Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten
11. Dezember 2015
Astrozyten im ZNS verändern ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften als Reaktion auf schädliche Reize. Dieser Bericht stellt ein Protokoll zur Beurteilung der dreidimensionalen Astrozytenmorphologie bei Erkrankungen oder nach therapeutischen Eingriffen vor.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Morphologie der Astrozyten durch die Analyse dreidimensionaler Bilder von Astrozyten zu beurteilen, die mittels konfokaler Mikroskopie aufgenommen wurden. Diese Methode kann verwendet werden, um morphologische Veränderungen zu bewerten, die in verschiedenen Zelltypen auftreten können, entweder unter pathologischen Zuständen oder als Ergebnis einer Interventionsstrategie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass viele Parameter, die mit der zellulären Architektur verbunden sind, gleichzeitig untersucht werden können.
Dr. Mariam Bodel wird dieses Verfahren nach der Vorbereitung von Objektträgern für die immunhistochemische Färbung von Parize-Schnitten demonstrieren, indem sie diese zweimal für 10 Minuten in Xylol getaucht werden. Inkubieren Sie die Objektträger jeweils 10 Minuten lang in 99,8 %, 95 % und 70 % Ethanol, um die Abschnitte nach dem Waschen zu rehydrieren. PBS inkubieren die Objektträger in einer Verdünnung von einem bis 1500 Grad saurem Protein oder GFAP-Primärantikörperlösung bei vier Grad Celsius über Nacht.
Waschen Sie die Abschnitte nach der Inkubation in PB S3 einmal fünf Minuten lang. Dann inkubieren Sie die Objektträger mit einer konjugierten Sekundärantikörperlösung von ein bis 100 alkalischen Phosphatase für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Sektion in PB S3 erneut fünf Minuten lang, weniger als 30 Minuten vor der Anwendung.
Geben Sie einen Tropfen rote Chromogenlösung in drei Milliliter Substratpuffer. Inkubieren Sie jeden Objektträger in 100 Mikrolitern dieser Lösung für 15 bis 20 Minuten im Dunkeln. Waschen Sie dann die Objektträger in PB S3 mal für fünf Minuten.
Zum Schluss färben Sie die Zellkerne mit DPI, verdünnt um eins auf 500 in PBS. Tragen Sie ein bis zwei Tropfen Antifa-Medium auf die Stelle auf und verschließen Sie sie sofort mit einem Deckglas. Inkubieren Sie die Objektträger vor der Mikroskopie 24 bis 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius, um die Versiegelung sicherzustellen.
Um mit der konfokalen Mikroskopie zu beginnen, legen Sie einen Objektträger auf den Mikroskoptisch und wählen Sie das 63-fach-Objektiv aus. Nachdem Sie die Erfassungssoftware geöffnet haben, klicken Sie auf der Registerkarte "Erfassung" auf "Intelligentes Setup" und wählen Sie die richtige Viereretage aus. Hier kommen dappy und Alexa, Etage 5 55 zum Einsatz.
Klicken Sie anschließend auf das beste Signal, gefolgt von Übernehmen. Klicken Sie dann auf Belichtung einstellen, damit der Computer die optimalen Belichtungsparameter bestimmen kann. Um das Bild zu optimieren, öffnen Sie das Kanalfenster und schalten Sie das Bild auf live. Passen Sie den Fokus bei Bedarf an.
Klicken Sie dann auf eine Au, um die Lochblende zu optimieren, und stellen Sie die Verstärkung für die beste Intensität ein. Stellen Sie abschließend die digitale Verstärkung zwischen zwei und drei ein. Stoppen Sie nach dieser Optimierung das Live-Bild und öffnen Sie das Fenster für den Aufnahmemodus.
Passen Sie die Rahmengröße an, indem Sie auf X x Y klicken und 10 24 x 10 24 auswählen. Wählen Sie auch eine langsame Geschwindigkeit. Öffnen Sie als Nächstes die Registerkarte Mittelwertbildung und wählen Sie eine Zahl größer oder gleich vier aus.
Klicken Sie dann auf die Snap-Schaltfläche und speichern Sie das aufgenommene 2D-Bild. Um die 3D-Bildgebung einzurichten, öffnen Sie die Registerkarte "Smart Setup" und markieren Sie das Element "ZS-Stapel", wodurch das Fenster "Zs-Stapel" geöffnet wird. Um die erste und letzte Position für den Zack festzulegen, klicken Sie erneut auf Live und stellen Sie den Fokus auf die oberste Position des Astrozyten ein.
Klicken Sie zuerst auf Setzen. Stellen Sie nun den Fokus auf die niedrigste Position des Astrozyten ein, klicken Sie auf Zuletzt einstellen und stoppen Sie dann die Live-Ansicht. Wählen Sie anschließend das Intervall aus, indem Sie auf optimal klicken.
Um hier die Anzahl der Scheiben einzustellen, beträgt das Intervall 1,01 Mikrometer. Klicken Sie abschließend auf Start, experimentieren Sie und speichern Sie die Bilder, sobald der Scan abgeschlossen ist. Erfassen Sie außerdem ein 2D-Bild mit einem 10-fach- oder 20-fach-Objektiv.
Wählen Sie für Messungen der Fluoreszenzintensität das Rechteck- oder Kreiswerkzeug im Bildfenster aus und markieren Sie einen Bereich für die Messung, um das Volumen und die Oberfläche des Astrozytenkerns, des Soma-Zellkörpers und des Territoriums zu quantifizieren. Übertragen Sie die 3D-Bilder in eine geeignete Analysesoftware, wie z.B. Velocity 6.1 in der Analysesoftware. Erstellen Sie eine neue Bibliothek und ziehen Sie alle Bilder in die linke graue Spalte.
Wählen Sie ein 3D-Bild aus und aktivieren Sie einen der erfassten Kanäle, z. B. dapi. Passen Sie bei nuklearen Messungen die Helligkeit manuell an, um den Kontrast zu optimieren. Wählen Sie nun das Menü Extras.
Wählen Sie "Volumen erstellen" und erstellen Sie ein einzelnes 3D-Bild aus den Zack-Bildern. Öffnen Sie das Bearbeitungsmenü und klicken Sie auf Eigenschaften. Stellen Sie sicher, dass die Eigenschaften X, Y und Z angezeigt werden.
Wählen Sie anschließend das Freihand-ROI-Werkzeug aus der Symbolleiste aus. Zeichnen Sie mit dem ausgewählten Werkzeug eine Linie um den DPI-markierten Kern, um das Volumen und die Oberfläche des Astrozytenkerns zu messen. Messen Sie auch hier mit dem Freihand-ROI-Tool das Volumen und die Oberfläche des gesamten Astrozyten, indem Sie eine Linie um das Soma zeichnen, die der Oberfläche aller Äste folgt.
Klicken Sie auf das Menü "Messungen" oben im Bildfenster, ziehen Sie Objekte an den oberen Rand des Fensters und geben Sie der Population einen aussagekräftigen Namen, wählen Sie die zugehörige Farbe aus und klicken Sie auf "Messen", um ein neues Fenster zu öffnen. In diesem neuen Fenster. Wählen Sie entweder Volumen oder Oberfläche als Parameter und klicken Sie auf OK.
Um die Daten zu speichern, klicken Sie auf das Messmenü und wählen Sie Messelement erstellen. Wählen Sie ein neues Messelement aus, das aus dem Fenster aufgerufen wird. Geben Sie einen Dateinamen für die Daten ein und klicken Sie auf OK.
Exportieren Sie schließlich die Messdaten in ein geeignetes Softwarepaket, um statistische Analysen durchzuführen und Datendiagramme zu erstellen. Hier verglichen die Forscher Astrozyten in fixiertem Hirngewebe von Ratten, die mit Amyloid beta one 40 oder mit Amyloid beta one 40 und Ian behandelt wurden. Die Injektion des Amyloid-Proteins führte zu Astrozyten mit dickeren und längeren Ästen.
Diese Astrozyten von mit Ian behandelten Tieren wiesen eine sternförmige Form mit kurzen und dünnen Ästen auf. Die mit Ian behandelten Ratten zeigten auch eine reduzierte GFAP-positive Fluoreszenz der Astrozyten in den Hirnschnitten. Die morphometrische Analyse spezifischer Astrozytenvolumina zeigte, dass das Volumen des Astrozytenkernkörpers, des gesamten Astrozyten und des Astrozytenterritoriums bei der Ian-Behandlung im Vergleich zur alleinigen Amyloid-Behandlung verringert war.
Sobald Sie dieses Bild beherrschen, kann die Analysetechnik in wenigen Minuten pro Zelle abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Struktur mit hoher Präzision zu markieren. Es ist am besten, das Markieren der interessierenden Struktur manuell zu üben, bevor Sie das Experiment nach seiner Entwicklung starten.
Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie, Histologie und Pathologie den Weg, um die Struktur einer Zelle in einem gesunden oder Krankheitsumfeld zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, 12 verschiedene Parameter für eine einzelne Zelle mit 3D-Bildern zu messen.
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Überblick
Dieser Bericht präsentiert ein Protokoll zur Bewertung der Astrozyten-Morphologie in drei Dimensionen unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie. Die Methode bewertet morphologische Veränderungen in Astrozyten unter pathologischen Bedingungen oder nach therapeutischen Interventionen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Pathologie
Hintergrund
- Astrozyten im ZNS zeigen Veränderungen als Reaktion auf schädliche Reize.
- Das Verständnis der Astrozyten-Morphologie ist entscheidend für die Untersuchung verschiedener neurologische Erkrankungen.
- Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Parameter der zellulären Architektur.
- Die konfokale Mikroskopie liefert hochauflösende dreidimensionale Bilder.
Zweck der Studie
- Bewertung der Astrozyten-Morphologie bei kranken Zuständen.
- Bewertung der Auswirkungen therapeutischer Interventionen auf die Astrozytenstruktur.
- Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls für die morphologische Analyse.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung von Objektträgern für immunhistochemische Färbung.
- Entparaffinierung von Schnitten mit Xylol.
- Rehydrierung der Schnitte durch gestufte Ethanollösungen.
- Inkubation mit GFAP-Primärantikörper zur Astrozyten-Identifikation.
Hauptergebnisse
- Demonstration morphologischer Veränderungen in Astrozyten.
- Identifizierung struktureller Veränderungen als Reaktion auf Interventionen.
- Validierung des Protokolls für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bewertet effektiv die Astrozyten-Morphologie.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Rolle der Astrozyten in der ZNS-Pathologie bei.
- Zukünftige Anwendungen können therapeutische Strategien für neurologische Erkrankungen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of astrocyte morphology enables mechanistic de-risking in neurodegenerative target validation by linking structural changes to therapeutic interventions. This 3D confocal morphometric approach supports predictive confidence in early discovery by providing multiparametric readouts that reflect pathway-specific glial responses. The method enhances translational continuity from in vitro or in vivo models to preclinical decision-making through standardized, reproducible imaging workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by quantifying astrocyte structural remodeling in response to amyloid beta and intervention strategies.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiparametric analysis of glial reactivity, reducing mechanistic ambiguity in CNS target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline and intervention-induced morphological phenotypes.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through quantitative 12-parameter morphometric outputs suitable for high-content screening adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by modeling reactive astrogliosis in amyloid-exposed rat brain tissue, aligning with translational biomarker pathways in neurodegeneration.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal tracking of astrocyte structural changes across treatment conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing quantitative glial morphology data that informs target selection and pathway de-risking.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through structural phenotyping of astrocytes in pathological and intervention contexts.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via standardized 3D imaging and multiparametric analysis.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including volume, surface area, branch length, number, fluorescence intensity, and density.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it via disease-relevant astrocyte reactivity modeling.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through standardized imaging and analysis protocols applicable across cell types and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy, immunohistochemical staining, and 3D image analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including confocal microscope with Z-stack capability and 3D analysis software such as Volocity.
- Cross-team standardization requirements for staining protocols, imaging parameters, and morphometric measurement consistency.
- Adaptation considerations across model systems including in vivo and in vitro astrocyte preparations from various species.
- Practical limitations supported by source material including the need for precise manual structure marking and optimization of imaging settings for signal-to-noise ratio.
