Automatisierte multimodale Stimulation und simultane neuronale Ableitung von mehreren kleinen Organismen

Neuronale Reaktionen geben Aufschluss über die Gehirnaktivität, können aber je nach Experiment und Individuum variieren. Dieses Protokoll hilft bei der Automatisierung der Stimulationsaufzeichnung und -analyse und vereinfacht die Programmierung verschiedener Arten und Muster von Stimuli. Die automatisierte Technik ermöglicht die parallele Aufzeichnung mehrerer Neuronen und Organismen im gleichen mikrofluidischen Format.

Dies verbessert die Wiederholbarkeit von Aufzeichnungen und ermöglicht die Erforschung der neuronalen Variabilität zwischen Populationen. Verschiedene Stimulationsmuster sind erforderlich, um neuronale Phänomene wie Anpassung und sensorische Integration aufzudecken. Diese Methode ist verallgemeinerbar auf andere dynamische Signale von Zellen und Organoiden auf Organismen und Pflanzen.

Schalten Sie zunächst das Mikroskop ein, füllen und entfernen Sie die Luftblasen mit der Ansaugspritze aus dem Reservoirschlauch und füllen Sie dann den Ausflussschlauch mit Puffer. Entfernen Sie das mikrofluidische Gerät aus dem Vakuum-Exsikkator. Setzen Sie das Gerät auf das Mikroskop und führen Sie den Auslassschlauch schnell ein.

Drücken Sie vorsichtig auf die Auslassspritze, um Flüssigkeit in das Gerät zu injizieren, bis ein Tröpfchen aus einem Einlass austritt. Verwenden Sie an diesem Tröpfcheneinlass eine Tropfen-zu-Tropfen-Verbindung, um das entsprechende fluidische Einlassrohr einzuführen, und stellen Sie sicher, dass Flüssigkeitstropfen sowohl auf dem Einlassschlauch als auch auf dem Bullauge des Geräts vorhanden sind, um das Einführen einer Blase zu vermeiden. Verbinden Sie das nächste Einlassrohr mit dem nächsten Tröpfchen.

Injizieren Sie bei Bedarf mehr Flüssigkeit aus dem Auslass und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Einlässe gefüllt sind. Setzen Sie einen soliden Sperrstift in unbenutzte Einlässe und die Schneckenladeöffnung ein. Überprüfen Sie den Durchfluss auf dem Bildschirm, um sicherzustellen, dass der Durchfluss in die gewünschte Richtung geht.

Drehen Sie das erste Ventil auf der Ventilsteuerung um und beobachten Sie, wie der Reizfluss in den mikrofluidischen Bereich fließt. Wenn der Durchfluss unausgeglichen ist, passen Sie die Behälterhöhen an. Übertragen Sie die jungen erwachsenen Tiere mit einem Drahtspitzpickel auf ein nicht ausgesätes Nematodenwachstumsmedium oder eine NGM-Agarplatte und fluten Sie die Platte dann mit etwa fünf Millilitern eines XS-Basalpuffers, damit die Tiere schwimmen können.

Ziehen Sie die Würmer mit dem beigefügten Schlauch, der mit einem XS-Basalpuffer vorgefüllt ist, in eine Ein- bis Drei-Milliliter-Ladespritze. Bewegen Sie den Schlauch mit einem Handgriff unter die Flüssigkeitsoberfläche zu jedem gewünschten Tier und ziehen Sie ihn mit der in der anderen Hand gehaltenen Spritze in den Schlauch. Schließen Sie den Auslassumriss, entfernen Sie den Schneckenladestift und verbinden Sie die Schneckenladespritze über eine Drop-to-Drop-Verbindung mit dem Gerät.

Dann lassen die Tiere sanft in die Arena strömen. Stellen Sie einen Pufferfluss her und planen Sie bis zu einer Stunde für die Immobilisierung durch Tetramisol ein. Erstellen Sie mit dem Texteditor eine Stimulusdefinitionstextdatei mit dem Namen userdefinedacquisitionsettings.

txt mit den Stimulationseinstellungen für die automatische Bildaufnahme. In dieser Datei werden Mikroskopaufnahmeparameter wie Belichtungs- und Anregungszeitpunkt, Versuchsdauer, Intervalle und Speicherverzeichnis definiert. Außerdem werden der Experimenttyp und die Einstellungen für den Stimulationszeitpunkt definiert.

Verwenden Sie für ein Experiment mit einem einzelnen Stimulus ein Format mit nur einem wiederholten Stimulationsbefehl. Verwenden Sie für ein Multi-Muster-Experiment ein Format mit mehreren Stimulationsbefehlen, indem Sie eine Mustersequenz von Ziffern einfügen, die die Reihenfolge der Stimulusmuster darstellt. Geben Sie für jedes Muster einen Stimulationsbefehl in einer separaten Zeile ein.

Führen Sie als Nächstes die Mikroskopsteuerungssoftware aus. Stellen Sie sicher, dass alle fluidischen Einlässe geöffnet sind, der Fluss innerhalb der Arena erwünscht ist und die interessierenden Neuronen innerhalb des Live-Fensters fokussiert sind. Schließen Sie dann das Live-Fenster und führen Sie das Skript multipatternrunscript aus.

bsh innerhalb der Software. Um die Daten zu analysieren, führen Sie NeuroTracker aus, indem Sie nacheinander auf Plugins, dann auf Tracking und dann auf NeuroTracker klicken. Wählen Sie den Ordner aus, der die zu verfolgenden TIFF-Videodateien enthält, und wählen Sie den Bereich der zu verarbeitenden Dateien aus.

Öffnen Sie als Nächstes mithilfe der Menüs "Bild" und "Anpassen" die Fenster zur Steuerung von Helligkeit, Kontrast und Schwellenwert. Überprüfen Sie den dunklen Hintergrund und setzen Sie den Bereich im Schwellenwertfenster nicht zurück, indem Sie die Schwellenwertmethode auf Standard und die Visualisierung auf Rot setzen. Klicken Sie dann im Helligkeitskontrastfenster auf "Auto", um die Sichtbarkeit der Neuronen zu erhöhen.

Passen Sie im Helligkeitskontrastfenster die minimalen und maximalen Schieberegler an, bis die Neuronen deutlich zu unterscheiden sind. Passen Sie dann den Schwellenwert an, bis alle Neuronen als kleine rote Punkte angezeigt werden, die von anderen Objekten getrennt sind. Passen Sie den Frame-Schieberegler an, um die Bewegungen und Intensitätsänderungen der Neuronen zu beobachten, und notieren Sie alle Tiere, die von der Verfolgung ausgeschlossen werden sollen, z. B. aufgrund von Überschneidungen mit anderen Tieren.

Nachdem Sie die zu verfolgenden Neuronen identifiziert haben, passen Sie bei Bedarf den Schwellenwert für jedes Tier so an, dass der rote Schwellenbereich über dem Neuron in jedem Frame sichtbar ist. Klicken Sie auf das Neuron, um seine Position und seinen Schwellenwert aufzuzeichnen. Wenn alle Neuronen ausgewählt sind, drücken Sie die Leertaste, um mit der Verfolgung zu beginnen.

Überwachen Sie den Tracking-Prozess für jedes Tier und nehmen Sie alle erforderlichen Korrekturen vor. Wenn der NeuroTracker pausiert, hat er das Neuron verloren. Passen Sie den Schwellenwert nach Bedarf an und klicken Sie erneut auf das Neuron.

Wenn die Integrationsbox zu einem anderen Tier oder einer anderen nicht-neuronalen Struktur in der Nähe springt, drücken Sie die Leertaste, um anzuhalten. Bewegen Sie den Schieberegler zurück zum ersten fehlerhaften Frame und klicken Sie erneut auf die richtige Neuronenposition. Führen Sie das neurotrackersummarypdf aus.

m-Datei in MATLAB und wählen Sie den Ordner aus, der die NeuroTracker-Datentextdateien enthält. Warten Sie, bis eine Zusammenfassungs-PDF-Datei generiert wurde, die eine Überprüfung des Tracking-Prozesses ermöglicht. Die Tiere können anhand der Anzahl und der neuronalen Reaktionen jedes Tieres und Versuchs identifiziert und zur Beurteilung der Populationsvariabilität betrachtet werden.

Verwenden Sie die Funktion DataBrowse. m, um die neuronalen Daten zu untersuchen, die nach Versuchsnummer, Tiernummer, Stimulationsmuster oder einer anderen Kategorie gruppiert sind. Das Phänomen der zeitlichen Hemmung wurde in einem Experiment mit gepaarten Impulsen getestet, das acht Muster erzeugte, die aus zwei einsekündigen Geruchsimpulsen bestanden, die durch ein Intervall von null bis 20 Sekunden getrennt waren.

Der erste einsekündige Geruchsimpuls löste eine gleiche Reaktionsstärke in den Diacetyl-detektierenden AWA-Neuronen aus, und die Antworten im zweiten Puls variierten mit dem Interstimulus-Intervall. Die Enthemmung wurde durch das Catch-Experiment untersucht, bei dem eine Anpassung an den Diacetyl-Stimulus beobachtet wurde, aber die Präsentation des neuartigen 2-Methylpyrazin-Stimulus keinen starken Enthemmungseffekt hervorrief. Die getestete multimodale Stimulation zeigte, dass die chemische Stimulation allein eine Anpassung bewirkte, während die optische Stimulation allein dies nicht tat.

Das kombinierte multimodale Stimulusmuster zeigte jedoch, dass optogene Antworten anfällig für chemisch induzierte Anpassung sind. Indem wir das mikrofluidische Design so modifizieren, dass es zwei Arenen umfasst, können wir genetische oder andere Störungen gleichzeitig mit einer übereinstimmenden Referenz vergleichen. Einmal eingerichtet, kann das System in vielerlei Hinsicht modifiziert werden.

So haben wir beispielsweise chemische Dosiswirkungen und zustandsabhängige Veränderungen der neuronalen Aktivität wie zwischen Schlaf- und Wachzustand automatisch gemessen.