Name: Isolierung von aktivem Caenorhabditis elegans Kernextrakt und Rekonstitution für in vitro Transkription (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Lernen Sie die Isolierung funktionell aktiver C. elegans-Kernextrakte mit einem Balch-Homogenisator für in-vitro-Transkriptionsstudien. Diese robuste Methode ermöglicht die Visualisierung von Transkriptionsaktivität und erweitert die biochemische Nutzbarkeit des Modellorganismus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch einen NIH MIRA-Zuschuss (R35GM124678 an J. S.) unterstützt.

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-15 (2007).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li>
<li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li>
<li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7(2014).</li>
<li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87(2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-11 (2006).</li>
<li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+buffers+in+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offenzulegen.

C. elegans ist ein attraktiver Modellorganismus zur Untersuchung des eukaryotischen Transkriptionssystems wegen seiner kostengünstigen Wartung und der Einfachkeit der genetischen Manipulation. Hier wird ein Protokoll zur konsistenten Isolierung von funktionell aktivem Kernextrakt aus L4 C. elegans beschrieben. Obwohl sich dieses Protokoll auf die Visualisierung der Transkriptionsaktivität konzentrierte, kann die posttranskriptionell produzierte cDNA mit RT-qPCR quantifiziert werden, um eine genauere Mes...

Der kleine, freilebende Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein einfacher, aber leistungsfähiger Modellorganismus zur Beantwortung einer Vielzahl biologischer Fragestellungen. Seit ihrer Einführung im Jahr 1963 sind die Nematoden von unschätzbarem Wert für die Beantwortung von Fragen der Neurobiologie, des Stoffwechsels, des Alterns, der Entwicklung, der Immunität und der Genetik1. Zu den vielen Eigenschaften des Tieres, die es zu einem idealen Modellorganismus machen, gehören die kurze Generationszeit, die Wirksamkeit der RNA-Interferenz, der transparente Körper und die vollständigen Karten seiner zellulären Abstammung und seines Nervensystems.
Während die Beiträge des Nematoden zur Wissenschaft enorm sind, wurden sie nicht ausreichend genutzt, um das eukaryotische Transkriptionssystem aufzuklären, wobei der größte Teil unseres Verständnisses über diese Mechanismen aus Studien stammt, die Kernextrakt aus Hefe, Fruchtfliege und Säugetierzellkultur verwenden2. Die größte Hürde, die Forscher davon abhält, funktionellen Kernextrakt zu extrahieren, ist die zähe äußere Kutikula des Nematoden. Dieses Exoskelett besteht aus vernetzten Kollagenen, Cuticlinen, Glykoproteinen und Lipiden, wodurch C. elegans vom Larvenstadium bis zum Erwachsenenalter resistent gegen die Proteinextraktion durch chemische oder mechanische Kräfte ist3. Ein In-vitro-Transkriptionssystem unter Verwendung von C. elegans-Kernextrakt wurde einst entwickelt, aber aufgrund des begrenzten Anwendungsbereichs des Systems nicht weit verbreitet, und die Verwendung eines Dounce-Homogenisators zur Herstellung des Extrakts könnte zu Proteininstabilität führen4,5.
Im Gegensatz zum vorherigen Protokoll zur Isolierung von Kernextrakten, bei dem ein Dounce-Homogenisator zum Brechen von C. elegans verwendet wurde, verwendet dieses Protokoll einen Balch-Homogenisator. Der Balch Homogenisator besteht aus zwei Hauptkomponenten: einer Hartmetallkugel und einem Edelstahlblock mit einem Kanal, der von einem Ende zum anderen durchbohrt ist. Der Balch Homogenisator wird mit der Hartmetallkugel beladen und auf beiden Seiten verschlossen, um die Mahlkammer abzudichten. Spritzen können auf die beiden vertikalen Ports geladen werden, die in die Mahlkammer führen. Wenn das Material durch die Mahlkammer von einer Spritze zur anderen geleitet wird, drückt der Druck der Spritzen das Material durch einen engen Spalt zwischen der Kugel und der Wand der Kammer. Dieser langsame und konstante Druck bricht das Material, bis es eine konstante Größe erreicht, die in der Lage ist, den engen Spalt leicht zu passieren. C . elegans durch einen konstanten, aber sanften Druck durch den engen Spalt zu zwingen, bricht die Tiere auf und gibt ihren Inhalt in den umgebenden Puffer ab. Das Umschalten der Kugelgrößen verschärft den Spalt weiter, bricht die neu freigesetzten Zellen auf und befreit die Kerne in den Puffer. Mehrere Fälle von Zentrifugation trennen die Kerne vom Rest der Zelltrümmer, was die Sammlung eines sauberen Kernextrakts ermöglicht. Der Balch-Homogenisator wird aus mehreren Gründen gegenüber dem Dounce-Homogenisator bevorzugt: Das System kann eine große Anzahl von Tieren verarbeiten, so dass es möglich ist, eine hohe Menge an aktiven Proteinen in einem einzigen Versuch zu extrahieren; die präzise Bearbeitung der Kugeln und des Stahlblocks ermöglicht ein gleichmäßiges Schleifen zwischen mehreren Proben; Der schwere Stahlblock wirkt wie ein Kühlkörper, der die Wärme gleichmäßig von der Mahlkammer ableitet und eine Denaturierung verhindert.
Nach der Isolierung muss die Transkriptionsaktivität des Kernextrakts überprüft werden, bevor sie in biochemischen Experimenten verwendet wird. Traditionell wurde die Transkriptionsaktivität mit radioaktiv markierten Nukleotiden gemessen, um die neu synthetisierte RNA zu verfolgen und zu visualisieren. Die radioaktive Markierung kann jedoch aufwändig sein, da sie während des Gebrauchs und der Entsorgung Vorsichtsmaßnahmen erfordert6. Technologische Fortschritte ermöglichen es Forschern heute, viel weniger schädliche oder lästige Methoden zu verwenden, um selbst kleine RNA-Größen mit Techniken wie der quantitativen Real-Time-PCR (qRT-PCR)7 zu messen. Hier beschreibt das Protokoll eine Methode zur Isolierung von aktivem Kernextrakt aus Larvenstadium 4 (L4) C. elegans und visualisierung der Transkriptionsaktivität in einem In-vitro-System.

<table><tbody><tr><td>Verbrauchsmaterialien und Reagenzien0,2</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mL 8-Streifen-Röhrchen & Flache Streifenkappen, klar</td><td>Genesee Scientsp</td><td>; 24-706</td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL Einzelne PCR-Röhrchen</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-153G</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL sterile Mikroröhrchen</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282S</td><td></td></tr><tr><td>100% absolutes Ethanol in molekularer Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP2818</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol, Koptec</td><td>Decon Labs</td><td>&nbsp; V1001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipette</td><td>VWR international</td><td> 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Petriplatten</td><td>Tritech Research</td><td>&nbsp; T3325</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 28-103</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Kunststoffspritzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955460</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Norm-Ject Spritzen</td><td>Henke-Sass Wolf GmbH</td><td>4020</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Vakuumfilterbecher 0,22 &micro; m PES, Stericup Millipore Express Plus</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>konische Zentrifugenröhrchen 50 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>serologische Pipette 50 mL</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-902</td><td></td></tr><tr><td>5 mL serologische Pipette</td><td>VWR international</td><td> 89130-896</td><td></td></tr><tr><td>Agar, Criterion</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; C7432</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Denville Wissenschaftlich</td><td>&nbsp; CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol-Marker</td><td>VWR International</td><td> 52877-310</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>Calciumdichlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; C4901</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; C8667</td><td></td></tr><tr><td>Kontrolle DNA-Tempel-Klonierungsprimer, Vorwärts 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontrolle der DNA-Tempelklonierung von Primern, Vorwärts 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg tcg cca tga t -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 15508-013</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Gel-Färbung, SYBR-sicheres</td><td>Invitrogen</td><td> S33102</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Leiter-Mix, O' Gen-Herrscher</td><td>Fisher Scient</td><td>&nbsp; SM1173</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Ladefarbstoff, 6x TriTrack</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>FERR1161</tr><tr><td>DNase, Baseline-ZERO</td><td>Luigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>DB0715K</tr><tr><td>Trockeneis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50 Stamm</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A38</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; G6279</td><td></td></tr><tr><td>In-vitro-Transkriptionssystem für HeLa-Kernextrakt, HeLaScribe</td><td>Promega</td><td>&nbsp; E3110</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Lösung, 1 M Gibco</td><td>Millipore Sigma</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure 37%</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>Hypochloritbleiche</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; L3022</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumdichlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; M8266</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mittelschwere Schalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 02-202-101</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger, Vista Vision</td><td>VWR International</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in molekularer Qualität, Hypure</td><td>Hyclone Laboratories</td><td>&nbsp; </td><td></td>SH30538</tr><tr><td>Nystatin</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; N1638</td><td></td></tr><tr><td>PCR-System, FailSafe mit Premix A</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>FS99100</tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P39111</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P3786</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor, Halt Einmal-Cocktail 100x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Assay-Kit, Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; Q33211</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transkriptionskit, Sensiscript</td><td>Qiagen</td><td>205211 RNA-Extraktionskit</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Microkit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>&nbsp; </td><td></td>N8080119</tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; BDH9286-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; 1-09137</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Spritzenvorsatzfilter mit 0,2 & Mikro; m Polyethersulfon-Membran</td><td>VWR international</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 200-334-9</td><td></td></tr><tr><td>Transkriptionsprimer, Vorwärts 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transkriptionsprimer, Reverse 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P2287</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &deg; C Inkubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &deg; C Inkubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Inkubator</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Kühlschrank</td><td>ThermoFisher Scientific-80</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C Gefrierschrank</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balch Homogenisator, isobiotec Zellhomogenisator</td><td>Isobiotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge, Eppendorf 5418 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge, VWR Clinical 50</td><td>VWR International</td><td>82013-800</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop, Leica M80</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer, Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Bildgebungssystem, iBright FL1500</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; A44241</td><td></td></tr><tr><td>Gelsystem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>VWR International</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugen, Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra</td><td>155017</td><td></td></tr><tr><td>Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Schaukelplattform</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950030010</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von aktivem caenorhabditis elegans kernextrakt und rekonstitution für in vitro transkription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans ist seit seiner Einführung im Jahr 1963 ein wichtiges Modellsystem für die biologische Forschung. C. elegans wurde jedoch nicht vollständig in der biochemischen Untersuchung biologischer Reaktionen unter Verwendung seiner Kernextrakte wie In-vitro-Transkription und DNA-Replikation eingesetzt. Eine wesentliche Hürde für die Verwendung von C. elegans in biochemischen Studien ist die Störung der dicken äußeren Kutikula des Fadenwurms, ohne die Aktivität des Kernextrakts zu beeinträchtigen. Während mehrere Methoden verwendet werden, um die Kutikula zu brechen, wie z.B. Dounce-Homogenisierung oder Beschallung, führen sie oft zu Proteininstabilität. Es gibt keine etablierten Protokolle für die Isolierung aktiver Kernproteine aus Larven oder erwachsenen C. elegans für In-vitro-Reaktionen . Hier beschreibt das Protokoll detailliert die Homogenisierung von Larvenstadium 4 C. elegans unter Verwendung eines Balch-Homogenisators. Der Balch-Homogenisator verwendet Druck, um die Tiere langsam durch eine enge Lücke zu zwingen, die dabei die Nagelhaut bricht. Das einheitliche Design und die präzise Bearbeitung des Balch Homogenisators ermöglichen ein gleichmäßiges Schleifen der Tiere zwischen den Versuchen. Die Fraktionierung des aus dem Balch-Homogenisator erhaltenen Homogenats ergibt einen funktionell aktiven Kernextrakt, der in einer In-vitro-Methode zur Bestimmung der Transkriptionsaktivität von C. elegans verwendet werden kann.

Die Einhaltung der skizzierten Schritte sollte funktionellen Kernextrakt ergeben (Abbildung 1), Abweichungen in den Mahl- oder Waschschritten können zu schlechter Aktivität oder geringen Ausbeuten führen. Wenn funktioneller C. elegans-Kernextrakt erhalten wird, transkribiert er die Region stromabwärts des CMV-Promotors auf der DNA-Vorlage, wenn er dem zuvor beschriebenen In-vitro-Assay hinzugefügt wird. Das resultierende RNA-Transkript kann...

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von aktivem Kernextrakt aus Larvenstadium 4 C. elegans und visualisierung der Transkriptionsaktivität in einem in vitro System.

Isolierung von aktivem Caenorhabditis elegans Kernextrakt und Rekonstitution für in vitro Transkription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Dieses Protokoll füllt eine technische Lücke für die biochemische Untersuchung von C.elegans und erweitert ihre Nützlichkeit als Modellorganismus. Diese Technik ist sowohl einfach als auch robust und ermöglicht eine konsistente Isolierung von funktionell aktivem C.elegans-Kernextrakt. Legen Sie zunächst die synchronisierten L1-Tiere auf 10 150-Millimeter-Nematoden-Wachstumsmedienplatten, die mit Escherichia coli OP50 ausgesät sind, und lassen Sie die Tiere 48 Stunden bei 20 Grad Celsius wachsen, bis sie das L4-Stadium erreichen.Sobald die hypotonen und hypertonen Puffer vorbereitet sind, reinigen Sie den Balch-Homogenisator, indem Sie die Mahlkammer mit 70% Ethanol überfluten. Dann spülen Sie die Kammer mit entionisiertem Wasser ab, um das überschüssige Ethanol zu entfernen. Setzen Sie die Hartmetallkugel in die Mahlkammer ein.Schließen Sie die Enden des Fasses des Balch Homogenisators ab und sichern Sie die Kappen mit den mitgelieferten Rändelschrauben. Bereiten Sie dann fünf Milliliter der vollständigen hypotonen und hypertonen Puffer pro Probe vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Als nächstes füllen Sie eine sterile Zwei-Milliliter-Spritze mit einem Milliliter vollständigem hypotonischen Puffer und spülen Sie vorsichtig die Mahlkammer des Balch-Homogenisators, wobei etwa 500 Mikroliter des vollständigen hypotonischen Puffers in der Kammer verbleiben.Bewahren Sie den gespülten Homogenisator auf Eis auf und lassen Sie ihn 30 Minuten abkühlen. Sammeln Sie die gut gefütterten L4-Tiere mit M9-Puffer in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Tiere drei Minuten lang bei 1.000 g. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Tierpellet weiter, bis der Überstand klar ist.Als nächstes waschen Sie die Tiere mit drei Millilitern kaltem hypotonen Puffer und zentrifugieren Sie erneut wie gezeigt. Nachdem Sie den überstehenden hypotonischen Puffer entfernt haben, fügen Sie dem Tierpellet einen Milliliter vollständigen hypotonischen Puffer hinzu und übertragen Sie die Tierische Suspension auf eine neue sterile Zwei-Milliliter-Spritze. Um die auf Eis gehaltenen Tiere zu homogenisieren, schieben Sie die Tiere vorsichtig durch die Mahlkammer des mit der Wolframkugel beladenen Balch-Homogenisators.Sammeln Sie dann die Tiere wieder in der Spritze und wiederholen Sie diesen Vorgang 30 Mal. Sammeln Sie nach 30 Homogenisierungszyklen die maximale Tiersuspension aus dem Balch-Homogenisator und lagern Sie die Spritze mit der Spitze nach unten in einem 1,7-Milliliter-Mikroröhrchen. Entfernen Sie die Wolframkugel und reinigen Sie die Mahlkammer mit entionisiertem Wasser.Trocknen Sie die Kugel und geben Sie sie in das jeweils beschriftete Rohr zurück. Setzen Sie dann die Wolframkugel mit einem Durchmesser von 7,9880 Millimetern und einem Spaltabstand von 12 Mikrometern in die Mahlkammer ein und verschließen Sie den Homogenisator erneut. Spülen Sie die Mahlkammer erneut mit einem Milliliter eiskaltem hypotonischem Puffer.Schleifen Sie die Suspension 25 Mal wie gezeigt. Geben Sie die Tierische Suspension in ein sauberes 1,7-Milliliter-Mikroröhrchen und lagern Sie die Suspension auf Eis. Pellet entlang der Tierkörper und Trümmer durch Zentrifugation.40 Mikroliter des Überstandes in ein als Eingangsfraktion bezeichnetes Röhrchen pipettieren und die Fraktion auf Eis speichern. Den verbleibenden Überstand in ein neues 1,7-Milliliter-Röhrchen überführen, ohne das Pellet zu stören, und die Kerne zentrifugieren. Dann übertragen Sie den Überstand, ohne die pelletierten Kerne zu stören, in ein neues 1,7-Milliliter-Röhrchen, das als zytosolische Fraktion gekennzeichnet ist.Um das Kernpellet zu waschen, fügen Sie dem Pellet 500 Mikroliter vollständigen hypotonischen Puffer hinzu, suspendieren Sie das Pellet und zentrifugieren Sie bei 4.000 mal g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Am Ende der Zentrifugation resuspendieren Sie das Kernpellet in 500 Mikrolitern frischem, vollständigem hypotonischen Puffer und zentrifugieren Sie die Probe erneut wie demonstriert. Dann lösen Sie das Pellet in 40 Mikrolitern vollständigem hypertonen Puffer auf.Übertragen Sie die Kernsuspension in ein neues 1,7-Milliliter-Rohr mit der Bezeichnung Kernfraktion und lagern Sie es auf Eis. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration von drei Fraktionen mit einem fluoreszierenden Quantifizierungskit. Aliquotieren Sie die Kernfraktionen in Einwegröhrchen, die sechs Mikrogramm des Kernproteins enthalten, und schockieren Sie im Trockeneis- und Ethanolbad.Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Das repräsentative Gelbild zeigt die Transkriptionsprodukte von Caenorhabditis elegans L4 Larven Kernextrakt unter Verwendung der CMV Promotor DNA Template. Die erfolgreiche Isolierung aktiver Kernproteine führte nach einer In-vitro-Transkription zu einer 132-Basenpaar-Bande, und eine erfolglose Isolierung führte zu einer schwachen Bande oder dem Fehlen einer Bande.Denken Sie daran, die vollständigen Puffer deutlich zu beschriften. Ungeeignete Puffer können die Funktionalität der Kernproteine beeinträchtigen. Halten Sie den Homogenisator auch eiskalt, um eine Denaturierung der Proteine zu verhindern.Die Entwicklung dieser Technik ermöglichte es den Forschern, die Rate der RNA-Transkription von C. elegans unter stressigen Bedingungen zu messen, was zeigt, dass sich die Transkriptionsrate des Tieres je nach Umweltbedingungen ändern kann.

isolation-active-caenorhabditis-elegans-nuclear-extract

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ein Protokoll für die Isolierung und Aktivierung von Spermatiden von...

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines synthetischen tRNA Substrat für...

In-vitro-tRNA Methylierungs-Assay mit der Entamoeba histolytica DNA und tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Microarray-Analyse wurde durchgeführt, um genetische Expression Profile in...

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur RNA / Protein-Interaktionen zu untersuchen. Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) auf der differentielle Migration RNA / Protein-Komplexe und freie RNA während nativer Gelelektrophorese. Durch Verwendung eines radioaktiv markierten RNA-Sonde kann RNA / Protein-Komplexe durch Autoradiographie visualisiert werden.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

Dieses Protokoll beschreibt die zelluläre Prozesse während der Zelle Schicksal Konvertierung in Caenorhabditis Elegans in-vivoStudie. Mit transgenen Tieren, so dass Hitzeschock Projektträger-gesteuerte Überexpression des Neuron Schicksal-induzierende Transkriptionsfaktors CHE-1 und RNAi-vermittelten Erschöpfung der Chromatin-regulierende Faktor LIN-53 Keimzelle zu Neuron Umprogrammierung kann beobachtet werden in Vivo.<br...

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Ein Tandem RNA Isolierung (Reise) für die Verwertung von endogen gebildeten mRNA-Protein-komplexe Vorgehensweise wird. Speziell, RNA-Protein-komplexe sind vernetzt in VivoPolyadenylated RNAs sind isoliert aus Extrakten mit oligo(dT) Perlen und besonderen mRNAs werden mit modifizierten RNA antisense Oligonukleotide erfasst. Proteine gebunden, mRNAs werden vom Immunoblot Analyse erkannt.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung von RNA, DNA und Proteine aus der gleichen Probe in einer Bemühung zu reduzieren Variation, Verbesserung der Reproduzierbarkeit und Interpretationen zu erleichtern.

Kombinierte Nukleotid- und Protein Extraktionen in Caenorhabditis elegans

Hier stellen wir ein Protokoll zur einfachen Isolierung bestimmter Gruppen lebender neuronaler Zellen vor, die grünes fluoreszierendes Protein aus transgenen Caenorhabditis elegans-Linien exdrücken. Diese Methode ermöglicht eine Vielzahl von Ex-vivo-Studien, die sich auf bestimmte Neuronen konzentrieren und hat die Fähigkeit, Zellen für eine weitere kurzfristige Kultivierung zu isolieren.

Isolierung spezifischer Neuronenpopulationen von Roundworm Caenorhabditis elegans

Diese Methode beschreibt ein Protokoll zur Herstellung von Proteinextrakten mit hohem Durchsatz aus Caenorhabditis elegans Proben und anschließender Co-Immunpräzipation.

Proteinextrakt-Präparation und Co-Immunpräzipitation von Caenorhabditis elegans

Hier wird eine Beschreibung der einfachen und relativ schnellen Isolierung der genomischen DNA von Caenorhabditis elegans aus einem oder wenigen Tieren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Gewebekits vorgestellt. Die resultierende gDNA-Präparation ist eine geeignete Vorlage für die PCR.

Kleine Extraktion von Caenorhabditis elegans Genomischer DNA

Das vorliegende Protokoll beschreibt Lipidergänzungsmethoden in Flüssig- und On-Plate-Kulturen für Caenorhabditis elegans, gekoppelt mit Längsschnittstudien und Gentranskriptionsanalysen von Massen oder einigen wenigen Würmern und Wurmgeweben.

Lipidsupplementierung für Langlebigkeit und Gentranskriptionsanalyse bei Caenorhabditis elegans

Lernen Sie die Isolierung funktionell aktiver C. elegans-Kernextrakte mit einem Balch-Homogenisator für in-vitro-Transkriptionsstudien. Diese robuste Methode ermöglicht die Visualisierung von Transkriptionsaktivität und erweitert die biochemische Nutzbarkeit des Modellorganismus.

Isolierung von aktivem Caenorhabditis elegans Kernextrakt und Rekonstitution für in vitro Transkription

Weitere Videos entdecken