Pulldown-Assay gekoppelt mit Co-Expression in Bakterienzellen als zeiteffizientes Werkzeug zum Testen anspruchsvoller Protein-Protein-Interaktionen
December 23rd, 2022
Hier beschreiben wir eine Methode zur bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen unter Verwendung einer Reihe kompatibler Vektoren, gefolgt von den konventionellen Pulldown-Techniken zur Untersuchung von Proteinkomplexen, die sich in vitro nicht zusammensetzen können.
Diese Methode ermöglicht es, die Bildung von Proteinkomplexen zu untersuchen, die eine Koexpression für effiziente Testproben erfordern, wie z.B. die Bildung von Heterodimeren. Das Hauptpotenzial dieser Methode besteht darin, die Co-Expression von differentiell markierten untersuchten Proteinen unter Verwendung von Kombinationen kompatibler Vektoren zu nutzen, um eine effiziente komplexe Assemblierung sowie einen zeiteffizienten Arbeitsablauf und Skalierbarkeit zu fördern, die einen schnellen Patch-Test mehrerer Interaktionen ermöglichen. Diese Methode kann auch für ein schnelles Screening optimaler Proteinexpressions- und Aufreinigungsbedingungen verwendet werden.
Die visuelle Demonstration hilft bei der korrekten Durchführung kritischer Schritte des Protokolls, wie z. B. Co-Expression-Setup, Zellaufschluss und nachfolgende Pulldown-Schritte. Um zu beginnen, züchten Sie den Stamm Escherichia coli BL21 (DE3) in Luria-Bertani- oder LB-Medien bei 37 Grad Celsius auf eine optische Dichte (OD) von 0,1 bis 0,2. Zentrifugieren Sie einen Milliliter der Bakteriensuspension für eine Minute bei 9.000 G bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand.
Fügen Sie dann 0,5 Milliliter eiskalten Transformationspuffer (TB) hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang auf Eis. Am Ende der Inkubation 30 Sekunden lang bei 8.000 G bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter TB-Puffer und 100 Nanogramm jedes Vektors hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis.
150 Sekunden auf 42 Grad Celsius erhitzen, dann eine Minute auf Eis kalt stellen. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter LB-Medien ohne Antibiotika hinzu und inkubieren Sie 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird das Pellet in 100 Mikrolitern LB-Medien zentrifugiert und resuspendiert, bevor die Suspension auf eine LB-Agarplatte aufgetragen wird, die 0,5% Glucose und entsprechende Antibiotika enthält.
Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie am nächsten Tag die Zellen von der Platte mit zwei Millilitern LB-Medien in 50 Milliliter LB-Medien mit entsprechenden Antibiotika. Fügen Sie Metallionen oder andere bekannte Co-Faktoren hinzu, bevor Sie ein Aliquot mit 20% Glycerin bei minus 70 Grad Celsius für nachfolgende Experimente lagern.
Züchten Sie die Zellen mit einer konstanten Rotation von 220 U / min bei 37 Grad Celsius bis zu einem OD von 0,5 bis 0,7. Kühlen Sie die Kultur auf Raumtemperatur ab und fügen Sie IPTG bis zu einer Endkonzentration von einem Millimol hinzu. Lagern Sie ein 20-Mikroliter-Aliquot der Zellsuspension als Kontrolle der nicht induzierten Probe.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 220 U/min bei 18 Grad Celsius. Teilen Sie die bakterielle Suspension am nächsten Tag in zwei Teile und lagern Sie 20-Mikroliter-Aliquots, um die Proteinexpression zu bestätigen. Zentrifugieren Sie die verbleibende Zellsuspension bei 4.000 G für 15 Minuten.
Für den Pulldown-Assay resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter eiskaltem Lysepuffer mit Proteasehemmern und Reduktionsmitteln, die unmittelbar vor dem Experiment zugesetzt wurden. Passen Sie die Pufferzusammensetzung für die getesteten Proteine an. Brechen Sie die Zellen durch Beschallung auf Eis auf und lagern Sie ein 20-Mikroliter-Aliquot für die Elektrophorese.
Zentrifugieren Sie 30 Minuten lang bei 16.000 G und sammeln Sie 20 Mikroliter des geklärten Lysats für die Elektrophorese. Das Harz 10 Minuten lang mit einem Milliliter eiskaltem Lysepuffer ausgleichen, dann 30 Sekunden lang bei 2.000 G zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Fügen Sie dem Harz Zelllysate hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei einer konstanten Drehung von 15 U / min.
Zentrifugieren und verwerfen Sie dann den Überstand, bevor Sie 20 Mikroliter der ungebundenen Fraktion zur Analyse sammeln. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter eiskalten Waschpuffer hinzu und inkubieren Sie ihn eine Minute lang. Nochmals zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
Führen Sie dann zwei lange Wäschen mit eiskaltem Waschpuffer durch. Nach dem zweiten Waschen eluieren Sie die gebundenen Proteine mit 50 Mikrolitern des Elutionspuffers in einem Shaker bei 1.200 U / min bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Analysieren Sie die eluierten Proteine mit der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Studien zur Zinkfinger-assoziierten Domäne (ZAD), zur Homodimerisierung in Maltose-bindendem Protein (MBP) und zu 6xHistidin-Pulldown-Assays werden hier gezeigt. Die Koexpression von MBP- und Thioredoxin-6xHistidin-fusionierten ZADs zeigt eine gute und reproduzierbare Homodimerisierungsaktivität und erscheint als zusätzliche Bande in den SDS-PAGE-Ergebnissen des MBP-Pulldown-Assays. Ein weiteres Beispiel für die Verwendung der Methode zur Untersuchung alternativer Komplexbildung wird hier gezeigt.
Im Co-Expressions-Assay interagierte 6xHistidin-markiertes ENY2 sowohl mit GST-markiertem Sgf11 als auch mit MBP-CTCF, aber in den MBP-Pulldowns war kein GST-Sgf11 vorhanden und umgekehrt. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Vergleich der erforderlichen Zeitintervalle im Workflow des konventionellen Pulldown-Assays im Vergleich zum Pulldown in Verbindung mit der Koexpression gezeigt. Die Ergebnisse der Verwendung beider Techniken zur Untersuchung der gleichen Interaktion zwischen der BTB-Domäne des CP190-Proteins und der GST-markierten C-terminalen Domäne des Drosophila-CTCF-Proteins werden hier gezeigt.
Die richtige Wahl des Affinitäts- und Löslichkeitstests, Thioredoxin, GST oder MBP, ist entscheidend für die effiziente Durchführung des Assays. Ein weiterer wichtiger Schritt ist der schnelle und gleichmäßige Zellaufschluss. Es wird dringend empfohlen, Ultraschallsonden mit mehreren Spitzen zu verwenden.
Diese Methode ermöglicht die direkte Untersuchung der Heterodimerbildung zwischen Proteindomänen, die sonst Homodimere bilden, die während der Inkubation gereinigter Proteine im herkömmlichen Pulldown-Assay nicht dissoziieren würden.
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Überblick
Dieser Artikel beschreibt eine Methode für die bakterielle Ko-Expression von unterschiedlich markierten Proteinen unter Verwendung kompatibler Vektoren. Der Ansatz erleichtert die Untersuchung von Proteinkomplexen, die sich nicht in vitro zusammenbauen lassen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biochemie
- Molekulare Biologie
- Proteininteraktionsstudien
Hintergrund
- Proteinkomplexe erfordern oft eine Ko-Expression für eine effiziente Assembly.
- Die Bildung von Heterodimeren steht im Mittelpunkt dieser Methode.
- Traditionelle Pulldown-Techniken werden eingesetzt, um diese Komplexe zu analysieren.
- Visuelle Demonstrationen verbessern das Verständnis des Protokolls.
Zweck der Studie
- Nutzung der Ko-Expression von unterschiedlich markierten Proteinen.
- Förderung einer effizienten Komplexbildung.
- Ermöglichung eines schnellen Screenings von Proteinexpressionsbedingungen.
Verwendete Methoden
- Ko-Expression von Proteinen im Escherichia coli BL21(DE3) Stamm.
- Wachstum in Luria-Bertani (LB) Medium bei 37 Grad Celsius.
- Zentrifugation der Bakteriensuspension zur Isolierung der Zellen.
- Nachfolgende Pulldown-Schritte zur Analyse von Proteininteraktionen.
Hauptergebnisse
- Eine effiziente Assembly von Proteinkomplexen wurde erreicht.
- Zeitsparender Workflow ermöglichte schnelle Tests von Interaktionen.
- Optimale Proteinexpressionsbedingungen wurden identifiziert.
- Kritische Schritte des Protokolls wurden erfolgreich demonstriert.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen robusten Ansatz zur Untersuchung von Proteinkomplexen.
- Sie verbessert das Verständnis von Proteininteraktionen in einem zellulären Kontext.
- Zukünftige Anwendungen können umfassendere Proteininteraktionsstudien umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Efficient and reproducible interrogation of protein-protein interactions is critical for early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma R&D. The pulldown assay coupled with bacterial co-expression enables rapid, scalable assessment of challenging complexes that cannot be reconstituted in vitro, directly impacting predictive confidence at the discovery inflection point. This workflow supports portfolio triage by enabling batch testing of interaction hypotheses with reduced time and technical variability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of protein complexes requiring co-translational assembly or chaperone support.
- Facilitates functional validation of interaction partners that are unstable or non-reconstitutable in vitro.
- Supports mechanistic de-risking by confirming biologically relevant interactions under near-native conditions.
- Accelerates hypothesis-driven triage of candidate targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream screening and assay development workflows.
- Improves reproducibility and standardization by minimizing proteolysis and oxidation during sample handling.
- Enables rapid, parallelized batch testing of multiple protein-protein interactions.
- Supports optimization of expression and purification conditions for challenging targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interaction studies with disease-relevant protein complexes when in vitro reconstitution is not feasible.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting robust mechanistic insights.
- Reduces risk of late-stage attrition due to undetected interaction dependencies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid hypothesis testing and functional validation of protein interactions prior to downstream screening or preclinical modeling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by enabling direct assessment of complex assembly requirements.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides SDS-PAGE and affinity-based readouts for robust measurement of interaction strength and specificity.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant systems when standard in vitro approaches are insufficient.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for batch testing diverse protein-protein interactions across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows through time-efficient, reproducible protocols and minimized sample handling.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by rapidly de-risking interaction hypotheses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated interaction dependencies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial co-expression systems and affinity purification techniques.
- Needs access to compatible expression vectors, multi-tip sonicators, and analytical infrastructure for SDS-PAGE.
- Demands cross-team standardization of tagging strategies and buffer compositions for reproducibility.
- May require adaptation for different protein classes or interaction types based on solubility and stability.
- Limited to interactions amenable to bacterial expression and compatible with available affinity tags.
