Untersuchung der RNA-Struktur mit Dimethylsulfat-Mutationsprofilierung mit Sequenzierung in vitro und in Zellen

DMS-MaP ist eine sequenzierungsbasierte Methode, die es uns ermöglicht, eine Momentaufnahme der RNA-Struktur zu erhalten und zu lernen, wie sie sich unter verschiedenen Bedingungen verändert. Im Gegensatz zu herkömmlichen Strukturaufklärungsmethoden wie Kristallographie und Elektronenmikroskopie kann DMS-MaP in Zellen und dekonvoluten RNA-Strukturensembles eingesetzt werden. Da die RNA-Struktur Auswirkungen auf eine Vielzahl biologischer Phänomene hat, könnte unsere Methode mechanistische Einblicke in fast jedes Gebiet der biologischen Forschung liefern.

Beginnen Sie mit dem Transfer von 89 Mikrolitern des Rückfaltpuffers in ein dafür vorgesehenes 1,5-Milliliter-Röhrchen für jede Reaktion mit einem Endvolumen von 100 Mikrolitern. Erwärmen Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius in einem Thermoshaker unter einer chemischen Haube. Fügen Sie 10 Mikroliter nukleasefreies Wasser in ein PCR-Röhrchen hinzu und übertragen Sie ein bis 10 Picomole RNA darin.

Inkubieren Sie es in einem Thermocycler bei 95 Grad Celsius für eine Minute, um die RNA zu denaturieren. Und dann legen Sie die Röhre sofort auf einen Eisblock, um eine Fehlfaltung der RNA zu vermeiden. Um nun die RNA zu repressen, geben Sie die Probe in das dafür vorgesehene Röhrchen mit dem Rückfaltungspuffer bei 37 Grad Celsius und mischen Sie es gut, bevor Sie es für 10 bis 20 Minuten inkubieren.

Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter 100% Dimethylsulfat oder DMS mit einer Konzentration von 10,5 Molar in das Röhrchen mit der RNA-Probe hinzu und inkubieren Sie das Reaktionsgemisch fünf Minuten lang, während Sie es bei 800 bis 1.400 Umdrehungen pro Minute schütteln. Nach der fünfminütigen Reaktion löschen Sie es mit 60 Mikrolitern 100% Beta-Mercaptoethanol und mischen Sie es gut, bevor Sie die RNA vortexen und sofort auf Eis legen. Dann reinigen Sie die RNA und eluieren Sie sie in 10 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser.

Quantifizieren Sie die RNA mit einem Spektralphotometer. Schließlich lagern Sie die modifizierte RNA bei minus 80 Grad Celsius. Nach Zugabe des Reaktionsgemisches in das PCR-Röhrchen werden mindestens 100 Nanogramm der eluierten modifizierten RNA in 10 Mikroliter nukleasefreiem Wasser in das PCR-Röhrchen überführt.

Inkubieren Sie die Mischung bei 57 Grad Celsius für 30 Minuten bis 1,5 Stunden in einem Thermocycler. 30 Minuten reichen aus, um ein Produkt herzustellen, das 500 Nukleotide enthält. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter vier molare Natriumhydroxid hinzu, mischen Sie gut per Pipette und inkubieren Sie bei 95 Grad Celsius für drei Minuten, um die RNA abzubauen und TGIRT aus der komplementären DNA freizusetzen.

Verwenden Sie einen säulenbasierten Ansatz zum Entfernen der Primer, reinigen Sie die komplementäre DNA. Und führen Sie PCR durch, um es zu amplifizieren. Überprüfen Sie den PCR-Erfolg, indem Sie zwei Mikroliter des PCR-Produkts auf ein Agarosegel auftragen, bevor Sie mit der Bibliotheksvorbereitung fortfahren.

Quantifizieren Sie dann die extrahierten Fragmente mit einem Spektralphotometer, bevor Sie die Fragmente für die Sequenzierung indizieren. Übertragen Sie die virusinfizierten Zellen, die bis zum gewünschten Stadium der Infektion gezüchtet wurden, in einen speziellen und geeigneten Abzug mit dem erforderlichen Biosicherheitsniveau. Geben Sie 2,5% Volumen DMS in das Kulturmedium, das die Zellen enthält, und verschließen Sie den Behälter mit Parafilm.

Sofort den Behälter bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren. Nach der Inkubation vorsichtig pipettieren und entsorgen Sie das DMS-haltige Medium in den entsprechenden chemischen Abfall. Fügen Sie dann vorsichtig 10 Milliliter Stop-Puffer in die Zellen hinzu, kratzen Sie die Zellen ab und übertragen Sie sie in ein 15-Milliliter-konisches Röhrchen.

Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren des Röhrchens für drei Minuten bei 3.000 g. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet zweimal mit 10 Milliliter PBS. Entfernen Sie PBS-Reste nach dem Waschen vorsichtig so weit wie möglich.

Lösen Sie das Pellet in einer geeigneten Menge RNA-Isolierreagenz auf, um eine RNA-Extraktion durchzuführen. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform zu einem Milliliter homogenisierter Zellen im RNA-Isolierreagenz hinzu und wirbeln Sie es für 15 bis 20 Sekunden, bis die Zelllösung leuchtend rosa wird. Warten Sie, bis die Phasentrennung stattgefunden hat, was durch die rosa Lipidphase angezeigt wird, die sich unten absetzt.

Drehen Sie das Röhrchen mit einer Geschwindigkeit von etwa 20.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, bevor Sie die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen überführen. Reinigen Sie die RNA und eluieren Sie in einem ausreichenden Volumen nukleasefreien Wassers. Nach Durchführung der ribosomalen RNA-Depletion mit dem bevorzugten Ansatz eluieren Sie die RNA in einem ausreichenden Volumen nukleasefreien Wassers und quantifizieren Sie sie mit einem Spektralphotometer.

Die gereinigte RNA kann wieder in der RT-PCR verwendet werden. Über den genannten Webserver können die DMS-MaP-Daten komfortabel analysiert werden. Die Lesevorgänge werden einer Referenz zugeordnet, und die Mutationen pro Basis werden gezählt.

Die resultierenden populationsdurchschnittlichen Dateien können als Einschränkungen in bekannten RNA-Strukturvorhersagesoftware verwendet werden. Die resultierenden minimalen freien Energiestrukturen können mit Software wie VARNA visualisiert werden. Derzeit kann nur die stabile Version von DREAM RNA-Strukturensembles entfalten.

Es wird jedoch daran gearbeitet, diese Funktion für die gesamte Community zugänglicher zu machen. Die In-vitro-Transkription des gBlock-Fragments, das durch Anheften eines T7-Polymerase-Promotors verlängert wurde, erzeugte die interessierende RNA, die als einzelne Bande bei 300 Nukleotiden auf einem 1%igen Agarose-Gel erschien. Der Erfolg der genspezifischen RT-PCR, die an der DMS-modifizierten RNA durchgeführt wurde, wurde durch eine einzelne Bande bei 300 Basenpaaren auf einem 2%-Agarose-Gel angezeigt.

Das indizierte Fragment erschien etwa 150 Basenpaare höher als erwartet. Die DMS-Behandlung wurde an HCT-8-Zellen durchgeführt, die vier Tage nach der Infektion mit dem Virus eine zytopathische Wirkung zeigten. Die extrahierte Gesamt-RNA erschien auf dem Agarosegel als zwei helle Banden, die die Untereinheiten 40S und 60S ausmachten.

Nach der ribosomalen RNA-Depletion verschwanden die beiden hellen Bänder und hinterließen einen Abstrich in der entsprechenden Spur. Nach der Bibliotheksvorbereitung hatten die Proben unterschiedliche Größenverteilungen und erschienen als Abstrich. Die Bande wurde zwischen 200 und 500 Nukleotide herausgeschnitten und die Adapterdimere wurden abgetrennt.

Das Strukturmodell des SARS-CoV-2-Genoms zeigte, dass Basen mit offener Konformation eine höhere Reaktivität aufweisen als Basenpaarungen. Das Reaktivitätsprofil der Basen zeigte, dass Uracil und Guanin niedrige Reaktivitätswerte aufwiesen und nicht durch DMS modifiziert wurden. Mit unserer Methode sind wir in der Lage, Strukturen in Zellen im Hochdurchsatz ohne Größenbeschränkungen vorherzusagen.

Kontrollmetriken sind sehr wichtig, da sie einen Einblick in die Genauigkeit der Strukturvorhersagen geben. Um die Genauigkeit der Vorhersage weiter zu überprüfen, sollten weitere Experimente durchgeführt werden, die die Struktur stören oder verändern.