch-Homogenisator und lagern Sie die Spritze mit der Spitze nach unten in einem 1,7-Milliliter-Mikroröhrchen. Entfernen Sie die Wolframkugel und reinigen Sie die Mahlkammer mit entionisiertem Wasser.

Trocknen Sie die Kugel und geben Sie sie in das jeweils beschriftete Rohr zurück. Setzen Sie dann die Wolframkugel mit einem Durchmesser von 7,9880 Millimetern und einem Spaltabstand von 12 Mikrometern in die Mahlkammer ein und verschließen Sie den Homogenisator erneut. Spülen Sie die Mahlkammer erneut mit einem Milliliter eiskaltem hypotonischem Puffer.

Schleifen Sie die Suspension 25 Mal wie gezeigt. Geben Sie die Tierische Suspension in ein sauberes 1,7-Milliliter-Mikroröhrchen und lagern Sie die Suspension auf Eis. Pellet entlang der Tierkörper und Trümmer durch Zentrifugation.

40 Mikroliter des Überstandes in ein als Eingangsfraktion bezeichnetes Röhrchen pipettieren und die Fraktion auf Eis speichern. Den verbleibenden Überstand in ein neues 1,7-Milliliter-Röhrchen überführen, ohne das Pellet zu stören, und die Kerne zentrifugieren. Dann übertragen Sie den Überstand, ohne die pelletierten Kerne zu stören, in ein neues 1,7-Milliliter-Röhrchen, das als zytosolische Fraktion gekennzeichnet ist.

Um das Kernpellet zu waschen, fügen Sie dem Pellet 500 Mikroliter vollständigen hypotonischen Puffer hinzu, suspendieren Sie das Pellet und zentrifugieren Sie bei 4.000 mal g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Am Ende der Zentrifugation resuspendieren Sie das Kernpellet in 500 Mikrolitern frischem, vollständigem hypotonischen Puffer und zentrifugieren Sie die Probe erneut wie demonstriert. Dann lösen Sie das Pellet in 40 Mikrolitern vollständigem hypertonen Puffer auf.

Übertragen Sie die Kernsuspension in ein neues 1,7-Milliliter-Rohr mit der Bezeichnung Kernfraktion und lagern Sie es auf Eis. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration von drei Fraktionen mit einem fluoreszierenden Quantifizierungskit. Aliquotieren Sie die Kernfraktionen in Einwegröhrchen, die sechs Mikrogramm des Kernproteins enthalten, und schockieren Sie im Trockeneis- und Ethanolbad.

Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Das repräsentative Gelbild zeigt die Transkriptionsprodukte von Caenorhabditis elegans L4 Larven Kernextrakt unter Verwendung der CMV Promotor DNA Template. Die erfolgreiche Isolierung aktiver Kernproteine führte nach einer In-vitro-Transkription zu einer 132-Basenpaar-Bande, und eine erfolglose Isolierung führte zu einer schwachen Bande oder dem Fehlen einer Bande.

Denken Sie daran, die vollständigen Puffer deutlich zu beschriften. Ungeeignete Puffer können die Funktionalität der Kernproteine beeinträchtigen. Halten Sie den Homogenisator auch eiskalt, um eine Denaturierung der Proteine zu verhindern.

Die Entwicklung dieser Technik ermöglichte es den Forschern, die Rate der RNA-Transkription von C. elegans unter stressigen Bedingungen zu messen, was zeigt, dass sich die Transkriptionsrate des Tieres je nach Umweltbedingungen ändern kann.