Dreidimensionale Bildgebung von immunmarkierten Astrozyten mittels konfokaler Mikroskopie

Nehmen Sie einen immungefärbten Schnitt aus dem Gehirn einer Maus mit fluoreszenzmarkierten Astrozyten. Das Zytoplasma des Astrozyten fluoresziert rot, während der Zellkern blau fluoresziert.

Legen Sie den Objektträger auf den Tisch eines konfokalen Mikroskops unter eine geeignete Objektivlinse.

Passen Sie mit der Erfassungssoftware den Fokus an und wählen Sie die Fluorophore aus, die das Zytoplasma und den Zellkern des Astrozyten markieren.

Starten Sie die Live-Bildgebung und optimieren Sie die Bildgebungsparameter, um das Rauschen im aufgenommenen Bild zu reduzieren.

Wählen Sie unter Erfassungsparameter einen Scanmodus mit niedriger Geschwindigkeit aus, um ein zweidimensionales Bild mit höherer Qualität aufzunehmen.

Identifizieren Sie die oberste Position des Astrozyten als Ausgangspunkt für den Z-Stapel und die unterste Position als Endpunkt.

Definieren Sie die Anzahl der Segmente, die die gesamte Zellentiefe abdecken.

Führen Sie die Schichten zusammen, um ein dreidimensionales Bild des Astrozyten zu erzeugen.

Um mit der konfokalen Mikroskopie zu beginnen, legen Sie einen Objektträger auf den Mikroskoptisch und wählen Sie das 63x-Objektiv aus. Nachdem Sie die Erfassungssoftware geöffnet haben, klicken Sie auf der Registerkarte "Erfassung" auf Smart Setup und wählen Sie die richtigen Fluorophore aus. Hier kommen DAPI und Alexa Fluor 555 zum Einsatz.

Klicken Sie anschließend auf Bestes Signal, gefolgt von Übernehmen. Klicken Sie dann auf Belichtung einstellen, damit der Computer die optimalen Belichtungsparameter ermitteln kann.

Um das Bild zu optimieren, öffnen Sie das Fenster "Kanäle" und schalten Sie das Bild auf "Live". Passen Sie den Fokus bei Bedarf an. Klicken Sie dann auf 1 AU, um die Lochblende zu optimieren. Passen Sie die Verstärkung für die beste Intensität an.

Stellen Sie abschließend die digitale Verstärkung zwischen 2 und 3 ein. Stoppen Sie nach dieser Optimierung das Live-Bild und öffnen Sie das Fenster "Aufnahmemodus". Passen Sie die Rahmengröße an, indem Sie auf X mal Y klicken, und wählen Sie 1024 x 1024 aus. Wählen Sie außerdem eine langsame Geschwindigkeit.

Öffnen Sie als Nächstes die Registerkarte Mittelwertbildung und wählen Sie eine Zahl größer oder gleich 4 aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Snap und speichern Sie das aufgenommene 2D-Bild. Um die 3D-Bildgebung einzurichten, öffnen Sie die Registerkarte Smart Setup und markieren Sie das Element Z-Stack, wodurch das Stack-Fenster geöffnet wird.

Um die erste und letzte Position für den Z-Stack festzulegen, klicken Sie erneut auf Live und stellen Sie den Fokus auf die oberste Position des Astrozyten ein. Klicken Sie auf Zuerst festlegen. Stellen Sie nun den Fokus auf die niedrigste Position des Astrozyten ein und klicken Sie auf Zuletzt einstellen. Stoppen Sie dann die Live-Ansicht.

Wählen Sie anschließend das Intervall aus, indem Sie auf Optimal klicken, um die Anzahl der Slices festzulegen. Hier liegt das Intervall bei 1,01 Mikrometern. Klicken Sie abschließend auf Experiment starten und speichern Sie die Bilder, sobald der Scan abgeschlossen ist.