Name: Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Lernen Sie die dreidimensionale konfokale Morphometrie von Astrozyten für Neurowissenschaften. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Analyse zellularer Architekturparameter in pathologischen Zuständen.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH) eingestellt Politik von Ethic Ausschuss der Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran) zugelassen wurde. 1. Tiere, Chirurgie und Probenvorbereitungen HINWEIS: Bereiten Hirngewebe für 3D-konfokale mikroskopische Analyse. <ol><li> Divide Tiere zufällig in zwei Gruppen: 1-40 -Injektion (n = 8) und 1-40 -Injektion mit Genistein Behandlung (n = 8); verabreichen Genistein (10 mg / kg in einem Vehikel verdünnt wie polyethoxyliertes Rizinusöl) per Schlundsonde 1 Stunde vor der Operation. </li><li> Betäuben die Tiere mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch einen Mangel an Ziehreflex nach dem Einklemmen des Zehe. Verwenden Salbe auf die Augen während der Operation bis zur Trockenheit zu verhindern. </li><li> Zeigen Tiere in stereotaktischen Apparat und rasieren Kopf. Bewerben iodine Lösung, um die Kopfhaut vor dem Schnitt säubern und zu halten, das den Betrieb vor Ort sterile während der Operation, um das Infektionsrisiko zu verringern. Injizieren 1-40 stereotaktisch (4 ul) im Hippocampus bei -3,5 mm hinter Bregma, ± 2 mm lateral zur Mittellinie, und -2,8 mm unterhalb dura nach Rattenhirnatlas 8. Für stereotaktischen Verfahren finden Sie in früheren Veröffentlichung 9. </li><li> Geben Sie postoperative Beobachtungs / Pflege, bis die Tiere bei vollem Bewusstsein, um den Komfort der Tiere zu gewährleisten. Halten Sie die Tiere warmen während der Wiederherstellung, und schützen Sie sie vor einem Käfig mit anderen Tieren zurück, bis vollständige Genesung. Achten Sie auf Anzeichen von Infektionen bei den Tieren nach der Operation. </li><li> Betäuben die Tiere tief von Ketamin (150 mg / kg) drei Wochen nach der Operation. Führen transkardialer Fixierung durch Perfusion die Tiere mit 0,9% Kochsalzlösung, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (pH = 7,4), dann entfernen und zu beheben Gehirn wie in 10 beschrieben &lt;/ sup&gt;. </li><li> Post-fix die Gehirne in 4% Paraformaldehyd für 2-3 Tage bei 4 ° C. </li><li> Betten Sie das Gewebe in Paraffinblöcke durch die Verwendung von Gewebeeinbettungstechnik und vermeiden Unterfüllung oder Überfüllung der Kassette, da es mit der richtigen Ausrichtung oder Schnitte stören. Achten Sie auf die Ausrichtung des Gewebes in der Paraffinblock. HINWEIS: Die Ratte Hippocampus, zum Beispiel, ist in der Nähe von hinteren Teil der Hirnhemisphäre. Somit sollte das Gewebe in einer Art und Weise eingebettet werden, dass Schneiden beginnt am hinteren Teil des Gehirns. Verwenden Sie die Paxinos atlas 8 als Führung, um den gewünschten anatomischen Struktur zu erreichen. </li><li> Legen Sie das Mikrotom von Zugluft oder Türöffnungen, da Luftbewegungen machen die Handhabung der Teile schwierig. </li><li> Verwenden Abschnitte mit einer Dicke ≥20 um, wie diese Tiefe mit notwendig sein, Z-Stapel-Bilder von kompletten Astrozyten produzieren. Verwenden Sie nicht die ersten paar Abschnitte, da sie unerwünschte Dicke haben können, aufgrund der thermischen eXpansion. </li><li> Legen Sie die Teile auf der Oberfläche mit warmem Wasser (5 ± 2 C unterhalb der Schmelztemperatur für Paraffin) gerade lang genug, um die Abschnitte zu glätten. HINWEIS: Überexpansion des Profils kann die Morphologie der Struktur stören. Verwenden Sie kleine Pinsel, um vorsichtig zu übertragen Abschnitten. Sammeln Sie zwei vor drei Abschnitten auf jeder Folie. </li><li> Shop Dias in einem Rack in einer aufrechten Position und lassen Sie sie für mehrere Stunden oder O / N trocken bei 37 ° C. </li></ol> 2. Immunhistochemie <ol><li> Entparaffinieren Abschnitte in Xylol, 2 x 10 min, und rehydratisieren durch Alkohol-Gradienten (99,8%, 95% und 70%, jeweils 10 min) und PBS. </li><li> Inkubieren mit Antikörpern gegen saures Gliafaserprotein (GFAP), verdünnt 1: 1500 in PBS, das 0,25% Rinderserumalbumin (BSA), 0,25% Triton X-100 und 3,5% normales Serum (O / N bei 4 ° C). </li><li> Waschen Schnitte in PBS für 3 x 5 min. </li><li> Inkubieren mit sekundärem alkalische Phosphatase konjugierten antibodies für 1 h (1: 100, 21 C, verdünnt in PBS). </li><li> Für 3 x 5 min Waschen Sie die Schnitte in PBS. HINWEIS: Es ist wichtig, um die Abschnitte richtig waschen, nachdem Sekundärantikörper, um Hintergrundfärbung zu minimieren. </li><li> Abschnitte in Dunkelheit inkubieren mit Liquid Permanent Red Chromogen (15-20 min). Hinweis: Bereiten Sie die Lösung nicht mehr als 30 Minuten vor dem Gebrauch. </li><li> Waschen Schnitte in PBS für 3 x 5 min. </li><li> Schließlich färben die Kerne mit 4-6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1: 500, verdünnt in PBS) vor der Deckung Rutsch. Speichern Sie die Folien im Kühlschrank 24-48 h vor der Mikroskopie. </li></ol> 3. konfokale Mikroskopie HINWEIS: Zur quantitativen Auswertung (siehe unten), wählen Sie eine Astrozyten mit einem deutlich sichtbaren DAPI-gefärbten Zellkern mit einem Minimum von überlappenden Ästen, um das Fehlerrisiko zu verringern. Herstellung von Z-Bilder Stapeln ist zeitaufwendig. Seien Sie geduldig und nicht während der Verarbeitung zu stoppen. Upright konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ist used, um 3D-Bilder von Astrozyten zu erstellen. <ol><li> Setzen Sie den Schieber auf der Mikroskop-Bühne, und wählen Sie das 63X Ziel. </li><li> Öffnen Sie die Imaging-Software und klicken Sie auf Start-System. Klicken Sie auf die Registerkarte Suchen. Zum Ordnen und wählen GFP, um die richtige Licht einzustellen. </li><li> Öffnen Sie den Auslöser, um Licht zu reflektieren. Finden Sie den Reflektor Revolver auf der rechten Seite der Shutter und wählen Sie die Farbe, die von Astrozyten (grün, rot oder violett) widerspiegeln sollte; rote Farbe (FSet20 wf) wurde verwendet. HINWEIS: Vergessen Sie nicht, um das Bild direkt in das Okular des Mikroskops zu konzentrieren. </li><li> Um den besten Fokus zu finden, klicken Sie auf alle geschlossen, legte das Mikroskop Stift im Bildmodus, und klicken Sie auf die Registerkarte Acquisition. </li><li> Klicken Sie auf Smart Setup im Register Acquisition; öffnet sich ein Fenster. Wählen Sie die richtige Fluorophors (dh DAPI und Alexa Fluor 555, im aktuellen Projekt) aus der Liste. Die Farbe wird automatisch ausgewählt. </li><li> Klicken Sie auf das beste Signal und Übernehmen, und klicken Sie auf Set Exposure; der Computer wird dann automatisch die Belichtungsparameter eingestellt. </li><li> Zur Optimierung der Bild, gehen Sie zum Fenster Kanäle. Unmark Track2, markieren Track1 und klicken Sie auf Live. Stellen Sie das Bild, wenn nötig. </li><li> Im Fenster Kanäle passen Sie die folgenden Tasten; klicken Sie 1AU automatisch optimieren die Lochkamera. Es ist sehr wichtig, diesen Schritt sonst die konfokale Bilder werden nicht optimalen tun. Verstärkung anpassen um das beste Intensität (halten Sie diese Einstellung unter 800, um zusätzliche Rauschen zu verringern) zu haben. Schließlich, stellen Sie die digitale Verstärkung zwischen 2 und 3. </li><li> Unmark Track1, klicken Sie auf Track2 und wiederholen Sie Schritt 3.8 für Track2. Dann hör Live. </li><li> Zum Erfassungsmodus-Fenster. Verbessern Sie das Image durch die Optimierung der Bildgröße und Mittelung. Um das zu ändern Frame-Größe auf X * Y und wählen 1.024 x 1.024. Wählen Sie eine langsame Geschwindigkeit, um ein besseres Bild zu erzeugen. </li><li> Zum Mittelwertbildung und wählen Sie eine Anzahl ≥4. Diese Mittelung Wert gibt die Anzahl der Scans, die gemittelt werden, um produc werdene die erfasste Bild. Klicken Sie nun auf den Druckknopf, und speichern Sie die aufgenommenen Bildes 2D. </li><li> Für 3D-Bildgebung, markieren Sie die Z-Stapel Element unter Smart Setup wodurch die Z-Stapel-Fenster zu öffnen. </li><li> Setzen die ersten und letzten Positionen für die Z-Stapel, dh die Tiefe der Zelle ist. Klicken Sie zunächst auf Live. Dann nutzen Sie den Fokustrieb des Mikroskops auf die oberste Position der Astrozyten im Gewebe, wobei die Z-Stapel ist zu Beginn zu konzentrieren. Klicken Sie auf Set Erste. Dann konzentriert bis zur untersten Position der Astrozyten im Gewebe, in dem Z-Stapel Abtastung gestoppt werden soll. Klicken Sie auf Set Last. Dann hör Live. </li><li> Wählen Sie das Intervall; 1,01 &amp; mgr; m in der vorliegenden Studie verwendet wird; Wahl-Intervall kann durch Klicken auf Optimal, um die Anzahl der Schichten eingestellt erfolgen. </li><li> Klicken Sie auf Start Experiment. Speichern Sie die Bilder, sobald die Überprüfung abgeschlossen ist. Oberfläche und Volumen der Astrozyten Gebiet der gesamte Astrozyten einschließlich BH: Dieses Bild wird für die Messung der folgenden Parameter verwendet werdennches, Zellkörper und Kern. </li><li> Erwerben Sie ein 2D-Bild mit einem 10X oder 20X Ziel wie in den Schritten 3,6-3,11 beschrieben. Dieses Bild kann für die Messung der Intensität der Fluoreszenz Immunreaktivität des Antikörper und Astrozyten Dichte (Anzahl / 1000 um 2) verwendet werden. </li></ol> 4. Astrocyte Dichte und GFAP + Fluoreszenzintensität <ol><li> Öffnen Sie das 20X 2D-Bild. Klicken Sie auf Histo (Hisogram) auf der linken Seite des Bildfensters. </li><li> Um Astrozyten Dichte zu berechnen, wählen Sie drei aufeinander folgenden Gesichtsfelder unter 20x-Objektiv. Zählen Sie die Anzahl der Astrozyten, die eine klare soma aufweisen mit einem Minimum an, sich überlappenden Niederlassungen in den Feldern. </li><li> Um Fluoreszenzintensität zu quantifizieren, wählen Sie ein geeignetes Werkzeug (Rechteck oder Kreis) in der Fußzeile der Bildfenster, und wählen Sie einen Bereich für die Messung. Beachten Sie, der Mittelwert und Standardabweichung automatisch unter dem Bild erscheinen. In der aktuellen Studie, ein 0,7 mm 2 rechteckigen Bereich zwischen striatum und mediale Klinge Gyrus dentatus wurde verwendet. </li></ol> 5. Astrocyte Branchen <ol><li> Um die Länge und die Gesamtzahl der Filialen zu quantifizieren, verwenden Sie 3D-Bilder (mit 20X erworben) in der Bildanalysesoftware. Zeichnen Sie eine Linie von Hand entlang der Länge jedes Zweiges des ausgewählten Astrozyten. Wählen Sie dann den Mess-Tool, das zur Messung von Leitungslängen spezialisiert ist. Um die Zahl der Filialen zu quantifizieren, wählen Sie den Count-Werkzeug, um die Anzahl der markierten Objekte zu zählen. </li></ol> 6. Volumen und Oberfläche HINWEIS: Markieren einer Struktur manuell in 3D-Bildanalyse-Software erfordert Fokus und Ausbildung. Üben Sie mehrmals, bevor ein Experiment. <ol><li> Um das Volumen und Oberfläche des Astrozyten-Zellkern, soma, Zellkörper und Territorium zu quantifizieren, übertragen Sie die 3D-Bilder (in Schritten von 3,1 bis 3,16 erworben) zu einem 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity 6.1. </li><li> Öffnen Sie die Software und erstellen Sie eine neueBibliothek. Ziehen Sie alle Bilder auf der linken grauen Spalte in der neuen Bibliothek. Dann wählen Sie eine 3D-Bild. Auf der rechten Seite gibt es unterschiedliche Kanäle mit unterschiedlichen Farben. Schalten Sie einen Kanal von Interesse; beispielsweise die Blaukanal für DAPI bei der Messung der Zellkern. Ändern Sie die Helligkeit manuell, um einen optimalen Kontrast zu erhalten. </li><li> Wählen Sie das Menü Extras finden Sie auf Volume Stellen und erzeugen ein einziges 3D-Bild von Z-Stapel-Bildern. Klicken Sie auf Eigenschaften in dem Menü Bearbeiten und stellen Sie sicher, dass X, Y und Z-Eigenschaften werden vorgestellt; sonst ist es unmöglich durchzuführen 3D-Analyse. </li><li> Klicken Sie auf das Freihand-RIO-Werkzeug-Symbol in der Symbolleiste. Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Zellkern zu messen ziehen Sie eine Linie um den DAPI-markierten Zellkern. </li><li> Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Zellkörper zu messen, ziehen Sie eine Linie um den Soma ohne Filialen. </li><li> Um das Volumen und Oberfläche der gesamten Astrozyten (Zellkörper einschließlich Zweigniederlassungen) messen, ziehen Sie eine Linie um den Soma nach demFläche aller Branchen. </li><li> Um das Volumen und Oberfläche der Astrozyten-Gebiet zu bewerten ziehen Sie eine Linie zwischen den Spitzen der Zweige. HINWEIS: Drücken Sie Entf auf der Tastatur, um unerwünschte Zeichnungen zu löschen. </li><li> Klicken Sie auf die Messungen-Menü am oberen Rand des Bildfensters, um ein Messprotokoll zu erstellen; ein Fenster mit verschiedenen Werkzeugen geöffnet. </li><li> Ziehen Sie die Objekte finden, um oben im Fenster (Fensterbereich). Geben Sie einen aussagekräftigen Namen für die Bevölkerung ein, wählen Sie die zugehörigen Farbe, und klicken Sie auf Messen. Ein weiteres Fenster öffnet sich. </li><li> Wählen Sie einen Parameter, dh, das Volumen oder Fläche. Klicken Sie auf OK. Die Daten werden in einer Tabelle angezeigt. </li><li> Um die Daten klicken Sie auf das Menü Messung zu speichern und wählen Machen Mess Artikel. </li><li> Wählen Sie einen neuen Messpunkt aus dem geöffneten Fenster aufgerufen. Dann geben Sie einen Namen ein, um die Daten und klicken Sie auf OK. </li><li> Schließlich exportieren Sie die Daten der Statistik-Software wie Graph Pad oder Excel-Programm. Verwenden Sie t-Test, um die Daten zu analysieren, dann zeichnen 2D grAPHS. </li></ol>

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</ol>

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem County Council von Östergötland, (Schweden) und der Cellular and Molecular Research Center an der Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran) unterstützt.

In der aktuellen Protokoll beschäftigten wir 3D-konfokale Morphometrie zu 12 verschiedene Parameter, die mit Astrozytenmorphologie verbunden waren zu bewerten. Hierzu Hippocampusgewebe von Ratten mit 1-40 - induziert wurden Astrogliose, mit oder ohne Vorbehandlung Genistein als entzündungshemmendes Mittel verwendet. Durch Verwendung von 3D-Bildern und morphometrische Software, waren wir in der Lage, die Wirkung von Genistein auf Astrogliose dh der Morphologie von Astrozyten zeigen. <p class="jove...

Bei gesunden zentralen Nervensystems (ZNS), spielen Astrozyten eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutflusses, Energiestoffwechsel, synaptische Funktion und Plastizität und extrazellulären Ionen und Neurotransmitter Homöostase 1-3. Darüber hinaus Astrozyten reagieren auf verschiedene schädliche Reize und anormale Zustände wie Trauma, Infektion, Ischämie oder Neurodegeneration über reaktive Astrogliose die durch Hypertrophie, Proliferation und funktionellen Umgestaltung Astrozyten 4,5 gekennzeichnet ist. Reaktiv Astrogliose kann die Entzündungsreaktion und Reparaturprozesses in der Gewebezüchtung, und daher kann das klinische Ergebnis therapeutischer Maßnahmen beeinflussen. Dementsprechend Astrozyten Aufmerksamkeit von Neuro in den letzten Jahrzehnten als potentielle Ziele für therapeutische Interventionen für eine Vielzahl von Erkrankungen des ZNS erhalten. Astrozyten haben normalerweise eine Sternform mit gut defined Zweige, die rund um den Soma 6 zu verbreiten. In einem erkrankten Zustand, in dem Gehirn, Astrozyten Verzweigungen verworren und zeigen gequollenen Enden 7, beispielsweise in Gegenwart von Amyloid-beta (Aß). Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Analyse von 3D-Bildern von Astrozyten durch konfokale Mikroskopie erworben. Zwölf verschiedene quantitative Parameter für jeden Astrozyten wurden gemessen: die Flächen und Volumina der Astrozyten-Gebiet (die durch einen überdachten Astrozyten Gewebe), gesamte Zelle (einschließlich Zweigniederlassungen), Zellkörper und Kern; die Gesamtlänge und die Zahl der Filialen; die Fluoreszenzintensität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet; und die Dichte der Astrozyten (Anzahl / 1.000 &amp; mgr; m 2). Zu diesem Zweck verwendeten wir Gehirnschnitten von Ratten, um die Injektion von 1-40 mit oder ohne Genistein Behandlung eines entzündungshemmenden Substanz intrahippocampal belichtet. Das beschriebene Protokoll kann für eine morphometrische verwendet werdenalysis verschiedener Zelltypen in vitro oder in vivo in verschiedenen Bedingungen.

<table><tbody><tr><td>Amyloid beta 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>Halten in -70 &deg; C</td></tr><tr><td>Genistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>halten in -20 &deg; C</td></tr><tr><td>polykolonale Kaninchen-Antikörper gegen saures Gliafibrilläres Protein</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>alkalisches phosphatkonjugiertes Schwein Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Permanent Chromogen</td><td>DAKO</td><td>K0640</td> Flüssiger permanenter roter Substratpuffer DAKO K0640 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cremophor EL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27963</td><td>Polyethoxyliertes Rizinusöl - Schritt 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bildanalyse 2000</td><td>Tekno Optic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streotaxic Apparatus</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graph Pad Prism 5</td><td>Graph Pad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische analyse der astrozyten

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Gliazellen im Gehirn haben Astrozyten diverse funktionelle Rolle im zentralen Nervensystem. In Gegenwart von schädlichen Stimuli, Astrozyten ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften, eine so genannte reaktive Astrogliose modifizieren. Hier wird ein Protokoll für die Beurteilung der morphologischen Eigenschaften der Astrozyten wird vorgestellt. Dieses Protokoll umfasst die Quantifizierung der 12 verschiedene Parameter, dh die Fläche und das Volumen der von einem Astrozyten (Astrozyten Gebiet) abgedeckt Gewebe, das gesamte Astrozyten einschließlich Filialen, Zellkörper und Kern sowie Gesamtlänge und die Anzahl der Filialen, die Intensität Fluoreszenz Immunreaktivität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet, und Astrozyten Dichte (Anzahl / 1000 um 2). Hierzu dreidimensionale (3D) konfokale mikroskopische Bilder wurden erzeugt und 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity 6.3 wurde für die Messungen verwendet. Rattenhirngewebe, um Beta-Amyloid 1-40 ausgesetzt </sub&gt; (1-40) mit oder ohne einen therapeutischen Eingriff verwendet wurde, um das Verfahren darzustellen. Dieses Protokoll kann auch für 3D morphometrische Analyse anderer Zellen entweder in vivo oder in vitro-Bedingungen verwendet werden.

Dieser Abschnitt enthält einige Beispiele für die qualitative und quantitative Beobachtungen 3D morphometrische Analyse hergestellt. Die vollständigen Ergebnisse aller 12 zuvor genannten Parameter finden Sie in unserer früheren Veröffentlichung 10. Qualitative Beobachtungen Astrozyten zeigten dünne oder dicke Äste, die in der Regel in 1-40 injizierten Ratten (Abbildung 1) lang waren. Einige kleine sternförmigen Astrozyten mi...

Astrozyten im ZNS verändern ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften als Reaktion auf schädliche Reize. Dieser Bericht stellt ein Protokoll zur Beurteilung der dreidimensionalen Astrozytenmorphologie bei Erkrankungen oder nach therapeutischen Eingriffen vor.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Astrozytenmorphologie durch die Analyse dreidimensionaler Bilder von Astrozyten zu beurteilen, die mittels konfokaler Mikroskopie gewonnen wurden. Diese Methode kann verwendet werden, um morphologische Veränderungen zu bewerten, die in verschiedenen Zelltypen auftreten können, entweder unter pathologischen Bedingungen oder als Folge einer interventionsbasierten Strategie. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass viele mit der zellulären Architektur assoziierte Parameter gleichzeitig untersucht werden können.Dr. Mariam Bodel wird dieses Verfahren demonstrieren. Nach der Vorbereitung der Objektträger für die immunhistochemische Färbung werden die Paraffinschnitte zweimal für jeweils 10 Minuten in Xylol getaucht, um sie zu entparaffinisieren. Inkubieren Sie die Objektträger zur Rehydratation der Schnitte nach dem Waschen jeweils 10 Minuten in 99,8 %, 95 % und 70 % Ethanol. Inkubieren Sie die Objektträger anschließend über Nacht bei vier Grad Celsius in einer 1:1500-Verdünnung einer primären Antikörperlösung gegen das gliale fibrilläre saure Protein (GFAP).Nach der Inkubation die Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen. Anschließend die Objektträger eine Stunde bei Raumtemperatur mit einer 1:100 verdünnten alkalischen Phosphatase-konjugierten Sekundärantikörper-Lösung inkubieren. Danach die Schnitte erneut dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen, weniger als 30 Minuten vor der Verwendung.Geben Sie einen Tropfen rote Chromogenlösung zu drei Millilitern Substratpuffer. Inkubieren Sie jeden Objektträger in 100 Mikrolitern dieser Lösung 15 bis 20 Minuten im Dunkeln. Anschließend waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS.Schließlich färben Sie die Kerne mit DPI, das im Verhältnis 1:500 in PBS verdünnt wurde. Geben Sie ein bis zwei Tropfen Antifa-Medium auf den Schnitt und verschließen Sie diesen sofort mit einem Deckglas. Inkubieren Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden vor der Mikroskopie, um eine vollständige Versiegelung sicherzustellen.Um die konfokale Mikroskopie zu beginnen, platzieren Sie eine Probe auf dem Mikroskoptisch und wählen Sie das 63x-Objektiv aus. Nachdem Sie die Aufnahmesoftware geöffnet haben, klicken Sie im Aufnahmetab auf „Smart Setup“ und wählen die geeignete Fluorophore aus. Hier werden DAPI und Alexa Fluor 555 verwendet.Klicken Sie anschließend auf „best signal“ und danach auf „apply“. Klicken Sie dann auf „set exposure“, damit der Computer die optimalen Belichtungsparameter bestimmt. Um das Bild zu optimieren, öffnen Sie das Fenster „channels“ und schalten Sie das Bild auf „live“. Passen Sie gegebenenfalls den Fokus an.Klicken Sie dann auf eine Au, um die Lochblende zu optimieren, und stellen Sie die Verstärkung für die beste Intensität ein. Stellen Sie abschließend die digitale Verstärkung zwischen zwei und drei ein. Beenden Sie nach dieser Optimierung das Live-Bild und öffnen Sie das Fenster für den Aufnahmemodus.Passen Sie die Bildgröße an, indem Sie auf X mal Y klicken und 10 24 mal 10 24 auswählen. Wählen Sie außerdem eine langsame Geschwindigkeit. Öffnen Sie als Nächstes die Mittelwertbildung und wählen Sie eine Zahl größer oder gleich vier.Klicken Sie dann auf die Aufnahmetaste und speichern Sie das erfasste 2D-Bild. Um die 3D-Bildgebung einzurichten, öffnen Sie die Registerkarte „Smart Setup“ und aktivieren Sie den Eintrag „ZS-Stack“, wodurch das Fenster für den ZS-Stack geöffnet wird. Um die erste und letzte Position für den Zack festzulegen, klicken Sie erneut auf „Live“ und justieren Sie den Fokus auf die oberste Position des Astrozyten.Klicken Sie zuerst auf „Erster festlegen“. Stellen Sie nun den Fokus auf die tiefste Position des Astrozyten ein und klicken Sie auf „Letzter festlegen“, dann beenden Sie die Live-Ansicht. Wählen Sie anschließend das Intervall, indem Sie auf „Optimal“ klicken.Um die Anzahl der Schnitte festzulegen, beträgt das Intervall 1,01 Mikrometer. Klicken Sie abschließend auf „Start“, „Experiment“ und speichern Sie die Bilder, sobald der Scan abgeschlossen ist. Erstellen Sie außerdem ein 2D-Bild mit einem 10×- oder 20×-Objektiv.Wählen Sie für die Messung der Fluoreszenzintensität im Bildfenster das Rechteck- oder Kreiswerkzeug aus und markieren Sie einen Bereich zur Messung, um Volumen und Oberfläche des Zellkörpers des Astrozytenkerns sowie des Territoriums zu quantifizieren. Übertragen Sie die 3D-Bilder in ein geeignetes Analyse-Softwareprogramm, beispielsweise Velocity 6.1 in der Analyse-Software. Erstellen Sie eine neue Bibliothek und ziehen Sie alle Bilder in die linke graue Spalte.Wählen Sie ein 3D-Bild aus und schalten Sie einen der erfassten Kanäle von Interesse ein, beispielsweise dapi. Für nukleare Messungen passen Sie manuell die Helligkeit an, um den Kontrast zu optimieren. Wählen Sie nun das Werkzeuge-Menü aus.Wählen Sie „Volumen erstellen“ und erzeugen Sie ein einzelnes 3D-Bild aus den Zack-Bildern. Öffnen Sie das Bearbeitungsmenü und klicken Sie auf Eigenschaften. Stellen Sie sicher, dass die X-, Y- und Z-Eigenschaften angezeigt werden.Danach wählen Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug (ROI) aus der Symbolleiste aus. Zeichnen Sie mit dem ausgewählten Werkzeug eine Linie um den mit DPI markierten Zellkern, um Volumen und Oberfläche des Astrozytenkerns zu messen. Verwenden Sie erneut das Freihand-Auswahlwerkzeug, um Volumen und Oberfläche des gesamten Astrozyten zu bestimmen, indem Sie eine Linie um das Soma ziehen, die dem Verlauf aller Fortsätze folgt.Klicken Sie auf das Messmenü oben im Bildfenster, ziehen Sie „Objekte finden“ an die Oberseite des Fensters und vergeben Sie einen beschreibenden Namen für Population eins, wählen Sie die zugehörige Farbe aus und klicken Sie auf „Messen“, wodurch ein neues Fenster geöffnet wird. Wählen Sie in diesem neuen Fenster entweder „Volumen“ oder „Oberfläche“ als Parameter aus und klicken Sie auf „OK“.Um die Daten zu speichern, klicken Sie auf das Messmenü und wählen Sie „Messwert erfassen“. Wählen Sie einen neuen Messwert aus dem Fenster aus. Geben Sie einen Dateinamen für die Daten ein und klicken Sie auf „OK“.Schließlich exportieren Sie die Messdaten in ein geeignetes Softwarepaket, um eine statistische Analyse durchzuführen und Datenplots zu erstellen. Hier verglichen die Forscher Astrozyten in fixiertem Hirngewebe von Ratten, die entweder mit Amyloid-Beta eins 40 oder mit Amyloid-Beta eins 40 und Ian behandelt worden waren. Die Injektion der Amyloid-Proteine führte zu Astrozyten mit dickeren und längeren Fortsätzen.Diese Astrozyten aus Ian-behandelten Tieren wiesen eine sternförmige Gestalt mit kurzen und dünnen Fortsätzen auf. Ian-behandelte Ratten zeigten außerdem eine verminderte GFAP-positive Fluoreszenz der Astrozyten in den Gehirnschnitten. Die morphometrische Analyse spezifischer Astrozytenvolumina ergab, dass das Volumen des Astrozytenkerns, des Zellkörpers, der gesamten Astrozyte sowie des Astrozyten-Territoriums nach Ian-Behandlung im Vergleich zur alleinigen Amyloid-Behandlung vermindert war.Nachdem dieses Bild beherrscht ist, kann die Analysetechnik pro Zelle innerhalb weniger Minuten abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Struktur mit hoher Präzision zu markieren. Es ist ratsam, das manuelle Markieren der Struktur von Interesse vor Beginn des Experiments nach dessen Entwicklung zu üben.Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Zellbiologie, Histologie und Pathologie, um die Struktur einer Zelle in gesundem oder krankem Zustand zu untersuchen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man 12 verschiedene Parameter für eine einzelne Zelle anhand von 3D-Bildern misst.

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir entwickelten eine Software-Plattform, Imaris Neuroscience, ImarisXT und MATLAB, um die Änderungen in der Morphologie einer undefinierten Form von dreidimensionalen konfokale Fluoreszenz einzelner Zellen aufgenommen zu messen verwendet. Dieser neuartige Ansatz kann verwendet werden, um Veränderungen in der Zellform nach Aktivierung des Rezeptors zu quantifizieren und stellt somit eine mögliche zusätzliches Werkzeug für die Wirkstoffforschung.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Immunfärbung eines fixierten Maushirngewebeschnitts mit fluoreszenzmarkierten Astrozyten unter Verwendung von Primär- und Sekundärantikörpern und die Aufnahme der Bilder der gefärbten Astrozyten durch konfokale Mikroskopie.

Immunfärbung von fluoreszenzmarkierten Astrozyten in einem Schnitt aus einem Gewebeschnitt aus dem Gehirn einer Maus

Quelle: Moye, S. L., et.al.  Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Hilfe der luzifergelben Iontophorese. J. Vis. Exp. (2019).  Dieses Video zeigt die Verwendung der Fluoreszenzfarbstoff-Iontophorese zur Untersuchung der Astrozytenmorphologie in fixierten Hirnschnitten. Es beschreibt das Durchstechen des Astrozyten-Somas mit einer Elektrode, um einen anionischen, hydrophilen Farbstoff unter einem Niederspannungsstrom in das Zytoplasma zu bringen, so dass der Farbstoff das Soma und die...

Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffs Iontophorese in einem fixierten Maushirnschnitt

Dreidimensionale Bildgebung von immunmarkierten Astrozyten mittels konfokaler Mikroskopie

Ein Weg, um neue Einblicke in die Komplexität des Gehirns Entzündungsreaktion gewinnen wird vorgestellt. Wir beschreiben Immunfluoreszenz-basierte Protokolle gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse, um die Muster der Co-Expression von Mikroglia / Makrophagen-Phänotyp-Marker in einem Mausmodell der fokalen Ischämie zu untersuchen.

Dreidimensionale konfokale Analyse der Mikroglia / Makrophagen-Marker der Polarisation in Experimental Brain Injury

Wir präsentieren die Entwicklung des selbst-zusammengebauten, dreidimensionale Bündel longitudinal ausgerichteten astrocytic Somata und Prozesse innerhalb ein neuartiges Biomaterial-Ummantelung. Diese "lebende Gerüste", präsentiert Mikron-Skala Durchmesser noch Zentimeter in der Länge, Verlängerung dienen als Testumgebungen zu Entwicklungsstörungen Mechanismen zu studieren oder zu erleichtern Neuroregeneration Regie neuronalen Migration und/oder axonalen entwickelt Pathfinding.

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Organisation der astrocytic Netzwerke zu beurteilen. Das beschriebene Verfahren minimiert Vorspannung um beschreibende Maßnahmen dieser Netze z. B. Zellzahl, Größe, Umgebung und Position innerhalb eines Kerns zu bieten. Anisotropie ist mit einer vektoriellen Analyse bewertet.

Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten

Die beschriebene Pipeline ist für die Segmentierung von Elektronenmikroskopie-Datensätzen größer als Gigabyte konzipiert, um Ganzzellmorphologien zu extrahieren. Sobald die Zellen in 3D rekonstruiert sind, kann kundenspezifische Software, die auf individuelle Bedürfnisse zugeschnitten ist, verwendet werden, um eine qualitative und quantitative Analyse direkt in 3D durchzuführen, auch mit virtueller Realität, um Die Sichtokklusion zu überwinden.

Eine Methode zur 3D-Rekonstruktion und Virtual Reality-Analyse von Glia- und Neuronalzellen

Astrozyten sind morphologisch komplexe Zellen, die durch ihre vielfältigen Prozesse und buschigen Territorien veranschaulicht werden. Um ihre aufwendige Morphologie zu analysieren, präsentieren wir ein zuverlässiges Protokoll, um intrazelluläre Luzifer gelbe Iontophorese in leicht fixiertem Gewebe durchzuführen.

Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Luzifer gelben Iontophorese

Die Kombination von viraler Vektortransduktion und Gehirn-Clearing mit der CLARITY-Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung einer großen Anzahl von Neuronen und Astrozyten.

Untersuchung der räumlichen Interaktion zwischen Astrozyten und Neuronen in geräumten Gehirnen

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum Schneiden, Färben und Abbilden von frei schwebenden Gewebeabschnitten des Mäusegehirns, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Überlappung oder Kachelung des Astrozytenterritoriums.

Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Kachelung in dicken frei schwebenden Gewebeabschnitten

Lernen Sie die dreidimensionale konfokale Morphometrie von Astrozyten für Neurowissenschaften. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Analyse zellularer Architekturparameter in pathologischen Zuständen.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

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