Name: Visualisierung und Quantifizierung der intermolekularen RNA-Basenpaarung in in vitro RNA-Clustern mit gespaltenen Brokkoli-RNA-Reportern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-29T16:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Erfahren Sie die direkte Quantifizierung intermolekularer RNA-Basenpaarung in RNA-Clustern mit dem gespaltenen Broccoli-RNA-Reporter-Assay. Diese Methode nutzt Fluoreszenzmikroskopie für präzise Messungen in vitro.

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	<li>Jain, A., Vale, R. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+phase+transitions+in+repeat+expansion+disorders.">RNA phase transitions in repeat expansion disorders.</a> Nature. 546, 243-247 (2017).</li><li>Langdon, E. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+structure+determines+specificity+of+a+polyQ-driven+phase+separation.">mRNA structure determines specificity of a polyQ-driven phase separation.</a> Science. 360, 922-927 (2018).</li><li>Tauber, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+RNA+condensation+by+the+DEAD-box+protein+eIF4A.">Modulation of RNA condensation by the DEAD-box protein eIF4A.</a> Cell. 180, 411-426 (2020).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+intermolecular+base+pairing+in+Drosophila+germ+granules+by+mRNA+folding+and+its+implications+in+fly+development.">Controlling intermolecular base pairing in Drosophila germ granules by mRNA folding and its implications in fly development.</a> Nat Commun. 16, 8135 (2025).</li><li>Van Treeck, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+self-assembly+contributes+to+stress+granule+formation+and+defining+the+stress+granule+transcriptome.">RNA self-assembly contributes to stress granule formation and defining the stress granule transcriptome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115, 2734-2739 (2018).</li><li>Bose, M., Rankovic, B., Mahamid, J., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+architectural+role+of+specific+RNA&#8211;RNA+interactions+in+oskar+granules.">An architectural role of specific RNA&#8211;RNA interactions in oskar granules.</a> Nat Cell Biol. 26, 1934-1942 (2024).</li><li>Jambor, H., Brunel, C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+oskar+3&#8242;+UTRs+promotes+hitchhiking+for+RNA+localization+in+the+Drosophila+oocyte.">Dimerization of oskar 3&#8242; UTRs promotes hitchhiking for RNA localization in the Drosophila oocyte.</a> RNA. 17, 2049-2057 (2011).</li><li>Majumder, S., Coupe, S., Fakhri, N., Jain, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-encoded+intermolecular+base+pairing+modulates+fluidity+in+DNA+and+RNA+condensates.">Sequence-encoded intermolecular base pairing modulates fluidity in DNA and RNA condensates.</a> Nat Commun. 16, 4258 (2025).</li><li>Nguyen, H. T., Hori, N., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensates+in+RNA+repeat+sequences+are+heterogeneously+organized+and+exhibit+reptation+dynamics.">Condensates in RNA repeat sequences are heterogeneously organized and exhibit reptation dynamics.</a> Nat Chem. 14, 775-785 (2022).</li><li>Poudyal, R. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequence+and+structure+control+assembly+and+function+of+RNA+condensates.">RNA sequence and structure control assembly and function of RNA condensates.</a> RNA. 27, 1589-1601 (2021).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2&#8242;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2&#8242;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct, versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nat Protoc. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Zubradt, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMS-MaPseq+for+genome-wide+or+targeted+RNA+structure+probing+in+vivo.">DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo.</a> Nat Methods. 14, 75-82 (2017).</li><li>Nguyen, H. T., Hori, N., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+simulations+for+RNA+folding+in+mixtures+of+monovalent+and+divalent+cations.">Theory and simulations for RNA folding in mixtures of monovalent and divalent cations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116, 21022-21030 (2019).</li><li>Maity, H., Nguyen, H. T., Hori, N., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odd&#8211;even+disparity+in+the+population+of+slipped+hairpins+in+RNA+repeat+sequences+with+implications+for+phase+separation.">Odd&#8211;even disparity in the population of slipped hairpins in RNA repeat sequences with implications for phase separation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 120, e2301409120 (2023).</li><li>Liao, J. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intermolecular+base+pairing+using+AMT+crosslinking+in+mammalian+cells+during+oxidative+stress.">Characterization of intermolecular base pairing using AMT crosslinking in mammalian cells during oxidative stress.</a> bioRxiv. , (2025).</li><li>Kirsch, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+the+detection+of+mRNA&#8211;sRNA+interactions+using+AMT-crosslinking+in+vitro.">A streamlined protocol for the detection of mRNA&#8211;sRNA interactions using AMT-crosslinking in vitro.</a> Biotechniques. 67, 178-183 (2019).</li><li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+eukaryotic+RNA+interactomes+reveals+principles+of+higher-order+organization+and+regulation.">In vivo mapping of eukaryotic RNA interactomes reveals principles of higher-order organization and regulation.</a> Mol Cell. 62, 603-617 (2016).</li><li>Alam, K. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+split+aptamer+for+visualizing+RNA&#8211;RNA+assembly+in+vivo.">A fluorescent split aptamer for visualizing RNA&#8211;RNA assembly in vivo.</a> ACS Synth Biol. 6, 1710-1721 (2017).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+transcription+of+nucleic+acids+with+efficient+T7+promoters.">Maximizing transcription of nucleic acids with efficient T7 promoters.</a> Commun Biol. 3, 439 (2020).</li><li>Imburgio, D., Rong, M., Ma, K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+promoter+recognition+and+start+site+selection+by+T7+RNA+polymerase+using+a+comprehensive+collection+of+promoter+variants.">Studies of promoter recognition and start site selection by T7 RNA polymerase using a comprehensive collection of promoter variants.</a> Biochemistry. 39, 10419-10430 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Shanaa, O. A., Rumyantsev, A., Sambuk, E., Padkina, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+production+of+RNA+aptamers+and+nanoparticles:+problems+and+prospects.">In vivo production of RNA aptamers and nanoparticles: problems and prospects.</a> Molecules. 26, (2021).</li><li>Rangan, P., DeGennaro, M., Jaime-Bustamante, K., Coux, R. X., Martinho, R. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+control+of+germ-plasm+RNAs.">Temporal and spatial control of germ-plasm RNAs.</a> Curr Biol. 19, 72-77 (2009).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+self-assembly+of+germ+granule+mRNAs+into+homotypic+clusters.">Sequence-independent self-assembly of germ granule mRNAs into homotypic clusters.</a> Mol Cell. 78, 941-950 (2020).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ViennaRNA+package+2.0.">ViennaRNA package 2.0.</a> Algorithms Mol Biol. 6, 26 (2011).</li><li>Filonov, G. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution.">Broccoli: rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> J Am Chem Soc. 136, 16299-16308 (2014).</li><li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+Spinach.">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of Spinach.</a> J Am Chem Soc. 136, 1198-1201 (2014).</li><li>Guet, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Spinach-tagged+RNA+and+gene+localization+to+image+gene+expression+in+live+yeast.">Combining Spinach-tagged RNA and gene localization to image gene expression in live yeast.</a> Nat Commun. 6, 8882 (2015).</li><li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch.">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E2756-E2765 (2015).</li><li>Zinskie, J. A., Roig, M., Janetopoulos, C., Myers, K. A., Bruist, M. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+small+nucleolar+RNA+tagged+with+the+broccoli+aptamer+in+yeast.">Live-cell imaging of small nucleolar RNA tagged with the broccoli aptamer in yeast.</a> FEMS Yeast Res. 18, (2018).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>1M MgCl2</td><td>Millipore Sigma</td><td>M1028</td><td>Verwendet zur Vorbereitung von 10&-mal; RNA-Umfaltungspuffer.</td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9640G</td><td>Verwendet zur Vorbereitung von 10&-mal; RNA-Umfaltungspuffer.</td></tr><tr><td>50% PEG 8000</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td>Komponente des T4-RNA-Ligase-Kits; als molekulares Crowding-Reagenz zur Induzierung von RNA-Clustering verwendet.&nbsp;</td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol, 200 Proof</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>T038181000CS</td><td>Verwendet zur Herstellung eines RNA-Waschpuffers.</td></tr><tr><td>Säurephenol: Chloroform, pH 4,5 (mit IAA, 125:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9722</td><td>Zur RNA-Reinigung verwendet.</td></tr><tr><td>Aminoallyl-UTP-Cy5</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-821-CY5</td><td>Verwendet zur RNA-Markierung während der In-vitro-Transkription.</td></tr><tr><td>Kammerabdeckglas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409PK</td><td>Bildgebungskammer für RNA-Clustering-Reaktionen.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C298-500</td><td>Zur RNA-Reinigung verwendet.</td></tr><tr><td>DFHBI-1T</td><td>Lucerna</td><td>410</td><td>Verwendet als Fluorophor zum Nachweis von Brokkoli-RNA-Aptamer.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D12345</td><td>Wasserfrei; Molekularbiologie-Note; verwendet für die DFHBI-1T-Vorbereitung.&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Clean & Konzentrator-Kit</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td>Wird zur Bereinigung von DNA-Produkten vor der T7-Transkription verwendet.</td></tr><tr><td>DNA-Gel-Extraktionsset</td><td>NEB</td><td>T1020L</td><td>Wird zur Gel-Extraktion verwendet.</td></tr><tr><td>Trockenbad</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td>Verwendet zum Erhitzen von RNA-Proben in Mikrozentrifugenröhren.</td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ</td><td>NIH (National Institutes of Health)</td><td>N/A</td><td>Open-Source-Bildanalysesoftware; zur Quantifizierung der Fluoreszenzintensität und ROI-Analyse verwendet.</td></tr><tr><td>Gel-Elektrophorese-System&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B2-BP</td><td>Verwendet zur Durchführung der DNA-Gel-Elektrophorese.</td></tr><tr><td>Gel-Ladefarbe, lila (6& mal;)</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td>Wird als Ladefarbe für die DNA-Gel-Elektrophorese verwendet.</td></tr><tr><td>Sofortiges strukturiertes Beleuchtungsmikroskop</td><td>VisiTech international</td><td>VT-iSIM</td><td>Ein konfokales Mikroskop, das in der Lage ist, GFP und Cy5-Fluoreszenz abzubilden.&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>327272500</td><td>Zur RNA-Reinigung verwendet.</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transkriptionsset</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM1334</td><td>Verwendet für die In-vitro-Transkription von T7. Das Kit enthält Nukleotidlösungen (ATP, CTP, GTP, UTP) und DNase.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhren</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-284</td><td>1,5-mL-Röhre; zur Speicherung von DNA-Vorlagen für in vitro-Transkription, RNA-Produkte und Aliquoten von Spermin und DFHBI-1T.&nbsp verwendet; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Mini-Zentrifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>Z763845</td><td>Wird für kurze Zentrifugation verwendet.</td></tr><tr><td>Nanodrop-Eins-Spektrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518</td><td>Mikrovolumen-Spektrophotometer zur Messung der DNA- und RNA-Konzentration und -Qualität.</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9937</td><td>Verwendet zur Resuspension von RNA-Pellets, zur Herstellung von RNA-Wasch- und Faltpuffern sowie zur Verdünnung von Spermin und DFHBI-1T.</td></tr><tr><td>Online-Molmassenrechner</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>N/A</td><td>Online-Tool zur Berechnung der RNA-Masse aus molaren Größen (z. B. pmol).</td></tr><tr><td>Polypropylen-PCR-Röhren</td><td>Corning</td><td>3745</td><td>200 & mu; L-PCR-Röhrchen, die für PCR, In-vitro-Transkription und RNA-Clustering-Reaktionen verwendet werden</td></tr><tr><td>PowerPac Grundstromversorgung</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td>Verwendet zur Durchführung der DNA-Gel-Elektrophorese.</td></tr><tr><td>Proflex PCR-Wärmezyklus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>44-840-73</td><td>Verwendet für PCR, in-vitro-Transkription und das Erhitzen von RNA-Proben in PCR-Röhrchen.</td></tr><tr><td>F5 High-Fidelity 2& Mal; Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>Verwendet als 2&-mal; High-Fidelity-Mastermix.</td></tr><tr><td>Gekühlte Zentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Verwendet zur RNA-Reinigung und Pelletierung.&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase-Dekontaminationslösung</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9782</td><td>Wird zur Reinigung von Laborbänken und Oberflächen verwendet, um eine RNase-Kontamination zu minimieren.</td></tr><tr><td>Spermin&nbsp; Tetrahydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141-1G</td><td>Verwendet zur Induzierung von RNA-Clustering.</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Verwendet zur Herstellung des Tris-Puffers (pH 7,0).</td></tr><tr><td>Ultrareine Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>16500500</td><td>Verwendet für DNA-Gel-Elektrophorese.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

visualisierung und quantifizierung der intermolekularen rna-basenpaarung in in vitro rna-clustern mit gespaltenen brokkoli-rna-reportern

Visualization and Quantification of Intermolecular RNA Base Pairing in in vitro RNA Clusters Using Split Broccoli RNA Reporters

Visualisierung und Quantifizierung der intermolekularen RNA-Basenpaarung in in vitro RNA-Clustern mit gespaltenen Brokkoli-RNA-Reportern

RNA clustering, driven by multivalent intermolecular RNA&#8211;RNA interactions, can occur in vitro in the absence of proteins. While chemical probing and ...

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