Pulldown-Assay gekoppelt mit Co-Expression in Bakterienzellen als zeiteffizientes Werkzeug zum Testen anspruchsvoller Protein-Protein-Interaktionen
23. Dezember 2022
Hier beschreiben wir eine Methode zur bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen unter Verwendung einer Reihe kompatibler Vektoren, gefolgt von den konventionellen Pulldown-Techniken zur Untersuchung von Proteinkomplexen, die sich in vitro nicht zusammensetzen können.
Diese Methode ermöglicht es, die Bildung von Proteinkomplexen zu untersuchen, die eine Koexpression für effiziente Testproben erfordern, wie z.B. die Bildung von Heterodimeren. Das Hauptpotenzial dieser Methode besteht darin, die Co-Expression von differentiell markierten untersuchten Proteinen unter Verwendung von Kombinationen kompatibler Vektoren zu nutzen, um eine effiziente komplexe Assemblierung sowie einen zeiteffizienten Arbeitsablauf und Skalierbarkeit zu fördern, die einen schnellen Patch-Test mehrerer Interaktionen ermöglichen. Diese Methode kann auch für ein schnelles Screening optimaler Proteinexpressions- und Aufreinigungsbedingungen verwendet werden.
Die visuelle Demonstration hilft bei der korrekten Durchführung kritischer Schritte des Protokolls, wie z. B. Co-Expression-Setup, Zellaufschluss und nachfolgende Pulldown-Schritte. Um zu beginnen, züchten Sie den Stamm Escherichia coli BL21 (DE3) in Luria-Bertani- oder LB-Medien bei 37 Grad Celsius auf eine optische Dichte (OD) von 0,1 bis 0,2. Zentrifugieren Sie einen Milliliter der Bakteriensuspension für eine Minute bei 9.000 G bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand.
Fügen Sie dann 0,5 Milliliter eiskalten Transformationspuffer (TB) hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang auf Eis. Am Ende der Inkubation 30 Sekunden lang bei 8.000 G bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter TB-Puffer und 100 Nanogramm jedes Vektors hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis.
150 Sekunden auf 42 Grad Celsius erhitzen, dann eine Minute auf Eis kalt stellen. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter LB-Medien ohne Antibiotika hinzu und inkubieren Sie 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird das Pellet in 100 Mikrolitern LB-Medien zentrifugiert und resuspendiert, bevor die Suspension auf eine LB-Agarplatte aufgetragen wird, die 0,5% Glucose und entsprechende Antibiotika enthält.
Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie am nächsten Tag die Zellen von der Platte mit zwei Millilitern LB-Medien in 50 Milliliter LB-Medien mit entsprechenden Antibiotika. Fügen Sie Metallionen oder andere bekannte Co-Faktoren hinzu, bevor Sie ein Aliquot mit 20% Glycerin bei minus 70 Grad Celsius für nachfolgende Experimente lagern.
Züchten Sie die Zellen mit einer konstanten Rotation von 220 U / min bei 37 Grad Celsius bis zu einem OD von 0,5 bis 0,7. Kühlen Sie die Kultur auf Raumtemperatur ab und fügen Sie IPTG bis zu einer Endkonzentration von einem Millimol hinzu. Lagern Sie ein 20-Mikroliter-Aliquot der Zellsuspension als Kontrolle der nicht induzierten Probe.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 220 U/min bei 18 Grad Celsius. Teilen Sie die bakterielle Suspension am nächsten Tag in zwei Teile und lagern Sie 20-Mikroliter-Aliquots, um die Proteinexpression zu bestätigen. Zentrifugieren Sie die verbleibende Zellsuspension bei 4.000 G für 15 Minuten.
Für den Pulldown-Assay resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter eiskaltem Lysepuffer mit Proteasehemmern und Reduktionsmitteln, die unmittelbar vor dem Experiment zugesetzt wurden. Passen Sie die Pufferzusammensetzung für die getesteten Proteine an. Brechen Sie die Zellen durch Beschallung auf Eis auf und lagern Sie ein 20-Mikroliter-Aliquot für die Elektrophorese.
Zentrifugieren Sie 30 Minuten lang bei 16.000 G und sammeln Sie 20 Mikroliter des geklärten Lysats für die Elektrophorese. Das Harz 10 Minuten lang mit einem Milliliter eiskaltem Lysepuffer ausgleichen, dann 30 Sekunden lang bei 2.000 G zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Fügen Sie dem Harz Zelllysate hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei einer konstanten Drehung von 15 U / min.
Zentrifugieren und verwerfen Sie dann den Überstand, bevor Sie 20 Mikroliter der ungebundenen Fraktion zur Analyse sammeln. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter eiskalten Waschpuffer hinzu und inkubieren Sie ihn eine Minute lang. Nochmals zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
Führen Sie dann zwei lange Wäschen mit eiskaltem Waschpuffer durch. Nach dem zweiten Waschen eluieren Sie die gebundenen Proteine mit 50 Mikrolitern des Elutionspuffers in einem Shaker bei 1.200 U / min bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Analysieren Sie die eluierten Proteine mit der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Studien zur Zinkfinger-assoziierten Domäne (ZAD), zur Homodimerisierung in Maltose-bindendem Protein (MBP) und zu 6xHistidin-Pulldown-Assays werden hier gezeigt. Die Koexpression von MBP- und Thioredoxin-6xHistidin-fusionierten ZADs zeigt eine gute und reproduzierbare Homodimerisierungsaktivität und erscheint als zusätzliche Bande in den SDS-PAGE-Ergebnissen des MBP-Pulldown-Assays. Ein weiteres Beispiel für die Verwendung der Methode zur Untersuchung alternativer Komplexbildung wird hier gezeigt.
Im Co-Expressions-Assay interagierte 6xHistidin-markiertes ENY2 sowohl mit GST-markiertem Sgf11 als auch mit MBP-CTCF, aber in den MBP-Pulldowns war kein GST-Sgf11 vorhanden und umgekehrt. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Vergleich der erforderlichen Zeitintervalle im Workflow des konventionellen Pulldown-Assays im Vergleich zum Pulldown in Verbindung mit der Koexpression gezeigt. Die Ergebnisse der Verwendung beider Techniken zur Untersuchung der gleichen Interaktion zwischen der BTB-Domäne des CP190-Proteins und der GST-markierten C-terminalen Domäne des Drosophila-CTCF-Proteins werden hier gezeigt.
Die richtige Wahl des Affinitäts- und Löslichkeitstests, Thioredoxin, GST oder MBP, ist entscheidend für die effiziente Durchführung des Assays. Ein weiterer wichtiger Schritt ist der schnelle und gleichmäßige Zellaufschluss. Es wird dringend empfohlen, Ultraschallsonden mit mehreren Spitzen zu verwenden.
Diese Methode ermöglicht die direkte Untersuchung der Heterodimerbildung zwischen Proteindomänen, die sonst Homodimere bilden, die während der Inkubation gereinigter Proteine im herkömmlichen Pulldown-Assay nicht dissoziieren würden.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur bakteriellen Co-Expression unterschiedlich markierter Proteine unter Verwendung kompatibler Vektoren. Der Ansatz erleichtert die Untersuchung von Protein-Komplexen, die sich in vitro nicht zusammensetzen können.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biokemie
- Molekularbiologie
- Protein-Interaktionsstudien
Hintergrund
- Proteinkomplexe benötigen oft eine Ko-Expression für eine effiziente Assemblierung.
- Die Bildung von Heterodimeren ist ein zentraler Aspekt dieser Methode.
- Zur Analyse dieser Komplexe werden traditionelle Pulldown-Techniken eingesetzt.
- Visuelle Demonstrationen verbessern das Verständnis des Protokolls.
Zweck der Studie
- Zur Nutzung der Ko-Expression unterschiedlich markierter Proteine.
- Zur Förderung einer effizienten Komplexbildung.
- Zur Ermöglichung einer schnellen Überprüfung von Proteinexpressionsbedingungen.
Verwendete Methoden
- Ko-Expression von Proteinen im Escherichia coli BL21(DE3)-Stamm.
- Wachstum in Luria-Bertani (LB)-Medium bei 37 Grad Celsius.
- Zentrifugation der bakteriellen Suspension zur Isolierung der Zellen.
- Anschließende Pulldown-Schritte zur Analyse von Proteinwechselwirkungen.
Hauptergebnisse
- Eine effiziente Assemblierung von Protein-Komplexen wurde erreicht.
- Ein zeiteffizienter Arbeitsablauf ermöglichte eine schnelle Überprüfung von Wechselwirkungen.
- Optimale Proteinexpression-Bedingungen wurden identifiziert.
- Kritische Schritte des Protokolls wurden erfolgreich demonstriert.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen robusten Ansatz zur Untersuchung von Protein-Komplexen.
- Sie verbessert das Verständnis von Protein-Wechselwirkungen im zellulären Kontext.
- Zukünftige Anwendungen könnten umfassendere Studien zu Protein-Wechselwirkungen umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die effiziente und reproduzierbare Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen ist entscheidend für die Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium und die mechanistische Risikominimierung in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung. Der Pull-down-Assay in Kombination mit bakterieller Ko-Expression ermöglicht eine schnelle, skalierbare Analyse anspruchsvoller Komplexe, die nicht in vitro rekonstituiert werden können, und beeinflusst damit direkt die Vorhersagegenauigkeit an einem kritischen Punkt der Entdeckung. Dieser Arbeitsablauf unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem er die gleichzeitige Prüfung mehrerer Interaktionshypothesen bei verkürzter Dauer und reduzierter technischer Variabilität ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung von Protein-Komplexen, die eine ko-translationale Assemblierung oder Chaperon-unterstützte Faltung erfordern.
- Erleichtert die funktionelle Validierung von Interaktionspartnern, die in vitro instabil oder nicht rekonstituierbar sind.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem biologisch relevante Wechselwirkungen unter nahezu nativen Bedingungen bestätigt werden.
- Beschleunigt die hypothesengetriebene Vorselektion von Kandidaten-Targets und Signalwegen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Protein-Komplexe für nachgeschaltete Screening- und Assay-Entwicklungsworkflows vor.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung, indem Proteolyse und Oxidation während der Probenvorbereitung minimiert werden.
- Ermöglicht eine schnelle, parallelisierte Batch-Prüfung mehrerer Protein-Protein-Interaktionen.
- Unterstützt die Optimierung von Expressions- und Reinigungsbedingungen für anspruchsvolle Zielstrukturen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Ausrichtung von Interaktionsstudien an krankheitsrelevanten Protein-Komplexen, wenn eine in-vitro-Rekonstitution nicht durchführbar ist.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem robuste mechanistische Erkenntnisse unterstützt werden.
- Verringert das Risiko einer Ausscheidung in späteren Stadien aufgrund unentdeckter Interaktionsabhängigkeiten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckung und Identifizierung von Wirkstoffkandidaten und ermöglicht eine schnelle Hypothesenprüfung sowie funktionelle Validierung von Proteinwechselwirkungen vor nachgeschalteten Screenings oder präklinischen Modellierungen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Risikominderung, indem komplexe Anforderungen an die Zusammensetzung direkt bewertet werden können.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse, die für vergleichende Analysen unter verschiedenen Bedingungen geeignet sind.
- Analytik: Bietet SDS-PAGE- und affinitätsbasierte Nachweismethoden zur robusten Messung der Interaktionsstärke und -spezifität.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Anbindung an krankheitsrelevante Systeme, wenn etablierte In-vitro-Ansätze nicht ausreichen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine skalierbare und wiederverwendbare Plattform zur Batch-Prüfung vielfältiger Protein-Protein-Interaktionen über verschiedene Programme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Optimiert Arbeitsabläufe durch zeiteffiziente, reproduzierbare Protokolle und minimiertes Probenumgehen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen und Kapitalwirtschaftlichkeit, indem Interaktionshypothesen schnell entrisst werden.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Targets mit validierten Interaktionsabhängigkeiten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in bakteriellen Ko-Expressionssystemen und Affinitätsreinigungstechniken.
- Benötigt Zugang zu kompatiblen Expressionsvektoren, Multispitzen-Sonikatoren und analytischer Infrastruktur für die SDS-PAGE.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich Markierungsstrategien und Pufferzusammensetzungen, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Kann je nach Löslichkeit und Stabilität eine Anpassung für verschiedene Proteinklassen oder Interaktionstypen erfordern.
- Auf Interaktionen beschränkt, die sich für die bakterielle Expression eignen und mit den verfügbaren Affinitätsmarkern kompatibel sind.
