Name: Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Lernen Sie die Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten der Maus. Diese Methode ermöglicht präzise morphologische Untersuchungen mit konfokaler Mikroskopie.

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Die Mikroskopie wurde am UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060) durchgeführt, teilweise unterstützt durch Mittel aus dem NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 und dem NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt. Die Bilder und Daten in Abbildung 4 werden mit Genehmigung des Herausgebers aus einer früheren Publikation 9 nachgedruckt.

<ol><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li>
<li>Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytogenesis%3A+where%2C+when%2C+and+how%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Astrocytogenesis: where, when, and how.</a> F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biology%22%5BJournal%5D)">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+individual+astrocytes+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy.</a> Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92(2020).</li>
<li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemico-genetic+discovery+of+astrocytic+control+of+inhibition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo.</a> Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).</li>
<li>Baldwin, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepaCAM+controls+astrocyte+self-organization+and+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling.</a> Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).</li>
<li>Amberg, N., Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+dissection+of+candidate+genes+in+mice+using+mosaic+analysis+with+double+markers%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100939(2021).</li>
<li>Dumas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+of+multiaddressable+genome-integrating+color+%28MAGIC%29+markers+to+individualize+cortical+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110(2020).</li>
<li>Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-glia+from+pallial+progenitors+produce+the+largest+clonal+clusters+of+the+brain%3A+time+frame+of+clonal+generation+in+cortex+and+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communication. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+states+of+astrocytes+during+sleep+and+wakefulness%3A+Is+norepinephrine+the+master+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Sleep+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator.</a> Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung im Mauskortex und beschreibt alle wichtigen Schritte, beginnend mit der Perfusion und endend mit der Bildanalyse. Dieses Protokoll erfordert Gehirne von Mäusen, die fluoreszierende Proteine in einer spärlichen oder mosaischen Population von Astrozyten exprimieren. Außerhalb dieser Anforderung können Mäuse jeden Alters für dieses Protokoll verwendet werden, wobei nur geringfügige Anpassungen an den Per...

Astrozyten sind aufwendig verzweigte Zellen, die viele wichtige Funktionen im Gehirn erfüllen1. In der Mausrinde entstehen radiale Gliastammzellen Astrozyten während der späten embryonalen und frühen postnatalen Stadien2. Während der ersten drei postnatalen Wochen wachsen Astrozyten an Größe und Komplexität und entwickeln Tausende von feinen Zweigen, die direkt mit Synapsen interagieren1. Gleichzeitig interagieren Astrozyten mit benachbarten Astrozyten, um diskrete, nicht überlappende Territorien zu schaffen, um das Gehirn zu kacheln3, während die Kommunikation über Gap-Junction-Kanäle4 aufrechterhalten wird. Astrozytenmorphologie und -organisation sind in vielen Krankheitszuständen nach Beleidigung oder Verletzunggestört 5, was auf die Bedeutung dieser Prozesse für die ordnungsgemäße Gehirnfunktion hinweist. Die Analyse der morphologischen Eigenschaften von Astrozyten während normaler Entwicklung, Alterung und Krankheit kann wertvolle Einblicke in die Biologie und Physiologie der Astrozyten liefern. Darüber hinaus ist die Analyse der Astrozytenmorphologie nach genetischer Manipulation ein wertvolles Werkzeug, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu erkennen, die die Etablierung und Aufrechterhaltung der morphologischen Komplexität der Astrozyten steuern.
Die Analyse der Astrozytenmorphologie im Gehirn der Maus wird sowohl durch die Komplexität der Astrozytenverzweigung als auch durch die Astrozytenkachelung erschwert. Die Antikörperfärbung unter Verwendung des intermediären Filament-Glia-Fibrillensäureproteins (GFAP) als astrozytenspezifischer Marker erfasst nur die Hauptzweige und unterschätzt die morphologische Komplexität der Astrozytenerheblich 1. Andere zellspezifische Marker wie Glutamattransporter 1 (GLT-1; slc1a2), Glutaminsynthetase oder S100β ermöglichen eine bessere Markierung von Astrozytenzweigen6, führen jedoch zu einem neuen Problem. Astrozyten-Territorien sind weitgehend nicht überlappend, aber ein kleiner Grad an Überlappung existiert an den peripheren Kanten. Aufgrund der Komplexität der Verzweigung, wenn benachbarte Astrozyten mit der gleichen Farbe beschriftet werden, ist es unmöglich zu unterscheiden, wo ein Astrozyt endet und der andere beginnt. Die spärliche oder mosaikartige Markierung von Astrozyten mit endogenen fluoreszierenden Proteinen löst beide Probleme: Der fluoreszierende Marker füllt die Zelle, um alle Zweige zu erfassen, und ermöglicht die Abbildung einzelner Astrozyten, die von ihren Nachbarn unterschieden werden können. Verschiedene Strategien wurden verwendet, um eine spärliche fluoreszierende Markierung von Astrozyten mit oder ohne genetische Manipulation zu erreichen, einschließlich viraler Injektion, Plasmidelektroporation oder transgener Mauslinien. Details zur Umsetzung dieser Strategien sind in bereits veröffentlichten Studien und Protokollen 1,7,8,9,10,11,12,13 beschrieben.
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Messung des Astrozytengebietsvolumens von Mäusegehirnen mit fluoreszierender Markierung in einer spärlichen Population von Astrozyten (Abbildung 1). Da der durchschnittliche Durchmesser eines Astrozyten im Mauskortex etwa 60 μm beträgt, werden 100 μm dicke Abschnitte verwendet, um die Effizienz bei der Erfassung einzelner Astrozyten in ihrer Gesamtheit zu verbessern. Eine Immunfärbung ist nicht erforderlich, wird jedoch empfohlen, um das endogene Fluoreszenzsignal für die konfokale Bildgebung und Analyse zu verstärken. Die Immunfärbung kann auch einen besseren Nachweis von feinen Astrozytenzweigen ermöglichen und die Photobleiche von endogenen Proteinen während der Bildaufnahme reduzieren. Um das Eindringen von Antikörpern in die dicken Abschnitte zu verbessern und das Gewebevolumen vom Schneiden durch Bildgebung zu erhalten, werden frei schwebende Gewebeabschnitte verwendet. Die Analyse des Astrozytengebietsvolumens wird mit handelsüblicher Bildanalysesoftware durchgeführt. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine Methode zur Analyse von Astrozytenkacheln in Gewebeabschnitten mit Mosaikmarkierung, bei der benachbarte Astrozyten unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen exprimieren. Dieses Protokoll wurde in mehreren neueren Studien 1,8,9 erfolgreich verwendet, um das Astrozytenwachstum während der normalen Gehirnentwicklung sowie die Auswirkungen der genetischen Manipulation auf die Astrozytenentwicklung zu charakterisieren.

<table><tbody><tr><td>#5 Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>1 mL TB</td><td>Spritze Becton Dickinson (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung)</td><td></td><td></td><td>30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl bis pH 7,4, dH2O bis 1 L; bei Raumtemperatur lagern (RT)</td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-106MP</td><td></td></tr><tr><td>1x TBS</td><td></td><td></td><td>100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; bei RT</td></tr><tr><td>1x TBS + Heparin</td><td></td><td></td><td>28,2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS lagern; bei 4 & Grad; C</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107MP</td><td></td></tr><tr><td>30 % Saccharose in TBS</td><td></td><td></td><td>15 g Saccharose, 1x TBS bis 50 mL; bei 4 μg lagern; C</td></tr><tr><td>4% PFA (Paraformaldehyd) in TBS</td><td></td><td></td><td>40 g PFA, 4-6 NaOH Pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O bis 1 L; lagern bei 4 &/deg; C</td></tr><tr><td>Avertin</td><td></td><td></td><td>0,3125 g Tri-Bromethanol, 0,625 mL Methylbutanol, dH2O bis 25 mL; lagern bei 4 μg; C; 2 Wochen nach der Herstellung verwerfen</td></tr><tr><td>Blockierungs- und Antikörperpuffer</td><td></td><td></td><td>10% Ziegenserum in TBST; lagern bei 4 & Grad; C</td></tr><tr><td>CD1 Mäuse</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Sammelfläschchen für Gehirne</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-20</td><td></td></tr><tr><td>Konfokale Erfassungssoftware</td><td>Olympus</td><td>FV31S-SW</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV3000RS</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>CryoStar NX50</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat Klinge</td><td>Thermo Scientific</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Einbettform</td><td>Polysciences</td><td>18646A-1</td><td></td></tr><tr><td>Gefriermedium</td><td></td><td></td><td>2:1 30% Saccharose:OCT; lagern bei RT</td></tr><tr><td>GFP Antikörper</td><td>Aves Labs</td><td>GFP1010</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Scientific</td><td>158920010</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Huhn 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Version 9.8.0</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metall Lunchdose</td><td>AQUARIUS</td><td>N/A</td><td>Von Amazon, "DIY Large Fun Box"</td></tr><tr><td>Methylbutanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierschere</td><td>Roboz</td><td>RS-5921</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 8,0, 90 % Glycerin, 0,5 % N-Propylgallat; Bei 4 & Grad lagern; C; haltbar bis zu 2 Monate</td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>N-Propylgallat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02370-100G</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Oil</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td>Speziell für Mikroskop/Objektiv</td></tr><tr><td>Operationsschere 6"</td><td>Roboz</td><td>RS-6820</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Plattform Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>88861043</td><td>Erforderliche Mindestdrehzahl: 25 U/min</td></tr><tr><td>Pinsel</td><td>Bogrinuo</td><td>N/A</td><td>Von Amazon, "Detail Pinsel - Miniaturbürsten "</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipette (5,75")</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipette (9")</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RFP Antikörper</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>Schnittmedium</td><td></td><td></td><td>1:1 Glycerin:1x TBS; lagern bei RT</td></tr><tr><td>Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchrloide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>TBST (TBS + Triton X-100)</td><td></td><td></td><td>0,2 % Triton in 1x TBS; bei RT</td></tr><tr><td>lagern Transferpipette</td><td>VWR</td><td>414004-002</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Bromethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td>Thermo Scientific</td><td>424570025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 ( </td><td>Fisher Scientific</td><td>50-489-120</td><td></td></tr><tr><td>XTSpotsConvexHull</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>custom XTension stellen als Ergänzungsmaterial zur Verfügung</td></tr></tbody></table>

analyse des astrozytengebietsvolumens und der kachelung in dicken frei schwebenden gewebeabschnitten

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

Astrozyten besitzen einen erstaunlichen Grad an morphologischer Komplexität, der es ihnen ermöglicht, mit fast jeder Art von Zelle und Struktur im Gehirn zu interagieren. Durch diese Wechselwirkungen regulieren Astrozyten aktiv viele kritische Gehirnfunktionen, einschließlich Synapsenbildung, Neurotransmission und Ionenhomöostase. Im Nagetiergehirn wachsen Astrozyten in den ersten drei postnatalen Wochen an Größe und Komplexität und bilden verschiedene, nicht überlappende Gebiete, um das Gehirn zu kacheln. Dieses Protokoll bietet eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung unter Verwendung von frei schwebenden Gewebeschnitten aus dem Mäusegehirn. Zunächst beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur Gewebeentnahme, Kryosektion und Immunfärbung von frei schwebenden Gewebeschnitten. Zweitens beschreibt dieses Protokoll die Bildaufnahme und Analyse des Astrozytengebietsvolumens und des Gebietsüberlappungsvolumens unter Verwendung kommerziell verfügbarer Bildanalysesoftware. Schließlich diskutiert dieses Manuskript die Vorteile, wichtige Überlegungen, häufige Fallstricke und Einschränkungen dieser Methoden. Dieses Protokoll erfordert Hirngewebe mit spärlicher oder mosaikfluoreszierender Markierung von Astrozyten und ist für die Verwendung mit gängigen Laborgeräten, konfokaler Mikroskopie und kommerziell erhältlicher Bildanalysesoftware konzipiert.

Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über die wichtigsten Schritte und den Workflow für dieses Protokoll. Abbildung 2 zeigt Screenshots der wichtigsten Schritte mit der Bildanalysesoftware zum Generieren einer Oberfläche, zum Generieren von Punkten in der Nähe der Oberfläche und zum Generieren einer konvexen Hülle. Abbildung 3 zeigt die Anwendung dieser Technik zur Bestimmung der Überlappung/Kachelung des Astrozytengebiet...

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum Schneiden, Färben und Abbilden von frei schwebenden Gewebeabschnitten des Mäusegehirns, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Überlappung oder Kachelung des Astrozytenterritoriums.

Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

Zu verstehen, wie sich Astrozyten entwickeln und ihre komplexe Morphologie etablieren, ist wichtig, um zu verstehen, wie sich das Gehirn entwickelt und funktioniert. Dieses Protokoll beschreibt, wie Schlüsselaspekte der Astrozytenmorphologie im Hirngewebe analysiert werden können. Dieses Protokoll verwendet einen benutzerdefinierten Code, um das Volumen des Astrozytenterritoriums in dicken Gewebeabschnitten zu messen.Diese Strategie kann auch angewendet werden, um die Menge der Gebietsüberlappung zwischen benachbarten Astrozyten zu messen. Durch die Kombination dieses Protokolls mit der genetischen Manipulation von Astrozyten können Forscher die Rolle spezifischer Proteine und Signalwege bei der Astrozytenentwicklung und der Astrozyten-Astrozyten-Interaktion direkt untersuchen Um zunächst eine frische TBST-Lösung vorzubereiten, indem sie 1 Milliliter 10% Triton X in eine 50-Milliliter-Tube geben und die Röhre auf 50 Milliliter mit TBS füllen. Bereiten Sie 2 Milliliter Blockierungs- und Antikörperlösungen für jedes Gehirn vor, indem Sie Ziegenserum und TBST in einem 15-Milliliter-Röhrchen.Als nächstes beschriften Sie eine 24-Well-Platte, um verschiedene Proben in verschiedenen Zeilen in verschiedenen Lösungen in verschiedenen Spalten zu platzieren, fügen Sie dann einen Milliliter TBST zu den ersten drei Spalten hinzu, die als wash 1, wash 2 und wash 3 gekennzeichnet sind, und fügen Sie 1 Milliliter Blocklösung zur vierten Spalte hinzu. Bereiten Sie einen Glaspickel vor, indem Sie das Ende einer 5,75-Zoll-Pasteur-Pipette mit einem Bunsenbrenner in einen kleinen Haken schmelzen, dann Gewebeabschnitte von der 12-Well-Platte in die Waschspalte 1 der 24-Well-Platte mit dem Pick-Plate übertragen und dann die Abschnitte jeweils 10 Minuten lang in Waschen 1, 2 waschen. und 3 Vertiefungen durch Verwendung des Glaspickels, um die Abschnitte von einem Brunnen zum nächsten zu übertragen, gefolgt von der Inkubation der Abschnitte für eine Stunde in der Blockierlösung. Bereiten Sie q Milliliter primäre Antikörperlösung vor, indem Sie den Antikörper in die Antikörperlösung geben, dann kurz vortexen und zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei mehr als oder gleich 4.000 mal g bei 4 Grad Celsius.Als nächstes inkubieren Sie die Abschnitte im primären Antikörper für 2 bis 3 Nächte bei 4 Grad Celsius während des Schüttelns. Nach der primären Antikörperinkubation saugen Sie die Day-1-TBST aus den Waschbrunnen ab, fügen dann 1 Milliliter neue TBST zu jeder Waschmulde hinzu und bewegen Sie die Abschnitte in die erste Waschquelle. Als nächstes inkubieren Sie Abschnitte im sekundären Antikörper für 3 Stunden bei Raumtemperatur.Nach der sekundären Antikörperinkubation saugen Sie die Day-2-TBST aus den Waschbrunnen ab, fügen dann 1 Milliliter neue TBST zu jeder Waschmulde hinzu und bewegen Sie die Abschnitte in die erste Waschquelle. Nehmen Sie während der letzten Wäsche das Trägermedium von 4 Grad Celsius heraus und lassen Sie es auf Raumtemperatur erwärmen, bereiten Sie dann eine 2-zu-1-Mischung aus TBS und deionisiertem Wasser vor und geben Sie es in eine Petrischale. Als nächstes bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie 800 Mikroliter 2-zu-1-Mischung aus TBS und deionisiertem Wasser auf die Oberfläche geben.Übertragen Sie die Abschnitte aus dem Waschbrunnen 3 in die Petrischale, dann mit einem feinen Pinsel, geben Sie die Abschnitte einzeln von der Petrischale in die Flüssigkeit auf dem Objektträger. Als nächstes ordnen Sie die Abschnitte sorgfältig an, so dass sie mit dem Pinsel flach auf dem Dia liegen. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit aus dem Objektträger mit einer P-1000-Pipette, gefolgt von einer Vakuumabsaugung.Sobald die gesamte überschüssige Flüssigkeit aus dem Objektträger entfernt wurde, verwenden Sie eine Transferpipette, um sofort 1 Tropfen Montagemedien zu jedem Abschnitt hinzuzufügen, und legen Sie vorsichtig einen Deckzettel über den Objektträger. Lassen Sie das Montagemedium einige Minuten ausbreiten und entfernen Sie dann alle überschüssigen Montagemedien, die unter dem Deckglas durch Vakuumabsaugung herauskommen. Danach verschließen Sie alle vier Kanten des Deckschliffs mit klarem Nagellack.Lassen Sie die Dias 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie sie dann flach bei 4 Grad Celsius. Lokalisieren Sie mit einem 10-fachen Objektiv einzelne Zellen für die Bildgebung und notieren Sie die spezifische Gehirnregion oder Subregion, die für das Experiment relevant ist, und bestimmen Sie dann mit dem Fokusknopf, ob der gesamte Astrozyt in dem Schnitt enthalten ist. Wechseln Sie anschließend zu einem Ölobjektiv mit höherer Vergrößerung und bringen Sie die Zelle in den Fokus.Während Sie durch das Okular schauen, verwenden Sie den Fokusknopf, um sich von oben nach unten in der Zelle zu bewegen, und inspizieren Sie dann die Zelle visuell, um sicherzustellen, dass die gesamte Zelle im Abschnitt enthalten ist. Passen Sie mit der mit den konfokalen Mikroskopen verbundenen Erfassungssoftware die Erfassungsparameter an, um ein angemessenes Signal-Rausch-Verhältnis und einen angemessenen Detaillierungsgrad zu erhalten, und verwenden Sie dann den 2-fachen Zoom für ein 40-faches Objektiv und keinen Zoom, wenn Sie ein 60-faches oder ein 63-faches Objektiv verwenden. Stellen Sie die oberen und unteren Grenzen des Z-Stacks mit einer Schrittgröße von 0,5 Mikrometern ein, um sicherzustellen, dass der gesamte Astrozyt mit dem ersten und letzten Bild ohne fluoreszierende Markierung der Zelle erfasst wird.Bevor Sie mit der Analyse beginnen, installieren Sie die konvexe Rumpferweiterungsdatei XtspotsConvexHull, indem Sie die Datei in den rtmatlab-Unterordner des XT-Ordners einfügen. Konvertieren Sie mit dem Imaris File Converter Bilder in das IMS-Format. Öffnen Sie als Nächstes eine Bilddatei in der Bildanalysesoftware und wählen Sie die Schaltfläche 3D-Ansicht, um das Bild im 3D-Modus anzuzeigen und sicherzustellen, dass die Zelle die Einschlusskriterien erfüllt.Um eine Fläche zu erstellen, klicken Sie auf das blaue Symbol Neue Flächen hinzufügen, und erstellen Sie dann einen Bereich von Interesse um die Zelle, indem Sie Bemaßungen in die Felder unter Größe des Flächenerstellungswerkzeugs eingeben oder die Kanten des gelben Felds ziehen. Passen Sie als Nächstes die absolute Schwellenwertintensität an, indem Sie den gelben Balken ziehen oder Werte in das Feld eingeben, sodass die graue Oberfläche so viel wie möglich vom Zellsignal ausfüllt, ohne die Grenze der Zelle zu überschreiten. Klicken Sie anschließend auf den grünen Pfeil, um die Generierung der Oberfläche abzuschließen.Überprüfen Sie die neu generierte Oberfläche sorgfältig und löschen Sie alle Oberflächenteile, die nicht Teil der Zelle sind, indem Sie sie auswählen und dann auf das Werkzeug Bleistiftbearbeitung und anschließend auf die Option Löschen klicken. Um die verbleibenden Oberflächenteile zu vereinheitlichen, klicken Sie auf das Symbol Trichterfilter, um alle auszuwählen, klicken Sie dann auf das Symbol Bleistiftbearbeitung und wählen Sie die Option Unify. Klicken Sie auf das orangefarbene Symbol Neue Spots hinzufügen und wählen Sie den richtigen Quellkanal aus der Dropdown-Liste aus, und geben Sie dann einen geschätzten XY-Durchmesserwert von 0,400 Mikrometern in das Feld ein.Klicken Sie anschließend auf den grünen Pfeil, um die Erstellung der Spots abzuschließen, und wählen Sie die Spots dann erneut aus. Klicken Sie auf das Symbol Filter, und wählen Sie in der Dropdown-Liste die Option Kürzeste Entfernung zu Flächen Flächen X aus, wobei Flächen X die zu analysierende Fläche ist, um sicherzustellen, dass sowohl der untere als auch der obere Schwellenwert grün sind. Geben Sie als Nächstes einen Mindestabstand von minus 1,0 Mikrometer in das untere Schwellenwertfeld und einen maximalen Abstand von 0,1 Mikrometern in das obere Schwellenwertfeld ein und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Abschnitt zu neuen Spots duplizieren, um sicherzustellen, dass die neu erstellten Spots im oberen linken Bereich des Softwarefensters ausgewählt werden.Klicken Sie anschließend auf das Gear Tools-Symbol und dann nur einmal auf das Convex Hull-Plugin und warten Sie, bis das MATLAB-Fenster angezeigt wird und dann verschwindet, was zu einem soliden Rumpf in der 3D-Ansicht führt. Stellen Sie im oberen linken Bereich sicher, dass Konvexer Rumpf von Spots X Auswahl, Kürzeste Entfernung, wobei Spots X Auswahl die neu erstellten Spots ist, ausgewählt ist, und klicken Sie dann auf den Rumpf, um ihn auszuwählen. Klicken Sie anschließend auf das Symbol Graph Statistics.Stellen Sie auf der Registerkarte Auswahl sicher, dass Bestimmte Werte aus der oberen Dropdown-Liste ausgewählt ist, und wählen Sie dann Volumen aus der unteren Dropdown-Liste aus, zeichnen Sie dann das Volumen des Rumpfes auf und speichern Sie die Datei, um mit dem nächsten Bild fortzufahren. Das Volumen des Astrozytenterritoriums wurde in Astrozyten gemessen, die ein membrangerichtetes rotfluoreszierendes Protein exprimieren. Der Knockdown des mit Astrozyten angereicherten Zelladhäsionsmoleküls hepaCAM reduziert das Volumen des Astrozytenterritoriums signifikant.Die Mosaikanalyse mit Doppelmarkern wurde verwendet, um Mäuse zu erzeugen, bei denen Wildtyp-Astrozyten ein rot fluoreszierendes Protein und HepaCam-Knockout-Astrozyten ein grün fluoreszierendes Protein exprimieren. Der Prozentsatz der Gebietsüberlappung zwischen benachbarten rot- und grün fluoreszierenden Proteinastrozytenpaaren wurde berechnet. Die Mäuse mit genetischer Modifikation von hepaCAM und grünen Astrozyten zeigten einen signifikant erhöhten Prozentsatz des Gebietsüberlappungsvolumens mit ihren roten Wildtypnachbarn im Vergleich zu reinen Wildtyp-Astrozytenpaaren.Dieses Ergebnis zeigt, dass hepaCAM für normales Astrozytengebietsvolumen und Astrozytenkachelung erforderlich ist. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Zelle die Einschlusskriterien erfüllt. Eine unvollständige Zelle hat ein kleineres Gebietsvolumen und kann Ihre Gesamtergebnisse und Schlussfolgerungen beeinflussen.

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Research

Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Immunfärbung eines fixierten Maushirngewebeschnitts mit fluoreszenzmarkierten Astrozyten unter Verwendung von Primär- und Sekundärantikörpern und die Aufnahme der Bilder der gefärbten Astrozyten durch konfokale Mikroskopie.

Immunfärbung von fluoreszenzmarkierten Astrozyten in einem Schnitt aus einem Gewebeschnitt aus dem Gehirn einer Maus

Quelle: Moye, S. L., et.al.  Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Hilfe der luzifergelben Iontophorese. J. Vis. Exp. (2019).  Dieses Video zeigt die Verwendung der Fluoreszenzfarbstoff-Iontophorese zur Untersuchung der Astrozytenmorphologie in fixierten Hirnschnitten. Es beschreibt das Durchstechen des Astrozyten-Somas mit einer Elektrode, um einen anionischen, hydrophilen Farbstoff unter einem Niederspannungsstrom in das Zytoplasma zu bringen, so dass der Farbstoff das Soma und die...

Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffs Iontophorese in einem fixierten Maushirnschnitt

Dreidimensionale Bildgebung von immunmarkierten Astrozyten mittels konfokaler Mikroskopie

Astrozyten im ZNS verändern ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften als Reaktion auf schädliche Reize. Dieser Bericht stellt ein Protokoll zur Beurteilung der dreidimensionalen Astrozytenmorphologie bei Erkrankungen oder nach therapeutischen Eingriffen vor.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Organisation der astrocytic Netzwerke zu beurteilen. Das beschriebene Verfahren minimiert Vorspannung um beschreibende Maßnahmen dieser Netze z. B. Zellzahl, Größe, Umgebung und Position innerhalb eines Kerns zu bieten. Anisotropie ist mit einer vektoriellen Analyse bewertet.

Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten

Die beschriebene Pipeline ist für die Segmentierung von Elektronenmikroskopie-Datensätzen größer als Gigabyte konzipiert, um Ganzzellmorphologien zu extrahieren. Sobald die Zellen in 3D rekonstruiert sind, kann kundenspezifische Software, die auf individuelle Bedürfnisse zugeschnitten ist, verwendet werden, um eine qualitative und quantitative Analyse direkt in 3D durchzuführen, auch mit virtueller Realität, um Die Sichtokklusion zu überwinden.

Eine Methode zur 3D-Rekonstruktion und Virtual Reality-Analyse von Glia- und Neuronalzellen

Astrozyten sind morphologisch komplexe Zellen, die durch ihre vielfältigen Prozesse und buschigen Territorien veranschaulicht werden. Um ihre aufwendige Morphologie zu analysieren, präsentieren wir ein zuverlässiges Protokoll, um intrazelluläre Luzifer gelbe Iontophorese in leicht fixiertem Gewebe durchzuführen.

Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Luzifer gelben Iontophorese

Hier beschreiben wir eine In-vitro-Live-Imaging-Methode zur Visualisierung des intrazellulären Transports von Organellen und des Handels mit Plasmamembranproteinen in murinen Astrozyten. Dieses Protokoll stellt auch eine Bildanalysemethodik zur Bestimmung von Frachttransportrouten und Kinetik dar.

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Astrozyten kacheln die Großhirnrinde gleichmäßig, was die Analyse ihrer komplexen Morphologie auf zellulärer Ebene schwierig macht. Das hier bereitgestellte Protokoll verwendet eine mehrfarbige Etikettierung basierend auf der in utero Elektroporation, um kortikale Astrozyten herauszuarbeiten und deren Volumen und Morphologie mit einer benutzerfreundlichen Bildanalyse-Pipeline zu analysieren.

In Utero Elektroporation von Multiadressierbaren Genom-integrierenden Farbe (MAGIC) Marker zur Individualisierung kortikaler Maus-Astrozyten

Die Kombination von viraler Vektortransduktion und Gehirn-Clearing mit der CLARITY-Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung einer großen Anzahl von Neuronen und Astrozyten.

Untersuchung der räumlichen Interaktion zwischen Astrozyten und Neuronen in geräumten Gehirnen

Lernen Sie die Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten der Maus. Diese Methode ermöglicht präzise morphologische Untersuchungen mit konfokaler Mikroskopie.

Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten

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