Name: Überwachung der Stub1-vermittelten Pexophagie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie, wie Stub1-vermittelte Pexophagie in lebenden menschlichen SHSY5Y- und Maus-NIH-3T3-Zellen mittels konfokaler Mikroskopie untersucht wird. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung von Protein-Dynamiken bei oxidativen Stress.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch ein Forschungsstipendium MOST 111-2311-B-001-019-MY3 des National Science and Technology Council in Taiwan unterstützt.

1. Präparation von Zellen, die diKillerRed oder selbstmarkierende Proteine (SLPs) im Peroxisomlumen exprimieren
<ol><li>Säen Sie die gewünschten Zellen auf Zellkulturschalen mit Glasboden. Für das hier durchgeführte Experiment werden 2 x 105 humane SHSY5Y-Zellen in 840 μl Nährmedium (DMEM/F-12 ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin) oder 6 x 104 NIH3T3-Mäusezellen in 840 μl Nährmedium (DMEM ergänzt mit 10 % Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin) auf einer 35-mm-Kulturschale mit einem Glasmikroloch mit 20 mm Durchmesser aussaatgut. Anmerkungen: Die Anzahl der ausgesäten Zellen sollte proportional zur Glasmikrotiterfläche angepasst werden, wenn Glasbodenschalen mit anderen Spezifikationen verwendet werden.</li>
	<li>Züchten Sie die Zellen 24 h lang unter 5% CO2/37 °C.</li>
	<li>Transfizieren Sie die Zellen mit den gewünschten Plasmiden unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes.<ol><li>Verwenden Sie PMP34-TagBFP, um die Peroxisomen in lebenden Zellen zu markieren. Verwenden Sie entweder peroxisom-gerichtete diKillerRed-VKSKL oder SLP-VKSKL (+ farbstoffmarkierte SLP-Liganden) für die ROS-Erzeugung im Peroxisomlumen (durch lichtaktivierte ROS-Produktion). In diesem Protokoll verwenden wir das selbstmarkierende Protein HaloTag-VKSKL21. Um die Translokation von Stub1/Hsp70, die Akkumulation von ubiquitinierten Proteinen und die Bildung von Autophagosomen auf ROS-gestressten Peroxisomen zu überwachen, transfizieren Sie EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub bzw. EGFP-LC3B. Um die ROS-Erzeugung im peroxisomalen Lumen zu überprüfen, wird diKillerRed-VKSKL mit der Peroxisom-lokalisierten Fluoreszenz-Redox-Sonde roGFP2-VKSKL22 co-transfekiert.</li>
		<li>Für die SHSY5Y-Zelltransfektion werden die Plasmide in 55 μl serumfreiem DMEM/F-12 verdünnt und 1 μl Transfektionsreagenz in 55 μl serumfreiem DMEM/F12 verdünnt. Kombinieren Sie die verdünnte DNA mit dem verdünnten Reagenz. Vorsichtig mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Geben Sie den Komplex in das 20-mm-Mikroloch, das zuvor mit 100 μl Nährmedium für SHSY5Y ohne Antibiotika (DMEM/F-12 mit 10% fötalem Kälberserum) plattiert wurde. Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig hin und her.</li>
		<li>Für die NIH3T3-Zelltransfektion wird das serumfreie DMEM/F-12 durch reduziertes Serummedium ersetzt, um die Plasmide und das Transfektionsreagenz zu verdünnen. Ersetzen Sie das Beschichtungsnährmedium durch SHSY5Y durch Nährmedium für NIH3T3-Zellen ohne Antibiotika (DMEM mit 10% Kälberserum).</li>
	</ol></li>
	<li>Entfernen Sie nach 2 Stunden Transfektion das transfektionsreagenzhaltige Medium und fügen Sie 1 ml frisches Nährmedium hinzu. Inkubieren Sie die NIH3T3- oder SHSY5Y-Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h. HINWEIS: Zur Untersuchung der Stub1-vermittelten Pexophagie können auch andere Zelllinien verwendet werden (z. B. HeLa-Zellen).</li>
</ol>2. Färbung von Peroxisomen mit farbstoffmarkierten SLP-Liganden (für lichtaktivierte ROS-Produktion)
<ol><li>Entfernen Sie 24 Stunden nach der Transfektion das Nährmedium und geben Sie 100 μl 200 nM HaloTag TMR-Ligand oder 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag-Ligand auf die 20-mm-Glasmikrovertiefung. HINWEIS: Die farbstoffmarkierten SLP-Liganden sollten mit dem jeweiligen Kulturmedium für jede Zelllinie verdünnt werden. Wenn Sie sich für Janelia Fluor 646-markierte Liganden entscheiden, werden die blauen, grünen und roten Kanäle für die nachgeschaltete Fluoreszenzbildgebung frei.</li>
	<li>Übertragen Sie die Schüssel in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 . 1 Stunde färben. Entfernen Sie nach 1 Stunde das Färbemedium gründlich und fügen Sie 1 ml frisches Nährmedium hinzu.</li>
</ol>3. ROS-Beanspruchung von Peroxisomen an einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop
<ol><li>Stellen Sie eine Schale mit Glasboden und den gewünschten Zellen auf ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem Tischinkubator ausgestattet ist.</li>
	<li>Klicken Sie auf Werkzeugfenster, wählen Sie Okular und klicken Sie auf die DIA-Schaltfläche (Abbildung 2A), um das Durchlicht einzuschalten. Betrachten Sie die Schüssel durch das Mikroskopokular und bringen Sie die Zellen durch Drehen des Fokusknopfes in den Fokus.</li>
	<li>Wählen Sie LSM und klicken Sie auf die Schaltfläche Dye &; Detector Select (Abbildung 2B). Doppelklicken Sie im Pop-up-Fenster auf die gewünschten Farbstoffe, um die entsprechenden Laser- und Filtereinstellungen für die Abbildung der Zellen auszuwählen (Abbildung 2C). Klicken Sie im Live-Bedienfeld auf Livex4, um ein schnelles Laserscanning zu starten und das Screening nach den Fluoreszenzsignalen der Zellen zu starten (Abbildung 2D).</li>
	<li>Bewegen Sie den Tisch mit dem Joystick-Controller und lokalisieren Sie die medialen diKillerRed-VKSKL- oder SLP-VKSKL-exprimierenden Zellen, um ROS-Stress (auf die Peroxisomen) auszuüben. Erfassen Sie ein Bild der gewünschten Zelle.</li>
	<li>Klicken Sie auf Werkzeugfenster und wählen Sie LSM-Stimulation (Abbildung 2E). Klicken Sie auf die Schaltfläche Ellipse und zeichnen Sie im Livebildfenster mit der Maus einen kreisförmigen ROI von 15 μm Durchmesser (Abbildung 2F), der die gewünschten Peroxisomen enthält, die in Schritt 3.4 erfasst wurden und auf die ROS-Spannung angewendet wird (siehe Abbildung 3 für ein Beispiel).</li>
	<li>Um ROS-Stress auszuüben, verwenden Sie 561 nm für Zellen mit dem diKillerRed-PTS1- oder TMR-markierten SLP-Liganden und 640 nm für Zellen, die mit dem Janelia Fluor 646-markierten SLP-Liganden gefärbt sind.</li>
	<li>Wählen Sie die Laserwellenlänge für die Aufbringung der ROS-Spannung. Geben Sie den gewünschten Laserprozentsatz und die Dauer ein (Abbildung 2G).</li>
	<li>Klicken Sie auf " Erfassen" und dann auf die Schaltfläche " Stimulation" (Abbildung 2H), um den Scanvorgang mit 561/640 nm Licht durch die ROIs für jeweils 30 s zu starten. Dies entspricht einer Einstellung von ~5% Laserleistung sowohl für 561 nm als auch für 640 nm am hier verwendeten konfokalen Mikroskop. Dieser Vorgang wird zur ROS-Produktion in den Peroxisomen führen. HINWEIS: Man kann ROIs unterschiedlicher Größe auswählen. Man sollte die Beleuchtungszeit für jeden ROI proportional entsprechend seiner Fläche anpassen.</li>
	<li>Nach 30 s Laserbeleuchtung haben Peroxisomen innerhalb der ROIs ihre diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646 Signale verloren. Dieser Signalverlust ermöglicht es, die beleuchteten von den nicht beleuchteten Peroxisomen (beschädigt vs. gesund) innerhalb einer Zelle zu unterscheiden.</li>
</ol>4. Überwachung der Pexophagie in lebenden Zellen durch Zeitraffer-Bildgebung
<ol><li>Verfolgen Sie die Translokation von EGFP-markierten Stub1, Hsp70, Ub, p62 oder LC3B auf die beleuchteten/ROS-gestressten Peroxisomen durch Zeitrafferaufnahmen in 10-Minuten-Intervallen zwischen den Bildern (Beispiele siehe Abbildungen 3-7). HINWEIS: EGFP-Stub1- oder EGFP-Hsp70-Signale beginnen 10-20 Minuten nach der Beleuchtung zu erscheinen und bleiben auf allen beschädigten Peroxisomen bis ~40 Minuten nach der Beleuchtung. Die EGFP-Ub-Signale erscheinen 30 Minuten nach der Beleuchtung und dauern 2-3 h an. Die EGFP-p62-Translokation erscheint 60 Minuten nach der Belichtung, und die EGFP-LC3B-Signale werden ~3 h nach der Beleuchtung sichtbar.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die EGFP-Signale auf den beschädigten Peroxisomen (von Stub1, Ub, p62 oder LC3B) mit ImageJ. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um ImageJ zur Quantifizierung eines Dreikanalbildes (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL) zu quantifizieren.<ol><li>Öffnen Sie das Bild und wenden Sie elliptische Auswahlen oder Freihandauswahlen an, um den Bereich einzuschließen, der alle beleuchteten Peroxisomen enthält (PMP34-TagBFP-Signal positiv und HaloTag-Ligandensignal gebleicht; Abbildung 8A).</li>
		<li>Klicken Sie auf Duplizieren , um den PMP34-TagBFP-Kanal auszuwählen (Abbildung 8A). Legen Sie einen Schwellenwert über das Dropdown-Menü Bild > Passen Sie > Schwellenwert an , um die Peroxisomen zu markieren (Abbildung 8B).</li>
		<li>Wählen Sie " Analysieren" > "Partikel analysieren ", um die genauen Bereiche der beleuchteten Peroxisomen zu bestimmen. ImageJ zeichnet diese Regions of Interest (ROIs) im ROI-Manager auf (Abbildung 8C).</li>
		<li>Klicken Sie auf Duplizieren , um den EGFP-Kanal für die Analyse des Fluoreszenzsignals von EGFP-konjugiertem Ub, p62 oder LC3B auszuwählen (Abbildung 8D). Wählen Sie alle ROIs im ROI-Manager aus (Abbildung 8E).</li>
		<li>Wenden Sie Measure im ROI-Manager an, um die EGFP-Signale auf den Peroxisomen zu messen (Abbildung 8E). Ermitteln Sie den Wert der Fläche und der integrierten Dichte (die Summe aller Pixelintensitäten) für jede ROI in der Ergebnistabelle (Abbildung 8E).</li>
		<li>Um die durchschnittlichen EGFP-Fluoreszenzintensitäten zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Beleuchtung zu erhalten, dividieren Sie die integrierte EGFP-Intensität durch die Gesamtfläche der beleuchteten Peroxisomen (PMP34-TagBFP-Signal-positive und HaloTag-Liganden-Signal-negative Bereiche). Um das akkumulierte Signal auf den Peroxisomen zu erhalten, subtrahieren Sie die gemittelte Intensität zu einem bestimmten Zeitpunkt von der gemittelten Intensität zum Zeitpunkt = 0 und normalisieren Sie dann um die gemittelte Intensität zum Zeitpunkt = 0.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Globale Schädigung aller Peroxisomen (in jeder Zelle) auf einer Kulturschale
<ol><li>Führen Sie Schritt 1 (Präparation von Zellen, die Peroxisom-gerichtetes diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] oder SLP [SLP-VKSKL]) exprimieren) und Schritt 2 (Färbung von Peroxisomen mit dem SLP-Liganden [für lichtaktivierte ROS-Produktion]) durch.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 1 Stunde TMR-markierter Ligandenfärbung das Färbemedium und fügen Sie 1 ml Nährmedium hinzu, das 30 mM 3-AT (3-Amino-1,2,4-triazol; ein Katalasehemmer) enthält. HINWEIS: Katalase ist ein ROS-Fänger, der im Peroxisom-Lumen exprimiert wird, so dass die 3-AT-Behandlung dazu beiträgt, die durch Licht hervorgerufenen oxidativen Schäden an den Peroxisomen zu verstärken.</li>
	<li>Stellen Sie die Kulturschale über eine LED (555-570 nm). Beleuchten Sie alle Zellen mit einer Leistungsdichte von 1,8 W/cm2 für 9 h in einem Inkubator. Anmerkungen: Um diesen Schritt außerhalb eines Inkubators durchzuführen, stellen Sie die Kulturschale auf eine Heizplatte bei 37 °C. Geben Sie 20 mM HEPES in das 3-AT-haltige Medium und decken Sie die Kulturschale mit einer transparenten Folie ab, um den Gasaustausch zu minimieren. HEPES ist ein Puffermittel, das den physiologischen pH-Wert in Zellkulturen außerhalb eines CO2 -Inkubators während der LED-Beleuchtung aufrechterhält.</li>
	<li>Validieren Sie den Erfolg der LED-induzierten Schädigung, indem Sie die EGFP-Ub-, EGFP-p62- oder EGFP-LC3B-Signale auf den Peroxisomen abbilden. Unter Verwendung der oben beschriebenen Beleuchtungsbedingung zeigten 82% der SHSY5Y-Zellen, die HaloTag-VKSKL stabil exprimierten, eine Stub1-vermittelte Pexophagie.</li>
	<li>Ernten Sie die Zellen für die nachgelagerte biochemische Analyse.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Stub1-vermittelte Pexophagie in Zellkulturen ausgelöst werden kann, indem der peroxisomale ROS-Spiegel mit Licht erhöht wird. Da das Protokoll auf farbstoffgestützter ROS-Generierung beruht, muss eine ausreichende Expression von diKillerRed-VKSKL oder farbstoffmarkierten SLP-Liganden in den interessierenden Zellen sichergestellt werden. Angesichts der Tatsache, dass verschiedene Zelltypen oder Zellen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund Peroxisomen mit leicht unterschiedlichen Ei...

Peroxisomen sind an eine einzelne Membran gebundene Organellen, die in den meisten eukaryotischen Zellen vorkommen. Peroxisomen sind ein metabolisches Kompartiment, das für die Beta-Oxidation von sehr langkettigen Fettsäuren, den Purinkatabolismus und die Synthese von Etherphospholipiden und Gallensäuren unerlässlichist 1. Peroxisom-abgeleitetes Acetyl-CoA steuert die Lipidhomöostase, indem es die zentrale Signalübertragung im Stoffwechselreguliert 2. Daher ist es nicht verwunderlich, dass beeinträchtigte peroxisomale Funktionen bei verschiedenen Krankheiten impliziert sind, darunter neurodegenerative Erkrankungen, Alterung, Krebs, Fettleibigkeit und Diabetes 3,4,5. Ein wesentlicher Prozess bei der Aufrechterhaltung der peroxisomalen Operation ist die Pexophagie. Die Pexophagie ist ein kataboler Prozess für den selektiven Umsatz von Peroxisomen durch Autophagie. Zellen nutzen die Pexophagie, um die Quantität und Qualität der Peroxisomen zu kontrollieren und so eine ordnungsgemäße peroxisomale Funktion zu gewährleisten. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass der Peroxisomverlust, der durch Mutationen in den peroxisomalen PEX1-Biogenesefaktoren 1 und 6 verursacht wird, auf eine unkontrollierte Pexophagie zurückzuführenist 6. Bemerkenswert ist, dass 65 % aller Patienten mit Peroxisom-Biogenese-Störung (PBD) einen Mangel im peroxisomalen AAA-ATPase-Komplex aufweisen, der in Säugetierzellen aus PEX1, PEX6 und PEX26 besteht7.
Es gibt eine Reihe von Methoden, um die Pexophagie zu initiieren und zu untersuchen. In Hefe wird die Pexophagie ausgelöst, wenn die zugeführten Nährstoffe von peroxisomabhängigen Kohlenstoffquellen auf peroxisomunabhängige Kohlenstoffquellen umgestellt werden (um die zelluläre Peroxisomzahl zu senken)8. Zum Beispiel induziert der Transfer von Methanol-gezüchteten Pichia pastoris-Zellen von Methanolmedium auf Glukosemedium und Ethanolmedium Mikropexophagie bzw. Makropexophagie 8,9,10. Mikropexophagie sequestrierte gruppierte Peroxisomen für den Abbau, indem sie die Vakuole umbauten, um becherartige vakuoläre Sequestrierungsmembranen und eine deckelartige Struktur zu bilden, die als Mikropexophagie-spezifischer Membranapparat (MIPA) bezeichnet wird. Bei der Makropexophagie werden einzelne Peroxisomen von Doppelmembranstrukturen, den sogenannten Pexophagosomen, umhüllt, gefolgt von einer Fusion mit der Vakuole zum Abbau 8,9,10. Die Phosphorylierung von Pexophagierezeptoren, wie Atg36p in Saccharomyces cerevisiae und Atg30p in Pichia pastoris, ist entscheidend für die Rezeptoren, um die zentrale Autophagie-Maschinerie zu rekrutieren und das peroxisomale Targeting auf Autophagosomen zu erleichtern 8,11.
In Säugetierzellen kann Pexophagie durch Ubiquitinierung induziert werden. Die Markierung der peroxisomalen Membranproteine PMP34 oder PEX3 mit Ubiquitin auf der zytosolischen Seite induziert eine Pexophagie12. Die Überexpression von PEX3 induziert Peroxisom-Ubiquitinierung und Peroxisom-Eliminierung durch Lysosomen13. Darüber hinaus beeinträchtigt die Fusion von PEX5 mit einem C-terminalen EGFP den Export von monoubiquitiniertem PEX5 und führt zu einer Pexophagie14. Andererseits kann die Pexophagie auch durch eineH2O2-Behandlungausgelöst werden. Peroxisomen produzieren reaktive Sauerstoffspezies (ROS); Insbesondere das peroxisomale Enzym Acox1, das den ersten Schritt der Beta-Oxidation von sehr langkettigen Fettsäuren (> 22-Kohlenstoff) katalysiert, produziert nicht nur Acetyl-CoA, sondern auch peroxisomales ROS. Als Reaktion auf die erhöhten ROS-Werte unter H2O2-Behandlungaktivieren Säugetierzellen die Pexophagie, um die ROS-Produktion zu senken und Stress abzubauen. Es wurde berichtet, dass die Behandlung mit H 2 O2die Rekrutierung von Ataxie-Teleangiektasie-mutierten (ATM) zu Peroxisomen vorantreibt. ATM phosphoryliert dann PEX5, um den peroxisomalen Umsatz durch Pexophagie zu fördern15.
Da Peroxisomen ROS-erzeugende Zentren sind, sind sie auch anfällig für ROS-Schäden. ROS-induzierte peroxisomale Verletzungen zwingen die Zellen, die Pexophagie zu aktivieren, um Peroxisom-Qualitätskontrollwege zu initiieren (Entfernung des beschädigten Peroxisoms durch Autophagie). In dieser Arbeit skizzieren wir einen Ansatz für die On-Demand-Auslösung von ROS-induzierten peroxisomalen Verletzungen. Das Protokoll macht sich die lichtaktivierte ROS-Produktion in den Organellen 16,17,18,19,20 zunutze (Abbildung 1). Farbstoffmarkierte Peroxisomen werden beleuchtet, was zu einer ROS-Produktion im peroxisomalen Lumen führt, die spezifisch eine peroxisomale Schädigung auslöst. Mit Hilfe dieses Protokolls konnte gezeigt werden, dass ROS-gestresste Peroxisomen über einen Ubiquitin-abhängigen Abbauweg entfernt werden. ROS-gestresste Peroxisomen rekrutieren die Ubiquitin-E3-Ligase Stub1, damit sie in Autophagosomen einfließen können, um sie durch Pexophagie einzeln entfernenzu können 16. Man kann dieses Protokoll verwenden, um das Schicksal von verletzten und gesunden Peroxisomen innerhalb derselben Zelle durch Zeitraffermikroskopie zu vergleichen. Die Methode kann auch verwendet werden, um alle Peroxisomen (in allen Zellen) auf einer Kulturschale global zu schädigen, was die biochemische Analyse des Pexophagie-Signalwegs ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>35-mm-Kulturschale mit einem Mikrotimul aus Glas mit 20 mm Durchmesser&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>20 mm</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazol (3-AT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16170060</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Nuaire</td><td>NU-4750</td><td></td></tr><tr><td>diKillerRed-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td>, <td>hergestellt durch Anfügen des KillerRed Tandem-Dimers an PTS1 (VKSKL)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F-12)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>pEGFP-C1</td><td>Das Rückgrat von EGFP-C1 wurde für die Klonierung von EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td></tr><tr><td>EGFP-Hsp70</td><td>verwendet Academia Sinica</td><td></td><td>Hsp70-Gen (HSPA1A) PCR, amplifiziert aus HeLa-cDNA und kloniert in EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-LC3B</td><td>Addgen</td><td>11546</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-p62</td><td>Academia Sinica</td><td></td>, <td>erzeugt durch Einfügen des humanen SQSTM1-Gens (durch PCR-Amplifikation der HeLa-Zell-cDNA) in EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Stub1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>, erzeugt durch Einfügen des Maus-Stub1-Gens (durch PCR-Amplifikation der gesamten mausfarbenen Nieren-cDNA) in EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Ub</td><td>Addgene</td><td>11928</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag TMR-Ligand&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8252</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PTS1 angehängt und kloniert in EGFP-C1</td></tr><tr><td>Backbone HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Konfokalmikroskop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>FV3000RS</td><td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, &nbsp; Mikroskop mit einem TOKAI HIT Kammerinkubator und dem UNIV2-D35 Schüsselaufsatz</td></tr><tr><td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td><td>Promega</td><td>GA1120</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>VitaStar</td><td>PAR64</td><td>80 W, 555-570 nm</td></tr><tr><td>Lipofectamin 2000&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>NIH3T3-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td>adhärent</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>319850</td><td>reduziertes Serummedium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PMP34-TagBFP</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PMP34 PCR amplifiziert aus HeLa cDNA und kloniert intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td></tr><tr><td>roGFP2-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>, erzeugt durch Anhängen von eroGFP (entnommen aus Addgene plasmid 20131) mit der Aminosäuresequenz VKSKL und kloniert in die EGFP-C1</td></tr><tr><td>SHSY5Y-Zelle</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>adhärent</td></tr></tbody></table>

Überwachung der stub1-vermittelten pexophagie

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

Säugetierzellen können Peroxisomen durch Stub1-vermittelte Pexophagie umwandeln. Der Signalweg ermöglicht möglicherweise die zelluläre Kontrolle der Quantität und Qualität von Peroxisomen. Während dieses Prozesses translozieren das Hitzeschockprotein 70 und die Ubiquitin-E3-Ligase Stub1 auf Peroxisomen, die umgedreht werden, um die Pexophagie zu initiieren. Die Aktivität der Stub1-Ligase ermöglicht die Akkumulation von Ubiquitin und anderen Autophagie-relevanten Modulen auf gezielten Peroxisomen. Eine Erhöhung des Spiegels der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) im peroxisomalen Lumen kann die Stub1-vermittelte Pexophagie aktivieren. Man kann daher die farbstoffgestützte ROS-Generierung nutzen, um diesen Signalweg auszulösen und zu überwachen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren zur Verwendung von zwei Klassen von Farbstoffen, fluoreszierenden Proteinen und synthetischen Fluorophoren, um die Pexophagie in Säugetierzellkulturen zu initiieren. Diese farbstoffgestützten Protokolle, die auf der ROS-Generierung basieren, können nicht nur verwendet werden, um alle Peroxisomen innerhalb einer Zellpopulation weltweit anzusprechen, sondern können auch die Manipulation einzelner Peroxisomen innerhalb einzelner Zellen ermöglichen. Wir beschreiben auch, wie die Stub1-vermittelte Pexophagie mit Hilfe der Lebendzellmikroskopie verfolgt werden kann.

Das hier gezeigte Stub1-vermittelte Pexophagie-Induktionsschema nutzt die Vorteile der farbstoffgestützten ROS-Generierung innerhalb des Peroxisomlumens. Dieser Vorgang erfordert minimale Lichtintensitäten. Peroxisomen, die fluoreszierende Proteine oder Farbstoffe enthalten, können daher mit handelsüblichen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen beleuchtet werden. Fokale Beleuchtung führt zu einer sofortigen und lokalisierten ROS-Produktion innerhalb einzelner Peroxisomen, wie der Fluoreszenzreporter roGFP2-VKSKL zeigt (<...

Dieses Protokoll enthält Anweisungen zum Auslösen und Überwachen der Stub1-vermittelten Pexophagie in lebenden Zellen.

Überwachung der Stub1-vermittelten Pexophagie

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

Peroxisomen führen Beta-Oxidation durch und sind anfällig für ROS-Schäden. Mit dieser Methode kann untersucht werden, wie Zellen mit ROS-gestressten Peroxisomen umgehen. Dieses Protokoll wird nicht nur verwendet, um alle Peroxisomen innerhalb einer Zellpopulation global anzusprechen, sondern kann auch die Manipulation der einzelnen Peroxisomen innerhalb einzelner Zellen ermöglichen.Die farbstoffgestützte ROS-Generierung kann auch verwendet werden, um Organellen außerhalb von Peroxisomen anzusprechen, um zu untersuchen, wie Zellen mit Organellenverletzungen umgehen. Zu Beginn werden zwei mal 10 bis fünfte menschliche SHSY5Y-Zellen oder sechs mal 10 bis vierte NIH H3T3-Zellen der Maus in 840 Mikrolitern Nährmedium auf 35-Millimeter-Kulturschalen mit Glasboden und einer Glasmikrovertiefung mit einem Durchmesser von 20 Millimetern ausgesät. Züchten Sie die Zellen 24 Stunden lang unter 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.Als nächstes transfizieren Sie die Zellen mit den gewünschten Plasmiden mit einem Transfektionsreagenz oder einer SHSY5Y-Zelltransfektion. Verdünnen Sie die Plasmide in 55 Mikrolitern serumfreiem DMEM/F-12 und verdünnen Sie einen Mikroliter Transfektionsreagenz in 55 Mikrolitern serumfreiem DMEM/F-12. Kombinieren Sie die verdünnte DNA mit dem verdünnten Reagenz.Vorsichtig mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie den Komplex in das 20-Millimeter-Mikroloch, das zuvor mit 100 Mikrolitern Nährmedium beschichtet wurde, das SHSY5Y-Zellen ohne Antibiotika enthält. Schütteln Sie die Schüssel vorsichtig hin und her.Führen Sie die NIH 3T3-Zelltransfektion wie zuvor gezeigt durch, ersetzen Sie jedoch reduziertes Serummedium anstelle von serumfreiem DMEM/F-12 für die Plasmidverdünnung und das Transfektionsreagenz. Entfernen Sie nach zwei Stunden Transfektion das transfektionsreagenzienhaltige Medium und fügen Sie einen Milliliter frisches Nährmedium hinzu. Inkubieren Sie die NIH 3T3- oder SHSY5Y-Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden.Für die lichtaktivierte ROS-Produktion entfernen Sie 24 Stunden nach der Transfektion das Nährmedium und geben 10 Mikroliter des 200 nanomolaren HaloTag TMR-Liganden oder 200 nanomolaren Janelia Fluor 646 HaloTag-Liganden auf das 20-Millimeter-Glasmikroloch. Übertragen Sie die Schale in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und lassen Sie sie eine Stunde lang stehen, um die Zellen zu färben. Entfernen Sie nach einer Stunde das Färbemedium gründlich und fügen Sie einen Milliliter frisches Nährmedium hinzu.Stellen Sie eine Schale mit Glasboden und den gewünschten Zellen auf ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem Tischinkubator ausgestattet ist. Klicken Sie in der Software auf Werkzeugfenster, wählen Sie Okular und klicken Sie auf die DIA-Schaltfläche, um das übertragene Licht einzuschalten. Betrachten Sie die Schüssel durch das Mikroskopokular und bringen Sie die Zellen durch Drehen des Fokusknopfes in den Fokus.Wählen Sie LSM und klicken Sie auf die Schaltfläche Dye Detector Select. Doppelklicken Sie im Pop-up-Fenster auf die gewünschten Farbstoffe, um die entsprechenden Laser- und Filtereinstellungen für die Abbildung der Zellen auszuwählen. Klicken Sie im Live-Panel auf Live4x, um ein schnelles Laserscanning zu starten, um das Screening nach den Fluoreszenzsignalen der Zellen zu starten.Bewegen Sie den Tisch mit dem Joystick-Controller und lokalisieren Sie die medialen diKillerRed VKSKL- oder SLP-VKSKL-exprimierenden Zellen, um ROS-Stress auf die Peroxisomen auszuüben. Erfassen Sie ein Bild der gewünschten Zelle. Klicken Sie auf Tool-Fenster und wählen Sie LSM-Stimulation.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Ellipse und zeichnen Sie im Livebild-Fenster mit der Maus einen ROI von 15 Mikrometern Durchmesser, der die gewünschten Peroxisomen enthält, auf die ROS-Spannung angewendet wird. Um ROS-Stress auszuüben, verwenden Sie 561 Nanometer für Zellen mit dem diKillerRed VKSKL- oder TMR-markierten SLP-Liganden und 640 Nanometer für Zellen, die mit dem Janelia Fluor 646-markierten SLP-Liganden gefärbt sind. Wählen Sie die Laserwellenlänge für die Aufbringung der ROS-Spannung.Geben Sie den gewünschten Laserprozentsatz und die Dauer ein. Für die ROS-Produktion in den Peroxisomen klicken Sie auf Erfassen und dann auf die Schaltfläche Stimulation, um die Abtastung mit 561 oder 640 Nanometern Licht durch die ROIs für jeweils 30 Sekunden zu starten. Diese Stimulation entspricht ca. 5% Laserleistungseinstellungen für 561 und 640 Nanometer.Nach 30 Sekunden Laserbeleuchtung verlieren Peroxisomen innerhalb der ROIs ihre diKillerRed VKSKL-, TMR- oder Janelia Fluor 646-Signale. Dieser Signalverlust ermöglicht die Unterscheidung zwischen beleuchteten und unbeleuchteten Peroxisomen innerhalb der Zelle. Um die lebenden Zellen der Pexophagen zu überwachen, verfolgen Sie die Translokation von EGFP-markierten Stub1, Hsp70, Ubiquitin, p62 oder LC3B auf die beleuchteten oder ROS-gestressten Peroxisomen durch Zeitrafferaufnahmen in 10-Minuten-Intervallen zwischen den Bildern.Fokale Beleuchtung führt zu einer sofortigen und lokalisierten ROS-Produktion innerhalb einzelner Peroxisomen, wie der Fluoreszenzreporter roGFP2-VKSKL zeigt. Das diKillerRed VKSKL-Bild wurde aufgenommen, nachdem alle roGFP2-VKSKL-Messungen durchgeführt wurden, um die Position der beschädigten Peroxisomen anzuzeigen. Die Daten zeigen auch, dass unbeleuchtete Peroxisomen nicht betroffen sind, was auf die Präzision der Methodik hinweist.Diese Methodik wurde verwendet, um die Stub1-vermittelte Pexophagie zu überwachen. Während dieses Prozesses treten Hsp70, Stub1, ubiquitinierte Proteine, Autophagie-Adapter p62 und LC3B in ROS-gestressten Peroxisomen auf, um die Pexophagie anzutreiben. Mit der gleichen Strategie war es möglich, alle Peroxisomen auf einer Kulturschale gleichzeitig zu schädigen, um die Stub1-vermittelte Pexophagie biochemisch zu charakterisieren.Vor der LED-Beleuchtung war die EGFP-Ubiquitin-Fluoreszenz im Zytoplasma homogen und kolokalisierte nicht mit den Peroxisomen. Nach neun Stunden LED-Beleuchtung akkumulierten sich die EGFP-Ubiquitin-Signale auf allen Peroxisomen in den Zellen, die in einer konfokalen Schale gezüchtet wurden. Mit Hilfe dieses Protokolls fanden wir heraus, dass ROS-gestresste Peroxisomen über einen Ubiquitin-abhängigen Abbauweg entfernt werden.ROS-gestresste Peroxisomen rekrutieren die Ubiquitin-E3-Ligase Stub1, um sie durch Pexophagie entfernen zu können.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine Methode, um Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen zu überwachen beschrieben. A Degron-destabilisierten GFP-(GFP-DGN) und eine stabile GFP-dgnFS Fusionsprotein erzeugt und transduziert in die Zelle mit einem lentiviralen Expressionsvektor. Diese Technik ermöglicht eine stabile GFP-dgn/GFP-dgnFS exprimierenden Zelllinie, in dem Ubiquitin-Proteasom-Aktivität leicht beurteilt werden kann, mit Epifluoreszenz oder Durchflusszytometrie generieren.

Überwachung des Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen unter Verwendung eines Degron (DGN)-destabilisiert Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Reporter Protein

Eine bequeme und leistungsfähige Methode zur Untersuchung der Autophagie bei Penicillium chrysogenum unter Verwendung von Hungerkissen (Mischungen aus Agarose und Leitungswasser in einem Objektträger, der einen zentralen Hohlraum enthält) wird hier vorgestellt.

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Überwachung der Stub1-vermittelten Pexophagie

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