Vergleichende RNA-Strukturanalyse von entjungen und reifen Transkripten in Saccharomyces cerevisiae

Wir untersuchten die Verarbeitung von kotranskriptionaler RNA, einschließlich der Frage, wie sich entstehende RNA faltet, wenn sie aus der RNA-Polymerase entsteht, die sie synthetisiert. Vor dieser Methode konnten wir nicht überwachen, wie sich RNA während der Synthese faltet, was uns in unserer Forschung zurückhielt. Diese neue Methode überwindet also diese Lücken.

CoSTseq wurde entwickelt, um die entstehende RNA-Faltung in Hefen zu untersuchen. Es ist besonders effektiv zur Analyse sehr häufiger RNAs. Zu Beginn inokulieren Sie den Saccharomyces cerevisiae-Stamm BY4741 in 50 Millilitern YPAD-Medium und inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius mit einem Schütteln von 200 Umdrehungen pro Minute, bis die Kultur die mittlere Logaritma-Phase erreicht.

Sammeln Sie etwa drei Milliliter Hefekultur entsprechend 1,8 optischen Dichteeinheiten und zentrifugieren Sie mit 2.500 x g für drei Minuten bei vier Grad Celsius mit einer vorgekühlten Zentrifuge. Entsorgen Sie das Supernatant in einen Abfallbehälter. Das Pellet in 10 Millilitern kaltem PBS erneut suspendieren und erneut bei 2.500 x g für drei Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Entfernen Sie das Supernatant und legen Sie das Hefepellet auf Eis. Lassen Sie das Hefepellet vorsichtig in 10 Millilitern kaltem 0,5%-Sarkosyl aufhängen, ohne Blasen zu erzeugen. Inkubieren Sie die neu suspendierte Hefe 20 Minuten auf Eis, um eine Permeation zu ermöglichen, dann pelletieren Sie die Zellen bei 400 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und suspendieren Sie die durchlässigen Hefezellen in 100 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser mit einer P-1000-Pipette wieder.

Bereiten Sie eine Arbeitslösung aus 2,5-fachem Transkriptionspuffer mit frisch zugesetztem fünf-millimolaren Dithiothreitol vor und verheizen Sie den 2,5-fachen Struktur-Sondpuffer auf 30 Grad Celsius vor. In einem sauberen Zwei-Milliliter-Röhrchen alle erforderlichen Reaktionskomponenten hinzufügen und gründlich mischen. Als Nächstes geben Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Hefezellen in das Reaktionsrohr und inkubieren Sie sie im Thermomixer auf 30 Grad Celsius eingestellt, wobei Sie zwei Minuten lang mit 500 Umdrehungen pro Minute schütteln.

Dann fügen Sie schnell 200 Mikroliter des vorgewärmten 2,5X-Struktur-Sondpuffers und gleichzeitig 25 Mikroliter Dimethylsulfat-Reagenz hinzu. Wirbeln Sie das Rohr vorsichtig in zwei Impulsen und setzen Sie es zurück in den Inkubator, eingestellt auf 30 Grad Celsius und 500 Umdrehungen pro Minute. Inkubieren Sie weiter auf dem Thermomixer für vier Minuten, mit 30 Sekunden Abstand zwischen den Proben.

Bereiten Sie die Stop-and-Wasch-Puffer im Voraus vor und legen Sie sie bis zur Nutzung auf Eis. Stoppen Sie die Dimethylsulfatmethylierung, indem Sie einen Milliliter Stopppuffer in das Reaktionsrohr geben. Zentrifugieren Sie nun die mit Dimethylsulfat beschrifteten Proben bei 3.500 x g für fünf Minuten in einer vorabgekühlten Zentrifuge.

Nach dem Drehen entsorgen Sie das Überlagerungsmittel in einen geeigneten Abfallbehälter. Gib dem Pellet einen Milliliter gekühlten Waschpuffer hinzu und suspendiere es erneut. Wiederhole die Zentrifugation bei 3.500 x g für fünf Minuten.

Beginnen Sie sofort mit der RNA-Extraktion und frieren Sie das Hefepellet nicht ein. Suspendiere das mit Dimethylsulfat markierte Hefepellet in 600 Mikrolitern RNA-Lysepuffer und transferiere die Suspension dann in ein Rohr mit 40 Mikrolitern 20%-Natriumdodecylsulfat. Inkubieren Sie die Probe bei 65 Grad Celsius für 30 Sekunden, mit einem Schütteln von 950 Umdrehungen pro Minute.

Als Nächstes wird die Phenol-Chloroform-Extraktion der RNA nach dem Standardverfahren durchgeführt. Wirbeln die Streptavidin-Magnetperlen und übertragen 44 Mikroliter der Perlen auf ein neues Röhrchen für jede Probe von 80 Mikrogramm Gesamt-RNA. Legen Sie die magnetischen Perlen auf ein magnetisches Regal, bis die Perlen sich gesetzt haben.

Nach dem Entfernen des Aufbewahrungspuffers werden die Perlen in einem Milliliter Vorwaschpuffer A wieder aufgehängt. Nun die Suspension zwei Minuten lang bei Zimmertemperatur inkubieren, dann magnetisieren und das Supernatant entfernen. Nach dem Waschen werden die Perlen in 88 Mikrolitern 2X-Bindungspuffer wieder aufgehängt. Übertragen Sie 80 Mikroliter der Suspension in ein steriles 1,5-Milliliter-Rohr mit 80 Mikrogramm biotinylierter RNA-Probe in 80 Mikrolitern.

Rotiere die Perlenprobenmischung 20 Minuten lang auf einem Rotator bei Raumtemperatur. Anschließend wird das Röhrchen auf das magnetische Rack gesetzt, um den Fluss durch ausgereifte RNA aufzufangen und für die Fällung aufzubewahren, um eine Poly-A-Auswahl reifer RNAs mit DMS-MaPseq-Workflow durchzuführen. Anschließend wird der perlennaszente RNA-Komplex zweimal mit 500 Mikrolitern Salzpuffer gespült.

Dann einmal mit 500 Mikrolitern 1-fachem Bindungspuffer abspülen, gefolgt von einer letzten Spülung mit 500 Mikrolitern Salzarmpuffer. Fügen Sie nun 300 Mikroliter RNA-Reagenz zum Bead=nascent RNA-Komplex hinzu, resuspendieren Sie gründlich und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf dem Thermomixer bei 60 Grad Celsius. Als Nächstes geben Sie 60 Mikroliter Chloroform, Vortex, und inkubieren Sie drei Minuten bei Zimmertemperatur.

Zentrifugiere die Probe bei 14.000 x g für fünf Minuten in der vorkühlten Zentrifuge. Schließlich wird die obere wässrige Phase etwa 180 Mikroliter in ein neues Sammelrohr übertragen. Verwerfen Sie die verbleibende organische Phase und lassen die Perlen sowie die verbleibende wässrige Lösung zurück.

Nach der Reinigung der entstehenden RNA führen Sie eine Template-Switching-Reverse-Transkription durch, ligieren den 5'-Adapter und wählen Bibliotheken für die Sequenzierung aus. Die Visualisierung der Test-PCR-Produkte auf einem 1%-Agarose-Gel zeigte eine minimale Primer-Dimerbildung und einen charakteristischen Abstrich von etwa 300 Basenpaaren für die Co-transkriptionelle Struktur-Tracking-Sequenzierung oder CoSTseq- und DMS-MaPseq-Bibliotheken. Das Elektropherogramm von CoSTseq Probe eins bestätigte die Bibliotheksgrößenverteilung mit einem Spitzenwert von etwa 285 Basenpaaren.

Die Ausrichtung von ASC1-mRNA zeigte, dass die CoSTseq-Bibliothek eine Abdeckung über das gesamte Intron umfasste, was bestätigt, dass die RNA noch jung ist. Während die DMS-MaPseq-Bibliothek keine Intron-Abdeckung aufwies, was darauf hindeutet, dass die RNA reif ist. Die cot-transkriptionelle Faltungsmatrix von 18S vor rRNA zeigte, dass die DMS-Reaktivität abrupte Veränderungen zeigte, als die RNA-Polymerase von Position 790 bis 811 entlang des rDNA-Lokus voranschritt.

Die DMS-Reaktivitätsanalyse von ADH1-mRNA zeigte ähnliche Profile zwischen jungen und reifen Formen, was auf strukturelle Stabilität hinweist. Im Gegensatz dazu zeigte SSA2-mRNA Regionen unterschiedlicher DMS-Reaktivität zwischen jungen und reifen Formen, was auf strukturelle Veränderungen während der Reifung hindeutet. Mit CoSTseq können Forscher in vivo entstehende RNA-Sekundärstrukturen und die Position der RNA-Polymerase entlang RNA-Transkripten bestimmen.

CoSTseq hat zeitkritische Schritte und verwendet giftige Chemikalien. Es ist besser, nicht mehr als zwei Proben gleichzeitig zu verarbeiten. Aus der Gesamtmenge der aus CoSTseq erzeugten RNA können nicht-biotinylierte RNAs für gleichzeitige reife Struktursonde mit traditionellem DMS-MaPseq verwendet werden.