Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Morphologie der Astrozyten durch die Analyse dreidimensionaler Bilder von Astrozyten zu beurteilen, die mittels konfokaler Mikroskopie aufgenommen wurden. Diese Methode kann verwendet werden, um morphologische Veränderungen zu bewerten, die in verschiedenen Zelltypen auftreten können, entweder unter pathologischen Zuständen oder als Ergebnis einer Interventionsstrategie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass viele Parameter, die mit der zellulären Architektur verbunden sind, gleichzeitig untersucht werden können.

Dr. Mariam Bodel wird dieses Verfahren nach der Vorbereitung von Objektträgern für die immunhistochemische Färbung von Parize-Schnitten demonstrieren, indem sie diese zweimal für 10 Minuten in Xylol getaucht werden. Inkubieren Sie die Objektträger jeweils 10 Minuten lang in 99,8 %, 95 % und 70 % Ethanol, um die Abschnitte nach dem Waschen zu rehydrieren. PBS inkubieren die Objektträger in einer Verdünnung von einem bis 1500 Grad saurem Protein oder GFAP-Primärantikörperlösung bei vier Grad Celsius über Nacht.

Waschen Sie die Abschnitte nach der Inkubation in PB S3 einmal fünf Minuten lang. Dann inkubieren Sie die Objektträger mit einer konjugierten Sekundärantikörperlösung von ein bis 100 alkalischen Phosphatase für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Sektion in PB S3 erneut fünf Minuten lang, weniger als 30 Minuten vor der Anwendung.

Geben Sie einen Tropfen rote Chromogenlösung in drei Milliliter Substratpuffer. Inkubieren Sie jeden Objektträger in 100 Mikrolitern dieser Lösung für 15 bis 20 Minuten im Dunkeln. Waschen Sie dann die Objektträger in PB S3 mal für fünf Minuten.

Zum Schluss färben Sie die Zellkerne mit DPI, verdünnt um eins auf 500 in PBS. Tragen Sie ein bis zwei Tropfen Antifa-Medium auf die Stelle auf und verschließen Sie sie sofort mit einem Deckglas. Inkubieren Sie die Objektträger vor der Mikroskopie 24 bis 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius, um die Versiegelung sicherzustellen.

Um mit der konfokalen Mikroskopie zu beginnen, legen Sie einen Objektträger auf den Mikroskoptisch und wählen Sie das 63-fach-Objektiv aus. Nachdem Sie die Erfassungssoftware geöffnet haben, klicken Sie auf der Registerkarte "Erfassung" auf "Intelligentes Setup" und wählen Sie die richtige Viereretage aus. Hier kommen dappy und Alexa, Etage 5 55 zum Einsatz.

Klicken Sie anschließend auf das beste Signal, gefolgt von Übernehmen. Klicken Sie dann auf Belichtung einstellen, damit der Computer die optimalen Belichtungsparameter bestimmen kann. Um das Bild zu optimieren, öffnen Sie das Kanalfenster und schalten Sie das Bild auf live. Passen Sie den Fokus bei Bedarf an.

Klicken Sie dann auf eine Au, um die Lochblende zu optimieren, und stellen Sie die Verstärkung für die beste Intensität ein. Stellen Sie abschließend die digitale Verstärkung zwischen zwei und drei ein. Stoppen Sie nach dieser Optimierung das Live-Bild und öffnen Sie das Fenster für den Aufnahmemodus.

Passen Sie die Rahmengröße an, indem Sie auf X x Y klicken und 10 24 x 10 24 auswählen. Wählen Sie auch eine langsame Geschwindigkeit. Öffnen Sie als Nächstes die Registerkarte Mittelwertbildung und wählen Sie eine Zahl größer oder gleich vier aus.

Klicken Sie dann auf die Snap-Schaltfläche und speichern Sie das aufgenommene 2D-Bild. Um die 3D-Bildgebung einzurichten, öffnen Sie die Registerkarte "Smart Setup" und markieren Sie das Element "ZS-Stapel", wodurch das Fenster "Zs-Stapel" geöffnet wird. Um die erste und letzte Position für den Zack festzulegen, klicken Sie erneut auf Live und stellen Sie den Fokus auf die oberste Position des Astrozyten ein.

Klicken Sie zuerst auf Setzen. Stellen Sie nun den Fokus auf die niedrigste Position des Astrozyten ein, klicken Sie auf Zuletzt einstellen und stoppen Sie dann die Live-Ansicht. Wählen Sie anschließend das Intervall aus, indem Sie auf optimal klicken.

Um hier die Anzahl der Scheiben einzustellen, beträgt das Intervall 1,01 Mikrometer. Klicken Sie abschließend auf Start, experimentieren Sie und speichern Sie die Bilder, sobald der Scan abgeschlossen ist. Erfassen Sie außerdem ein 2D-Bild mit einem 10-fach- oder 20-fach-Objektiv.

Wählen Sie für Messungen der Fluoreszenzintensität das Rechteck- oder Kreiswerkzeug im Bildfenster aus und markieren Sie einen Bereich für die Messung, um das Volumen und die Oberfläche des Astrozytenkerns, des Soma-Zellkörpers und des Territoriums zu quantifizieren. Übertragen Sie die 3D-Bilder in eine geeignete Analysesoftware, wie z.B. Velocity 6.1 in der Analysesoftware. Erstellen Sie eine neue Bibliothek und ziehen Sie alle Bilder in die linke graue Spalte.

Wählen Sie ein 3D-Bild aus und aktivieren Sie einen der erfassten Kanäle, z. B. dapi. Passen Sie bei nuklearen Messungen die Helligkeit manuell an, um den Kontrast zu optimieren. Wählen Sie nun das Menü Extras.

Wählen Sie "Volumen erstellen" und erstellen Sie ein einzelnes 3D-Bild aus den Zack-Bildern. Öffnen Sie das Bearbeitungsmenü und klicken Sie auf Eigenschaften. Stellen Sie sicher, dass die Eigenschaften X, Y und Z angezeigt werden.

Wählen Sie anschließend das Freihand-ROI-Werkzeug aus der Symbolleiste aus. Zeichnen Sie mit dem ausgewählten Werkzeug eine Linie um den DPI-markierten Kern, um das Volumen und die Oberfläche des Astrozytenkerns zu messen. Messen Sie auch hier mit dem Freihand-ROI-Tool das Volumen und die Oberfläche des gesamten Astrozyten, indem Sie eine Linie um das Soma zeichnen, die der Oberfläche aller Äste folgt.

Klicken Sie auf das Menü "Messungen" oben im Bildfenster, ziehen Sie Objekte an den oberen Rand des Fensters und geben Sie der Population einen aussagekräftigen Namen, wählen Sie die zugehörige Farbe aus und klicken Sie auf "Messen", um ein neues Fenster zu öffnen. In diesem neuen Fenster. Wählen Sie entweder Volumen oder Oberfläche als Parameter und klicken Sie auf OK.

Um die Daten zu speichern, klicken Sie auf das Messmenü und wählen Sie Messelement erstellen. Wählen Sie ein neues Messelement aus, das aus dem Fenster aufgerufen wird. Geben Sie einen Dateinamen für die Daten ein und klicken Sie auf OK.

Exportieren Sie schließlich die Messdaten in ein geeignetes Softwarepaket, um statistische Analysen durchzuführen und Datendiagramme zu erstellen. Hier verglichen die Forscher Astrozyten in fixiertem Hirngewebe von Ratten, die mit Amyloid beta one 40 oder mit Amyloid beta one 40 und Ian behandelt wurden. Die Injektion des Amyloid-Proteins führte zu Astrozyten mit dickeren und längeren Ästen.

Diese Astrozyten von mit Ian behandelten Tieren wiesen eine sternförmige Form mit kurzen und dünnen Ästen auf. Die mit Ian behandelten Ratten zeigten auch eine reduzierte GFAP-positive Fluoreszenz der Astrozyten in den Hirnschnitten. Die morphometrische Analyse spezifischer Astrozytenvolumina zeigte, dass das Volumen des Astrozytenkernkörpers, des gesamten Astrozyten und des Astrozytenterritoriums bei der Ian-Behandlung im Vergleich zur alleinigen Amyloid-Behandlung verringert war.

Sobald Sie dieses Bild beherrschen, kann die Analysetechnik in wenigen Minuten pro Zelle abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Struktur mit hoher Präzision zu markieren. Es ist am besten, das Markieren der interessierenden Struktur manuell zu üben, bevor Sie das Experiment nach seiner Entwicklung starten.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie, Histologie und Pathologie den Weg, um die Struktur einer Zelle in einem gesunden oder Krankheitsumfeld zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, 12 verschiedene Parameter für eine einzelne Zelle mit 3D-Bildern zu messen.