Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, RNA-Protein-Wechselwirkungen aus Zellextrakten mit Hilfe eines elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassays zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Proteinextrakt aus Zellen oder Geweben in einem separaten Schritt hergestellt wird, eine genspezifische radiomarkierte RNA-Sonde synthetisiert und gereinigt wird. Der Proteinextrakt wird dann mit der markierten RNA-Sonde gemischt, um die Bildung spezifischer RNA-Proteinkomplexe zu ermöglichen.

Schließlich wird das Reaktionsprodukt auf ein nicht denaturierendes Polyacrylamid-Gel geladen und mittels elektrophoresefreier RNA-Sonde analysiert, die aufgrund ihrer schnelleren Mobilität von den RNA-Proteinkomplexen getrennt ist. Der elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assay wird häufig zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt. Wir konnten die Bindung der regulatorischen Eisenproteine IRP eins und IRP zwei an ihr Ziel-RNA-Element analysieren.

Die Methode kann aber auch für die Untersuchung anderer RNA-bindender Proteine angewendet werden. Der Nachweis dieses Verfahrens wird von Dr. Kain, philippinischer Forschungsmitarbeiter in meinem Labor, und von Dr. Nicole Wilkinson, einer Postdoktorandin für adhäsive Zellen, die in Schalen gezüchtet wurden, durchgeführt. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS, fügen Sie dann einen Milliliter eiskaltes PBS hinzu und ernten Sie die Zellen mit einem Kunststoff-Zellschaber. Übertragen Sie die lose Zellsuspension in ein frisches 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Legen Sie das Röhrchen in eine vorgekühlte Mikrozentrifuge mit vier Grad Celsius. Schleudern Sie fünf Minuten lang mit niedriger Geschwindigkeit herunter und saugen Sie das Futter an. Die Zellen erscheinen als weißes Kügelchen am Boden des Rohrs.

Für jeweils 10 Millionen geerntete Zellen fügen Sie 100 Mikroliter eiskalten zytoplasmatischen Lysepuffer hinzu. Lösen Sie das Zellpellet, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren und inkubieren Sie die Suspension dann 20 Minuten lang auf Eis. Dadurch wird die Zellmembran aufgelöst und alle zytosolischen Inhalte in den Puffer freigesetzt.

Um die lösliche zytosolische Fraktion zu isolieren, drehen Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit in einer Zentrifuge bei vier Grad Celsius nach unten, überführen Sie das geklärte Snat in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis und entsorgen Sie das Pellet. Bestimmen Sie als Nächstes die Gesamtproteinkonzentration des resultierenden zytoplasmatischen Extrakts mit dem Bradford-Assay. Aliquotieren Sie den resultierenden zytoplasmatischen Extrakt in kleinere Röhrchen und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius, bis er zur Herstellung von zytoplasmatischen Extrakten aus frischem Gewebe verwendet wird.

Beginnen Sie den Entnahmeprozess, indem Sie das eingeschläferte Tier auf ein sauberes Pad über ein Präparierbrett legen. Öffne den Bauch mit einer Schere. Entfernen Sie die Leber und die Milz mit einer Schere und Pinzette.

Spülen Sie jedes Gewebe in etwa 50 Milliliter eiskaltem PBS, um einen Gewebeabbau zu verhindern. Schneiden Sie das Taschentuch sofort und unverzüglich mit einem Skalpell in kleine Stücke von etwa einem bis zwei Kubikmillimetern. Legen Sie die Taschentücher in ein frisches Kryoröhrchen und schnappen Sie zu.

Frieren Sie eine Probe in flüssigem Stickstoff ein. Lagern Sie die gefrorenen Taschentücher bei minus 80 Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Beginnen Sie mit der Herstellung des zytoplasmatischen Extrakts, indem Sie die zuvor eingefrorene Gewebeprobe in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit flachem Boden mit 250 bis 500 Mikrolitern eiskaltem Lysepuffer überführen.

Setzen Sie eine Homogenisatorspitze in das Röhrchen ein und schalten Sie das Gerät bei mittlerer Leistung ein. Nach 10 Sekunden Homogenisierung stellen Sie das Röhrchen sofort für 20 Minuten auf Eis, um eine Denaturierung des Proteins zu verhindern. Um die zytosolische Fraktion zu isolieren, schleudert man das Röhrchen 10 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit in eine vier Grad Celsius heiße Zentrifuge, überführt den geklärten Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis und entsorgt das Pellet.

Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration des resultierenden zytoplasmatischen Extrakts mit dem Bradford-Assay. Aqua den resultierenden zytoplasmatischen Extrakt in kleinere Röhrchen füllen und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis er benötigt wird. Bevor Sie mit dem Protokoll fortfahren, richten Sie eine strahlensichere Werkbank mit einem Geigerzähler aus Plexiglas ein.

Führen Sie Zytometrie-Monitoretiketten an Laborkitteln und entsprechenden strahlenspezifischen Behältern für scharfe und scharfe Gegenstände und nicht scharfe Abfälle durch. Beginnend mit einem delinearisierten DNA-Plasmid, das ein kloniertes Eisenreaktionselement enthält. Als Matrize wird eine 20 Mikroliter große In-vitro-RNA-Transkriptionsreaktion eingerichtet, indem der Matrizenreaktionspuffer, die teilweise radioaktiven Nukleotide und die RNA-Polymerase mit einer Pipette bei Raumtemperatur gemischt werden.

Um die RNA-Synthese zu starten, inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 40 Grad Celsius. Beenden Sie die In-vitro-Transkriptionsreaktion durch Zugabe von einem Mikroliter 0,5 molar EDTA pH 8,0. Mischen Sie das EDTA ein, indem Sie es auf und ab pipettieren.

Verwenden Sie nun ein Standard-Alkoholfällungsprotokoll, um das RNA-Produkt zu reinigen. Zu Beginn fügen Sie 10 Mikroliter TRNA und 82,5 Mikroliter dreimolares Natriumacetat bei einem pH-Wert von 5,2 zu der Nachsynthesemischung und dem Vortex hinzu. Das Mischen der TRNA fungiert als Fällungsträger und erhöht die endgültige RNA-Ausbeute zur Ausfällung der RNA.

Fügen Sie 273 Mikroliter 95 bis 100% Ethanol hinzu und mischen Sie durch Vortexen. Lassen Sie die Fällungsreaktion ablaufen, indem Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem Tisch lassen, um die RNA zu isolieren, und drehen Sie das Röhrchen 10 Minuten lang in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur bei voller Geschwindigkeit nach unten. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und stören Sie das Pellet nicht.

Die gefällte RNA kann entweder als kleines weißes Kügelchen in der Nähe des Bodens des Röhrchens vorliegen oder für das bloße Auge unsichtbar sein. Waschen Sie das Pellet, indem Sie 100 bis 500 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzufügen. Die Probe wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei voller Geschwindigkeit heruntergeschleudert und dann die Schlinge mit dem Deckel dekantiert.

Öffnen Sie das RNA-Pellet, trocknen Sie es, indem Sie das Röhrchen 10 bis 15 Minuten lang offen auf der Bank liegen lassen. Rekonstituieren Sie die feste radioaktiv markierte RNA durch Zugabe von 100 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Quantifizieren Sie das Ausmaß des Einbaus radioaktiver Nukleotide, indem Sie die RNA-Lösung in ein flüssiges Counter Eloqua geben.

Die radioaktiv markierte RNA-Sonde in kleinere Röhrchen geben und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis sie benötigt wird. Gefrorene Aliquots können bis zu drei Wochen vor Beginn des elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assays verwendet werden. Bereiten Sie ein standardmäßiges 6%iges nicht denaturierendes Acrylamidgel mit einer Größe von mindestens 16 x 16 Zentimetern vor, um größere Probenvolumina pro Spur zu ermöglichen. Und um die mechanische Stabilität eines Gels dieser Größe zu verbessern.

Verwenden Sie Abstandshalter und Kämme aus Glas mit einer Dicke von mindestens einem Millimeter. Zu Beginn des elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assays tauen Sie das zuvor gefrorene zytoplasmatische Lysat und die radioaktiv markierten RNA-Sonden an den Augen für die Proteinkomponente des Experiments auf. Verdünnen Sie 25 Mikrogramm des zytoplasmatischen Extrakts mit dem zytoplasmatischen Lysepuffer auf ein endgültiges Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern.

Bei Bedarf füge der Mischung einen Mikroliter mit zwei Me-Stammlösungen hinzu und bewahre die Proteinprobe auf Eis auf. Für die RNA-Komponente verdünnen Sie die radioaktiv markierte RNA-Sonde in nukleasefreiem Wasser auf bis zu 200.000 Zähl pro Minute pro Mikroliter, erhitzen Sie die RNA eine Minute lang bei 95 Grad Celsius und kühlen Sie die Lösung mindestens fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ab. Um die Protein-RNA-Bindungsreaktion zu initiieren, fügen Sie dem Proteinextrakt einen Mikroliter einer radioaktiv markierten RNA-Sonde hinzu und lassen Sie die Bindung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stattfinden.

Um die Spezifität des elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassays zu erhöhen, fügen Sie der Reaktion einen Mikroliter Heparinstock hinzu. Wenn radioaktiv markierte RNA-Sonden länger als 60 Nukleotide sind, fügen Sie zusätzlich einen Mikroliter RNAs T one hinzu. Lassen Sie die Bindungsreaktion weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur weiterlaufen, um die Spezifität weiter zu erhöhen und eine bessere Trennung des RNA-Proteinkomplexes zu ermöglichen.

Fügen Sie drei Mikroliter Ladepuffer hinzu und pipettieren Sie zum Mischen auf und ab. Laden Sie dann die gesamte Reaktion auf das 6%ige Acrylamid-Gel und lassen Sie das Gel 60 Minuten lang mit fünf Volt pro Zentimeter laufen. Achten Sie darauf, das Gerät mit einem geeigneten Strahlenschutz abzudecken.

Zerlegen Sie das Gelgerät und geben Sie das Gel auf ein großes Filterpapier. Trocknen Sie das Gel mit einem Geltrocknungs-Vakuumgerät in einem dunklen Raum. Lege die Kombination aus Gel und Filterpapier auf ein Stück.

Film nach der Belichtung entwickeln und an der Luft trocknen. Die optimale Belichtungszeit kann von einer Stunde bis über Nacht variieren. Man kann die eisenabhängige Bindungskapazität von I RRP 1 und I RRP zwei an die radioaktiven IRE-Sonden in Gewebekulturzellen mit variablem Eisengehalt beurteilen.

So wird die IRE-Bindungsaktivität in eisenabgereicherten Zellen induziert, die zuvor mit dem K-späteren Deferoxamin behandelt wurden. Umgekehrt ist die IRE-Bindungsaktivität in eisenbeladenen Zellen, die zuvor mit Häman behandelt wurden, in eisenbeladenen Zellen unterdrückt. Die IRE-Bindungsaktivität von I RRP eins geht nach dem Assemblieren eines Eisen-Schwefel-Clusters verloren, während I RRP zwei einen eisenabhängigen Abbau erfährt.

Der Eisenzellcluster von IRP one kann durch die Behandlung von Zellextrakten mit 2%zwei me zerstört werden, was die Überwachung seiner ruhenden IRE-Bindungsaktivität ermöglicht. Die Aktivität von I RRP zwei wird nicht von zwei me wiederhergestellt. In diesem nächsten Experiment werden die IRE-Bindungsaktivitäten von I RRP 1 und IRP zwei in Abhängigkeit von der zellulären Eisenkonzentration im Kontext von frischem Lebergewebe von Wildtyp-I-RRP-Ein-Knockout- und I-RRP-Zwei-Knockout-Mäusen untersucht.

Hier zeigen die Daten, dass die Fütterung von Mäusen mit einer eisenreichen Ernährung, von der bekannt ist, dass sie die Eisenlast in der Leber erhöht, eine Verringerung der IRE-Bindungsaktivitäten von I RRP 1 und IRP zwei in Leberextrakten von Wildtyp-Mäusen fördert. I rrp zwei IRE-Komplexe werden durch das Vorhandensein von I RRP one verzerrt. Sie sind in Leberextrakten von I RRP one Knockout-Mäusen leicht sichtbar.

Hier führt die eisenreiche Ernährung zur vollständigen Inaktivierung von IRP zwei. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie RNA-Proteininteraktionen mit dem elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassay analysiert werden können. Denken Sie daran, dass die Qualität der RNA-Sonde entscheidend für den Erfolg ist.