Visualisierung und Quantifizierung der intermolekularen RNA-Basenpaarung in in vitro RNA-Clustern mit gespaltenen Brokkoli-RNA-Reportern
29. Mai 2026
Dieses Protokoll beschreibt einen visuellen Test mit gespaltenen Brokkoli-RNA-Reportern, um intermolekulare Basenpaarungen in vitro in RNA-Clustern zu erkennen und zu quantifizieren.
Wir wenden den Split-Broccoli-RNA-Reporter-Assay an, um intermolekulare Basenpaarungen in RNA-Clustern in vitro zu erkennen und zu quantifizieren. Chemische Sondierungen und Simulationen deuten auf RNA-Wechselwirkungen hin, können sie aber nicht direkt messen. Dieses Protokoll ermöglicht eine direkte, genaue Bewertung innerhalb von RNA-Clustern.
Nach der Vorbereitung der DNA-Vorlagen für die In-vitro-RNA-Transkription wird die Arbeitsfläche, die Röhrenracks und Pipetten mit einer Ribonuklease-Dekontaminationslösung abgewischt. Verwenden Sie ribonucleasefreie gefilterte Spitzen für alle Pipettierschritte. Tauen Sie den Reaktionspuffer und die Nukleotidlösungen, die mit dem Transkriptionskit geliefert werden, zusammen mit Uridintriphosphat Cyanin 5, oder UTP-Cy5, auf Eis.
Zentrifugiere alle Röhren bei 2.000g für zwei Sekunden vor der Benutzung. Berechnen Sie dann die Anzahl der Thyminbasen in der DNA. Bestimmen Sie die erforderlichen Mengen an UTP und UTP-Cy5 für eine 20-Mikroliter-Transkriptionsreaktion, wobei die konsistente Markierungsdichte über alle RNA-Spezies hinweg aufrechterhalten wird.
Anschließend bereiten Sie eine 20-Mikroliter-Transkriptionsreaktion vor, indem Sie die präsentierten Reagenzien kombinieren. Gründlich mischen, indem man auf und ab pipettiert, und bei 2.000 g für zwei Sekunden zentrifugieren. Nach einer sechsstündigen Inkubation der Reaktion bei 37 Grad Celsius wird ein Mikroliter mit dem Set gelieferte Desoxyribonuklease hinzugefügt, durch Pipettieren gründlich vermischt und erneut zentrifugiert.
Dann brütet man bei 37 Grad Celsius weitere 15 Minuten aus. Übertragen Sie die Reaktion auf ein 1,5-Milliliter-Rohr. Fügen Sie 115 Mikroliter nukleasefreies Wasser und 15 Mikroliter Ammoniasetat-Stopplösung hinzu, die mit dem Kit geliefert wird.
Nach dem Mischen wird die Lösung bei 2.000g für zwei Sekunden zentrifugiert. Gib als Nächstes 150 Mikroliter Phenolchloroform in die Tube und vermische vorsichtig, um die Phasen zu kombinieren. Zentrifugiere bei 16.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Dann übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Rohr. Fügen Sie der übertragenen Lösung ein gleiches Volumen Chloroform hinzu und mischen Sie gründlich, um eine ordnungsgemäße Phasenwechselwirkung sicherzustellen. Zentrifugiere nun bei 16.000 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius und wiederhole den Phasentrennprozess erneut.
Anschließend wird die wässrige Schicht von etwa 100 bis 150 Mikrolitern in ein neues Rohr überführt. Gib 900 Mikroliter Isopropanol hinzu und vermische gründlich. Nach dem Aliquotieren der Lösung in separaten Röhrchen werden die Proben bei minus 20 Grad Celsius über Nacht oder bis zu einem Monat gelagert.
Zentrifugieren Sie die RNA-Probe in Isopropanol bei 16.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Isopropanol vorsichtig, ohne das RNA-Pellet zu stören. Dann gibt es einen Milliliter 70%-Ethanol, das in nukleasefreiem Wasser zubereitet ist, zum Pellet.
Zentrifugiere bei 16.000 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Entfernen des Ethanols geben Sie einen Milliliter 70%-Ethanol, das in nukleasefreiem Wasser zubereitet ist, in das Rohr und wiederholen Sie die Zentrifugation. Während der abschließenden Ethanolwäsche wird der Großteil des Ethanols mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette entfernt.
Zentrifugieren Sie kurz bei 2.000 g für zwei Sekunden in einer Mini-Zentrifuge auf der Werkbank und entfernen Sie den restlichen Ethanol mit einer 20-Mikroliter-Pipette. Sobald das RNA-Pellet getrocknet ist, wird es in 20 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser wieder suspendiert. Bewahren Sie die Probe auf Eis und schützen Sie sie vor Licht.
Mit einem Mikrovolumenspektrophotometer wird RNA-Konzentration und Reinheit gemessen. Stellen Sie sicher, dass das Absorptionsverhältnis bei 260 zu 280 Nanometern etwa 2,0 beträgt und das Verhältnis bei 260 zu 230 Nanometern größer als 2,0. Taue eine Tube mit 100 millimolaren Spermienlösung und 50 % Polyethylenglykol 8.000 auf Eis.
Frisch bereiten Sie einen 10-fachen RNA-Refold-Puffer vor, indem Sie die gezeigten Komponenten kombinieren. Nach gründlichem Vermischen der Komponenten durch Pipettern wird bei 2.000 g für zwei Sekunden in einer Mini-Arbeitszentrifuge gezentrifugiert. Für die Kofaltungsbedingung werden in einem 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen in vitro transkribierte RNA kombiniert, die entweder obere oder untere Sequenz, RNA-Refolding-Puffer und nukleasefreies Wasser trägt.
Gründlich mischen, indem man auf und ab pipettiert und wie zuvor gezeigt zentrifugiert. Erhitze die Probe zwei Minuten lang bei 90 Grad Celsius. Die Probe wird sofort auf Raumtemperatur übertragen.
Vor Licht schützen und eine Stunde ausbrüten. Für die separate Faltbedingung erhitzen Sie die RNA-Probe in einem 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen und legen Sie sie dann sofort für mindestens 15 Minuten auf Eis. In einem 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen werden in vitro transkribierte RNA kombiniert, die entweder obere oder untere Sequenz, einen 10-fachen RNA-Refolding-Puffer und nukleasefreies Wasser tragen.
Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur 30 Minuten lang, geschützt vor Licht. Nun werden die RNA-Proben mit den oberen und unteren Sequenzen zu einem einzigen PCR-Röhrchen kombiniert und gründlich durch Pipettieren auf und ab vermischt. Zentrifugiere bei 2.000g für zwei Sekunden in einer Mini-Zentrifuge auf der Werkbank.
Inkubieren Sie 30 Minuten bei Zimmertemperatur. Für beide Erkrankungen fügen Sie sechs Mikroliter einer ein bis zwei Vormischungen aus 100 millimolaren Spermien und 50 % Polyethylenglykol 8.000 hinzu. Nach dem Mischen des Inhalts wird bei 2.000 g für zwei Sekunden in einer Mini-Zentrifuge auf der Arbeitsplatte gezentrifugert.
Nun mischen Sie zwei Mikroliter eines millimolaren DFHBI-1T zur Reaktion und zentrifugieren Sie erneut. Laden Sie die Reaktion in ein Glaskammer-Deckglas. Inkubieren Sie die Kammer vier Stunden lang bei Zimmertemperatur im Dunkeln mit aufgesetztem Deckel, um die Verdunstung zu minimieren.
Laden Sie das Glaskammer-Deckglas auf die Mikroskop-Bühne. Schalte den Laser ein und nutze dann die Okularstücke, um die Probe zu lokalisieren und zu fokussieren. Konfigurieren Sie das Mikroskop so, dass jede interessante Region zuerst mit dem Cyanin-5-Kanal an jeder Z-Ebene abbildet.
Dann bilde ich denselben Interessensbereich mit dem grünen fluoreszierenden Proteinkanal ab. Stellen Sie die Belichtungszeit für alle Kanäle auf 500 Millisekunden ein. Dann stellen Sie die Laserleistung auf 80 % für den grünen fluoreszierenden Proteinkanal und 40 % für den Cyanin-5-Kanal ein.
Mit einer Z-Schrittweite von 150 Nanometern bilden Sie bei Raumtemperatur eine Überdeckungszone außerhalb des Reaktionstropfens ab. Anschließend quantifizieren Sie die intermolekulare Basenpaarung mit Bildanalysesoftware. Bei der Induktion der RNA-Clusterbildung bildeten beide RNAs entweder einzeln oder gemeinsam.
Die DFHBI-1T-Fluoreszenz innerhalb von RNA-Clustern war für obere oder untere RNAs allein deutlich niedriger als bei der Co-Faltungsbedingung. Im separaten Faltungszustand betrug das normalisierte DFHBI-1T-Signal 0,031, vergleichbar mit den Basiswerten, die allein oben oder unten beobachtet wurden. Shu-top, shu-bottom, shu-anti-top und shu-anti-bottom zeigten einzeln minimale DFHBI-1T-Fluoreszenz.
Das Zusammenfalten von Shu-Top mit Shu-Bottom oder Shu-Anti-Top mit Shu-Anti-Bottom erzeugte ein höheres DFHBI-1T-Signal als das separate Falten. Die Kofaltung von Shu-Top und Shu-Bottom führte zu einer 5,63-fachen Erhöhung der normalisierten DFHBI-1T-Fluoreszenz. Die getrennte Faltung von Shu-Top und Shu-Bottom zeigte nur eine 1,04-fache Steigerung, vergleichbar mit den Ausgangswerten.
Shu-Top gemischt mit Shu-Anti-Bottom und Shu-Anti-Top gemischt mit Shu-Bottom, zeigte unter beiden Faltungsbedingungen eine höhere DFHBI-1T-Fluoreszenz als Paare derselben Orientierung. Die Kofaltung von shu-top mit shu-anti-bottom und shu-anti-top mit shu-bottom führte zu 61,86 bzw. 82,60-fachen Zuwächsen der DFHBI-1T-Fluoreszenz. Eine separate Faltung dieser gemischten Paare führte zu kleineren Zuwächsen von 2,69 bzw. 4,94 Falten.
Der wichtigste Aspekt ist, dass eine robuste Signalerzeugung Crowding-Reagenzien erfordern kann, während die Empfindlichkeit von effizienter Dimerisierung und Faltung von gespaltenen Brokkoli-RNAs abhängt. Dieser Test ergänzt RNA-Pull-Down- und Gelelektrophorese-Ansätze zur Untersuchung der intermolekularen Basenpaarung in RNA-Clustern. Dieser Test kann die Auswirkungen von RNA-Sequenzen, Helikosen und Ionen auf die intermolekulare Basenpaarung innerhalb von RNA-Clustern untersuchen.
Overview
This article presents a protocol for directly detecting and quantifying intermolecular base pairing in RNA clusters in vitro using a split Broccoli RNA reporter assay. The method leverages fluorescently labeled RNAs and a split aptamer system to visualize and measure RNA–RNA interactions, providing a quantitative alternative to chemical probing and computational predictions.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- RNA biochemistry
- Fluorescence microscopy
Background
- RNA clustering is driven by multivalent intermolecular RNA–RNA interactions.
- Traditional methods like chemical probing and computational simulations infer but do not directly measure these interactions.
- Direct assessment of intermolecular base pairing within RNA clusters has been limited.
- The split Broccoli RNA aptamer system enables fluorescence-based detection of RNA dimerization.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a visual assay for direct detection of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- To quantify how in vitro clustering conditions affect RNA–RNA interactions.
- To provide a complementary approach to existing RNA interaction assays.
Methods Used
- Preparation of DNA templates and in vitro transcription of RNAs labeled with Cy5.
- Purification of transcribed RNAs using phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation.
- Folding of RNAs under co-folding and separate folding conditions with crowding reagents (spermine, PEG 8000).
- Assembly of split Broccoli RNA reporters and addition of DFHBI-1T fluorophore.
- Fluorescence imaging using confocal microscopy and quantitative image analysis.
Main Results
- DFHBI-1T fluorescence was substantially higher in co-folded RNA samples compared to separately folded or single RNA controls.
- Co-folding of complementary split Broccoli RNAs resulted in up to 82.6-fold increases in fluorescence, indicating robust intermolecular base pairing.
- Mixed orientation pairs (shu-top with shu-anti-bottom, etc.) showed the highest fluorescence increases upon co-folding.
- Robust signal generation depended on crowding reagents and efficient RNA dimerization.
Conclusions
- The split Broccoli RNA reporter assay enables direct, quantitative assessment of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- This method complements traditional RNA interaction assays such as pull-downs and gel electrophoresis.
- The assay can be used to study the effects of RNA sequence, helicases, and ions on RNA–RNA interactions in vitro.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Direct quantification of intermolecular RNA base pairing in vitro addresses a critical gap in early discovery, enabling mechanistic de-risking of RNA-driven clustering phenomena. The split Broccoli RNA reporter assay provides a quantitative, fluorescence-based readout for RNA–RNA interactions, supporting predictive confidence in target validation and assay development. This capability enhances portfolio triage by clarifying the molecular basis of RNA clustering under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of RNA–RNA interaction hypotheses within clustered assemblies.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing specific intermolecular base pairing from background association.
- Provides quantitative data to inform target validation and early-stage portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated RNA cluster systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible fluorescence outputs for assay benchmarking.
- Enables reliable evaluation of sequence, helicase, or ionic effects on RNA–RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant RNA clustering models when mechanistic continuity is required.
- Supports risk-adjusted advancement by providing quantitative, comparative readouts across experimental conditions.
- Offers predictive de-risking for RNA-targeted therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven target validation through assay development and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantifies direct intermolecular base pairing, clarifying RNA clustering mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative fluorescence outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables statistical comparison of folding conditions and sequence variants using normalized fluorescence measurements.
- Translational Research: Supports continuity by modeling RNA–RNA interactions relevant to disease or therapeutic context.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse RNA interaction studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA clustering studies.
- Operational Value: Standardizes detection and quantification of RNA–RNA interactions for scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for RNA-targeted assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on direct, quantitative mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biochemistry and fluorescence microscopy.
- Needs access to confocal imaging and quantitative image analysis infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of RNA preparation and folding protocols.
- May require adaptation for different RNA sequences or clustering models.
- Sensitivity depends on efficient dimerization and folding of split Broccoli RNAs and use of crowding reagents.
