Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten
11. Dezember 2015
Astrozyten im ZNS verändern ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften als Reaktion auf schädliche Reize. Dieser Bericht stellt ein Protokoll zur Beurteilung der dreidimensionalen Astrozytenmorphologie bei Erkrankungen oder nach therapeutischen Eingriffen vor.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Astrozytenmorphologie durch die Analyse dreidimensionaler Bilder von Astrozyten zu beurteilen, die mittels konfokaler Mikroskopie gewonnen wurden. Diese Methode kann verwendet werden, um morphologische Veränderungen zu bewerten, die in verschiedenen Zelltypen auftreten können, entweder unter pathologischen Bedingungen oder als Folge einer interventionsbasierten Strategie. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass viele mit der zellulären Architektur assoziierte Parameter gleichzeitig untersucht werden können.
Dr. Mariam Bodel wird dieses Verfahren demonstrieren. Nach der Vorbereitung der Objektträger für die immunhistochemische Färbung werden die Paraffinschnitte zweimal für jeweils 10 Minuten in Xylol getaucht, um sie zu entparaffinisieren. Inkubieren Sie die Objektträger zur Rehydratation der Schnitte nach dem Waschen jeweils 10 Minuten in 99,8 %, 95 % und 70 % Ethanol. Inkubieren Sie die Objektträger anschließend über Nacht bei vier Grad Celsius in einer 1:1500-Verdünnung einer primären Antikörperlösung gegen das gliale fibrilläre saure Protein (GFAP).
Nach der Inkubation die Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen. Anschließend die Objektträger eine Stunde bei Raumtemperatur mit einer 1:100 verdünnten alkalischen Phosphatase-konjugierten Sekundärantikörper-Lösung inkubieren. Danach die Schnitte erneut dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen, weniger als 30 Minuten vor der Verwendung.
Geben Sie einen Tropfen rote Chromogenlösung zu drei Millilitern Substratpuffer. Inkubieren Sie jeden Objektträger in 100 Mikrolitern dieser Lösung 15 bis 20 Minuten im Dunkeln. Anschließend waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS.
Schließlich färben Sie die Kerne mit DPI, das im Verhältnis 1:500 in PBS verdünnt wurde. Geben Sie ein bis zwei Tropfen Antifa-Medium auf den Schnitt und verschließen Sie diesen sofort mit einem Deckglas. Inkubieren Sie die Objektträger bei vier Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden vor der Mikroskopie, um eine vollständige Versiegelung sicherzustellen.
Um die konfokale Mikroskopie zu beginnen, platzieren Sie eine Probe auf dem Mikroskoptisch und wählen Sie das 63x-Objektiv aus. Nachdem Sie die Aufnahmesoftware geöffnet haben, klicken Sie im Aufnahmetab auf „Smart Setup“ und wählen die geeignete Fluorophore aus. Hier werden DAPI und Alexa Fluor 555 verwendet.
Klicken Sie anschließend auf „best signal“ und danach auf „apply“. Klicken Sie dann auf „set exposure“, damit der Computer die optimalen Belichtungsparameter bestimmt. Um das Bild zu optimieren, öffnen Sie das Fenster „channels“ und schalten Sie das Bild auf „live“. Passen Sie gegebenenfalls den Fokus an.
Klicken Sie dann auf eine Au, um die Lochblende zu optimieren, und stellen Sie die Verstärkung für die beste Intensität ein. Stellen Sie abschließend die digitale Verstärkung zwischen zwei und drei ein. Beenden Sie nach dieser Optimierung das Live-Bild und öffnen Sie das Fenster für den Aufnahmemodus.
Passen Sie die Bildgröße an, indem Sie auf X mal Y klicken und 10 24 mal 10 24 auswählen. Wählen Sie außerdem eine langsame Geschwindigkeit. Öffnen Sie als Nächstes die Mittelwertbildung und wählen Sie eine Zahl größer oder gleich vier.
Klicken Sie dann auf die Aufnahmetaste und speichern Sie das erfasste 2D-Bild. Um die 3D-Bildgebung einzurichten, öffnen Sie die Registerkarte „Smart Setup“ und aktivieren Sie den Eintrag „ZS-Stack“, wodurch das Fenster für den ZS-Stack geöffnet wird. Um die erste und letzte Position für den Zack festzulegen, klicken Sie erneut auf „Live“ und justieren Sie den Fokus auf die oberste Position des Astrozyten.
Klicken Sie zuerst auf „Erster festlegen“. Stellen Sie nun den Fokus auf die tiefste Position des Astrozyten ein und klicken Sie auf „Letzter festlegen“, dann beenden Sie die Live-Ansicht. Wählen Sie anschließend das Intervall, indem Sie auf „Optimal“ klicken.
Um die Anzahl der Schnitte festzulegen, beträgt das Intervall 1,01 Mikrometer. Klicken Sie abschließend auf „Start“, „Experiment“ und speichern Sie die Bilder, sobald der Scan abgeschlossen ist. Erstellen Sie außerdem ein 2D-Bild mit einem 10×- oder 20×-Objektiv.
Wählen Sie für die Messung der Fluoreszenzintensität im Bildfenster das Rechteck- oder Kreiswerkzeug aus und markieren Sie einen Bereich zur Messung, um Volumen und Oberfläche des Zellkörpers des Astrozytenkerns sowie des Territoriums zu quantifizieren. Übertragen Sie die 3D-Bilder in ein geeignetes Analyse-Softwareprogramm, beispielsweise Velocity 6.1 in der Analyse-Software. Erstellen Sie eine neue Bibliothek und ziehen Sie alle Bilder in die linke graue Spalte.
Wählen Sie ein 3D-Bild aus und schalten Sie einen der erfassten Kanäle von Interesse ein, beispielsweise dapi. Für nukleare Messungen passen Sie manuell die Helligkeit an, um den Kontrast zu optimieren. Wählen Sie nun das Werkzeuge-Menü aus.
Wählen Sie „Volumen erstellen“ und erzeugen Sie ein einzelnes 3D-Bild aus den Zack-Bildern. Öffnen Sie das Bearbeitungsmenü und klicken Sie auf Eigenschaften. Stellen Sie sicher, dass die X-, Y- und Z-Eigenschaften angezeigt werden.
Danach wählen Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug (ROI) aus der Symbolleiste aus. Zeichnen Sie mit dem ausgewählten Werkzeug eine Linie um den mit DPI markierten Zellkern, um Volumen und Oberfläche des Astrozytenkerns zu messen. Verwenden Sie erneut das Freihand-Auswahlwerkzeug, um Volumen und Oberfläche des gesamten Astrozyten zu bestimmen, indem Sie eine Linie um das Soma ziehen, die dem Verlauf aller Fortsätze folgt.
Klicken Sie auf das Messmenü oben im Bildfenster, ziehen Sie „Objekte finden“ an die Oberseite des Fensters und vergeben Sie einen beschreibenden Namen für Population eins, wählen Sie die zugehörige Farbe aus und klicken Sie auf „Messen“, wodurch ein neues Fenster geöffnet wird. Wählen Sie in diesem neuen Fenster entweder „Volumen“ oder „Oberfläche“ als Parameter aus und klicken Sie auf „OK“.
Um die Daten zu speichern, klicken Sie auf das Messmenü und wählen Sie „Messwert erfassen“. Wählen Sie einen neuen Messwert aus dem Fenster aus. Geben Sie einen Dateinamen für die Daten ein und klicken Sie auf „OK“.
Schließlich exportieren Sie die Messdaten in ein geeignetes Softwarepaket, um eine statistische Analyse durchzuführen und Datenplots zu erstellen. Hier verglichen die Forscher Astrozyten in fixiertem Hirngewebe von Ratten, die entweder mit Amyloid-Beta eins 40 oder mit Amyloid-Beta eins 40 und Ian behandelt worden waren. Die Injektion der Amyloid-Proteine führte zu Astrozyten mit dickeren und längeren Fortsätzen.
Diese Astrozyten aus Ian-behandelten Tieren wiesen eine sternförmige Gestalt mit kurzen und dünnen Fortsätzen auf. Ian-behandelte Ratten zeigten außerdem eine verminderte GFAP-positive Fluoreszenz der Astrozyten in den Gehirnschnitten. Die morphometrische Analyse spezifischer Astrozytenvolumina ergab, dass das Volumen des Astrozytenkerns, des Zellkörpers, der gesamten Astrozyte sowie des Astrozyten-Territoriums nach Ian-Behandlung im Vergleich zur alleinigen Amyloid-Behandlung vermindert war.
Nachdem dieses Bild beherrscht ist, kann die Analysetechnik pro Zelle innerhalb weniger Minuten abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Struktur mit hoher Präzision zu markieren. Es ist ratsam, das manuelle Markieren der Struktur von Interesse vor Beginn des Experiments nach dessen Entwicklung zu üben.
Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Zellbiologie, Histologie und Pathologie, um die Struktur einer Zelle in gesundem oder krankem Zustand zu untersuchen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man 12 verschiedene Parameter für eine einzelne Zelle anhand von 3D-Bildern misst.
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Übersicht
Dieser Bericht stellt ein Protokoll zur Beurteilung der Astrozytenmorphologie in drei Dimensionen mittels konfokaler Mikroskopie vor. Die Methode bewertet morphologische Veränderungen von Astrozyten unter pathologischen Bedingungen oder nach therapeutischen Eingriffen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Pathologie
Hintergrund
- Die Astrozyten im ZNS zeigen Veränderungen als Reaktion auf schädliche Reize.
- Das Verständnis der Astrozytenmorphologie ist entscheidend für die Untersuchung verschiedener neurologischer Erkrankungen.
- Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Parameter der zellulären Architektur.
- Die konfokale Mikroskopie liefert hochauflösende dreidimensionale Bilder.
Zweck der Studie
- Um die Astrozytenmorphologie unter Krankheitsbedingungen zu beurteilen.
- Um die Wirkungen therapeutischer Interventionen auf die Astrozytenstruktur zu bewerten.
- Um einen zuverlässigen Protokollablauf für die morphologische Analyse zu entwickeln.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Objektträgern für die immunhistochemische Färbung.
- Deparaffinisierung der Schnitte mit Xylol.
- Rehydratisierung der Schnitte durch abgestufte Ethanol-Lösungen.
- Inkubation mit dem primären GFAP-Antikörper zur Identifizierung von Astrozyten.
Hauptergebnisse
- Nachweis morphologischer Veränderungen in Astrozyten.
- Identifizierung struktureller Veränderungen als Reaktion auf Interventionen.
- Validierung des Protokolls für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bewertet effektiv die Astrozyten-Morphologie.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Rolle von Astrozyten in der Pathologie des zentralen Nervensystems bei.
- Zukünftige Anwendungen könnten therapeutische Strategien bei neurologischen Erkrankungen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Beurteilung der Astrozyten-Morphologie ermöglicht eine mechanistische Entlastung bei der Validierung von Zielstrukturen in der Neurodegeneration, indem strukturelle Veränderungen mit therapeutischen Interventionen verknüpft werden. Dieser 3D-konfokale morphometrische Ansatz stützt die Vorhersagegenauigkeit in der frühen Forschung, indem er multiparametrische Messgrößen bereitstellt, die auf wegweissende, spezifische Gliazellen-Reaktionen hinweisen. Die Methode verbessert die Übertragbarkeit von Ergebnissen aus in-vitro- oder in-vivo-Modellen auf präklinische Entscheidungsprozesse durch standardisierte und reproduzierbare Bildgebungsabläufe.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die strukturelle Umgestaltung von Astrozyten als Reaktion auf Amyloid-Beta und interventionelle Strategien quantifiziert wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch multiparametrische Analyse der glialen Reaktivität und verringert damit mechanistische Unschärfen bei der Zielstrukturenbindung im ZNS.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe vor, indem morphologische Phänotypen unter Basisbedingungen und nach Interventionen etabliert werden.
- Operationaler Wert: Trägt durch quantitative morphometrische Ausgaben mit 12 Parametern, die für die Anpassung an High-Content-Screenings geeignet sind, zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays bei.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem reaktive Astrogliose in amyloidexponiertem Rattengehirngewebe modelliert wird, was mit translationsrelevanten Biomarkerwegen bei Neurodegeneration übereinstimmt.
- Operativer Wert: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem eine langzeitliche Verfolgung struktureller Veränderungen von Astrozyten über verschiedene Behandlungsbedingungen hinweg ermöglicht wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung bis zur Identifizierung von Leitstrukturen, indem sie quantitative Daten zur glialen Morphologie liefert, die die Zielstrukturauswahl und die Absicherung von Signalwegen unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung, die Aufklärung von Signalwegen oder die biologische Risikominderung durch strukturelle Phänotypisierung von Astrozyten in pathologischen und interventionsbezogenen Kontexten unterstützt.
- Screening: Beschreibt die Eignung des Assays, dessen Reproduzierbarkeit oder quantitative Ausgaben, sofern diese durch standardisierte 3D-Bildgebung und multiparametrische Analyse im Artikel belegt sind.
- Analytik: Betont Messgrößen, Nachweise oder statistische Ergebnisse, die Teams bei der Vergleichbarkeit von Bedingungen unterstützen, einschließlich Volumen, Oberfläche, Verzweigungslänge, Anzahl, Fluoreszenzintensität und Dichte.
- Translationale Forschung: Verknüpft die Methode mit präklinischer Kontinuität oder Biomarker-Abstimmung ausschließlich dann, wenn dies durch die Modellierung krankheitsrelevanter Astrozytenreaktivität in der Quelle belegt ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar, anstatt als Einmaltechnik, durch standardisierte Bildgebungs- und Analyseprotokolle, die auf verschiedene Zelltypen und Bedingungen anwendbar sind.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeit.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz und verringertes biologisches Risiko in späteren Phasen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung und Förderentscheidungen.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Expertise in konfokaler Mikroskopie, immunhistochemischer Färbung und 3D-Bildanalyse.
- Erforderliche instrumentelle und analytische Infrastruktur, einschließlich eines konfokalen Mikroskops mit Z-Stack-Funktion und 3D-Analyse-Software wie Volocity.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich Färbeprotokollen, Bildaufnahmeparametern und Konsistenz morphometrischer Messungen.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, einschließlich in vivo und in vitro hergestellter Astrozytenpräparationen aus verschiedenen Spezies.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind, darunter die Notwendigkeit präziser manueller Strukturmarkierung und Optimierung der Bildaufnahmeeinstellungen hinsichtlich des Signal-Rausch-Verhältnisses.
