Name: Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4+ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Erfahren Sie reproduzierbare Methoden zur Analyse früher Differenzierungsentscheidungen virusspezifischer T-FH-Zellen in akut LCMV-infizierten Mäusen. Diese Protokolle umfassen Durchflusszytometrie und retrovirale Gentransduktion zur Untersuchung von T-Zell-Aktivierung.

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Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 32300785 bis X.C.), des China National Postdoctoral Program for Innovative Talents (Nr. BX20230449 bis X.C.) und das National Science and Technology Major Project (Nr. 2021YFC2300602 bis L.Y.).

Entschlüsselung der frühen Bindung follikulärer Helfer-T-Zellen bei akuter LCMV-Infektion

<ol><li>O'shea, J. J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+lineage+commitment+and+plasticity+of+helper+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells.</a> Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+follicular+helper+cell+biology%3A+A+decade+of+discovery+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases.</a> Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).</li>
<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper t cells.</a> Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS+receptor+instructs+T+follicular+helper+cell+versus+effector+cell+differentiation+via+induction+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6.</a> Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+expressing+follicular+helper+CD4+T+cells+are+fate+committed+early+and+have+the+capacity+to+form+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory.</a> J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).</li>
<li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+BLIMP-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEF1+and+TCF1+orchestrate+T%28FH%29+differentiation+by+regulating+differentiation+circuits+upstream+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6.</a> Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF1+is+required+for+the+t+follicular+helper+cell+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection.</a> Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+TCF-1+initiates+the+differentiation+of+T%28FH%29+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection.</a> Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).</li>
<li>Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+control+the+expression+and+activity+of+bcl-6+in+th1+cells+to+regulate+flexibility+with+a+TFH-like+gene+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile.</a> Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).</li>
<li>Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+STAT1+is+required+for+IL-6-mediated+bcl6+induction+for+early+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation.</a> J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+ezh2+primes+the+early+differentiation+of+follicular+helper+T+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection.</a> Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+programs+T%28FH%29+differentiation+by+integrating+phosphorylation-dependent+activation+of+bcl6+and+polycomb-dependent+repression+of+p19ARF%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF.</a> Nat Commun. 9 (1), 5452(2018).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METTL3-dependent+m%286%29A+modification+programs+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 1333(2021).</li>
<li>Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+is+a+potent+negative+regulator+of+TFH+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation.</a> J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+KLF2+restrains+CD4%2B+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation.</a> Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+e3+ubiquitin+ligase+itch+is+required+for+the+differentiation+of+follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells.</a> Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).</li>
<li>Baumjohann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+cluster+mir-17%7E92+promotes+TFH+cell+differentiation+and+represses+subset-inappropriate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression.</a> Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+complex+mTORC2+promotes+the+longevity+of+virus-specific+memory+CD4%28%2B%29+T+cells+by+preventing+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis.</a> Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).</li>
<li>Hale, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+memory+CD4%2B+T+cells+with+commitment+to+T+follicular+helper-+and+T+helper+1-cell+lineages+are+generated+after+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection.</a> Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenium-GPX4+axis+protects+follicular+helper+t+cells+from+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis.</a> Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).</li>
<li>Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+MHC-class+II-restricted+TCR-transgenic+mice%3A+Effects+on+humoral+and+cellular+immune+responses+after+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection.</a> Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).</li>
<li>Grosjean, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enrichment+of+mouse+splenic+t+cells+for+ex+vivo+and+in+vivo+T+cell+receptor+stimulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100961(2021).</li>
<li>Dowling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+bottom-up+proteomic+analysis+of+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100196(2020).</li>
<li>Choi, Y. S., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+expression+in+TCR+transgenic+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells.</a> Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+expansion+and+retroviral+transduction+of+mouse+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells.</a> J Immunol Methods. 488, 112931(2021).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+CXCR5-+expressing+CD8%28%2B%29+T+cells+curtail+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection.</a> Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+B+helper+T+cells+express+CXC+chemokine+receptor+5%2C+localize+to+B+cell+follicles%2C+and+support+immunoglobulin+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production.</a> J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+mTORC1+promotes+the+generation+and+suppressive+function+of+follicular+regulatory+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells.</a> Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphatase+pten+links+platelets+with+immune+regulatory+functions+of+mouse+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 2762(2022).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+identification+of+T%28fh%2913+cells+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human.</a> J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Die Forschung auf dem Gebiet derT-FH-Zellen ist seit der Entdeckung der spezialisierten Funktion vonT-FH-Zellen bei der Unterstützung von B-Zellen hervorgehoben worden. Häufende Studien deuteten darauf hin, dass dieT-FH-Zelldifferenzierung ein mehrstufiger und multifaktorieller Prozess30 ist, wobei die Schicksalsbindung derT-FH-Zellen im frühen Stadium bestimmt wird5. Daher ist ein besseres Verständnis der Mechanismen, die frühdifferenziertenT-FH-Zellen zugrunde liegen, entscheidend für dieT-FH-Zellbiologie und ein rationales Impfstoffdesign. In dieser Arbeit haben wir Methoden zur Verfügung gestellt, um die frühe Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen zu erfassen und die Genexpression in früh differenziertenT-FH-Zellen zu manipulieren, indem wir das LCMV-Armstrong-Virusinfektionsmodell, TCR-transgene SM-Maus und Retrovirus-vermittelte Transduktion nutzten.
Der Chemokinrezeptor CXCR5 ist ein wichtiger Oberflächenmarker, derT-FH-Zellen von anderen CD4+ DH-Zell-Untergruppen 6,7,8,31 unterscheidet, weshalb die CXCR5-Färbemethode mit hoher Spezifität und Sensitivität in der T-FH-Zellforschung erforderlich wird. In der Studie wurde eine dreistufige Streptavidin-Biotin-CXCR5-Färbemethode zur Identifizierung derT-FH-Zelluntergruppe vorgestellt (Abbildung 1C). Obwohl der Verlust der Spezifität ein heikles Problem für hochempfindliche Ansätze zur Färbung von Zwei- oder Drei-Streptokokken-Antikörpern ist, wurde festgestellt, dass das Fluoreszenzsignal durch die dreistufige CXCR5-Antikörperfärbung am Tag 3 nach der Infektion fast vollständig mit dem GFP-Signal in CXCR5-GFP 29-Reporter-SM-CD4+-T-Zellen überlappte (Abbildung 1D), was darauf hindeutet, dass sowohl Spezifität als auch Sensitivität durch die dreistufige CXCR5-Antikörperfärbemethode erreicht werden. In der Tat hat sich diese CXCR5-Färbestrategie mit drei Streptokokken bewährt und den Forschern geholfen, dieT-FH-Zellbiologie besser zu untersuchen 11,14,15,21 sowie andere CXCR5-exprimierende T-Zelltypen 29,32.
Nach Infektion und Immunisierung wird das Schicksals-Engagement vonT-FH-Zellen im Allgemeinen durch eine zweigeteilte Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in entwederT-FH-Zellen oder Nicht-T-FH-Effektor-T-H-Zellen modelliert 2,3,30. Diese Studie zeigte die ausgewogene Bifurkation von TFH und TH1 Zellen in übertragenen SM CD4+ T-Zellen. Darüber hinaus weisen diese übertragenen SM CD4+ T-Zellen im frühen Infektionsstadium eine ausreichende Zellmenge auf und dienen somit als geeignetes Modell für die Untersuchung der Differenzierung vonT-FH-Zellen. Sicherlich war die Retrovirus-vermittelte ektopische Bcl-6-Expression in übertragenen SM CD4+ T-Zellen im Vergleich zu der in kontrollierten SM CD4+ T-Zellen (86,6% vs. 53,8%) stark in Bezug auf die Differenzierung vonT-FH-Zellen verzerrt (Abbildung 3C), was mit dem vorherigen Bericht6 übereinstimmt und die Genauigkeit der in der Studie beschriebenen Protokolle weiter beweist. Alternativ können die oben genannten Protokolle auch auf den retrovirusvermittelten Knock-down interessierter Gene (z. B. bcl6, Tcf7) in früh aktivierten SM CD4+ T-Zellen angewendet werden11 (Daten nicht gezeigt).
Eine Einschränkung des Protokolls ist das Timing-Problem (insgesamt mehr als 2 Stunden) und der mehrstufige Prozess der dreistufigen CXCR5-Färbemethode. Alternativ wurden in derT-FH-Zellforschung auch einstufige18,33- oder zweistufige 4,9,34 CXCR5-Färbemethoden angewendet. Ein Vergleich der Spezifität/Sensitivität dieser CXCR5-Färbemethoden ist gerechtfertigt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die aktuelle Studie Protokolle für den Zugang zu früh differenzierten virusspezifischenT-FH-Zellen und für die Untersuchung interessierter Gene lieferte, die möglicherweise dieT-FH-Zelldifferenzierung regulieren. Diese Protokolle werden die Untersuchungen des frühen Schicksals vonT-FH-Zellen vorantreiben.

Wenn naive CD4+ T-Zellen auf unterschiedliche Krankheitserreger oder Bedrohungen treffen, passen sie ihre Immunantworten an, indem sie sich in verschiedene T-Helfer-Zell-Untergruppen (TH) mit spezialisierten Funktionen differenzieren1. Im Szenario einer akuten Virusinfektion differenziert sich ein großer Teil der naiven CD4+ T-Zellen zu follikulären Helfer-T (TFH)-Zellen, die den B-Zellen helfen 2,3. Im Unterschied zu anderen CD4+ TH Zell-Untergruppen (z. B. TH1, TH2, TH9 und TH17 Zellen) exprimieren TFH-Zellen eine beträchtliche Menge an CXCR5, dem Chemokinrezeptor für das B-Zell-Homing-Chemokin CXCL13, das es TFH-Zellen ermöglicht, in B-Zellfollikel zu wandern. In den B-Zell-Follikeln unterstützenT-FH-Zellen verwandte B-Zellen bei der Initiierung und Aufrechterhaltung von Keimzentrumsreaktionen und ermöglichen so eine schnelle Produktion von Antikörpern mit hoher Affinität und ein humorales Langzeitgedächtnis 2,3.
Nach einer akuten Virusinfektion erfolgt die frühe Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen innerhalb von 72 h 4,5 und wird durch den transkriptionellen Repressor B-Zell-Lymphom-6 (Bcl-6)5,6,7,8 gesteuert, der als "Master-Regulator" fungiert und über das Schicksal vonT-FH-Zellen entscheidet. Ein Mangel an Bcl-6 stumpft die Differenzierung derT-FH-Zellen stark ab, während die ektopische Bcl-6-Expression die Bindung der T-FH-Zellen an das Schicksal derT-FH-Zellen erheblich fördert. Zusätzlich zu Bcl-6 sind mehrere Moleküle an der Instruktion des frühen Schicksals derT-FH-Zellen beteiligt. Die Transkriptionsfaktoren TCF-1 und LEF-1 initiieren die Differenzierung derT-FH-Zellen über die Induktion von Bcl-6 9,10,11. Die Hemmung von Blimp1 sowohl durch Bcl-6 als auch durch TCF-1 ist für die frühe Bindung vonT-FH-Zellen erforderlich11,12. STAT1 und STAT3 werden auch für die frühe Differenzierung vonT-FH-Zellen benötigt13. Darüber hinaus tragen epigenetische Modifikationen durch die Histon-Methyltransferase EZH214,15 und die m6A-Methyltransferase METTL316 dazu bei, die Transkriptionsprogramme derT-FH-Zellen (insbesondere Bcl6 und Tcf7) zu stabilisieren und damit das frühe Schicksal derT-FH-Zellen zu unterstützen. Während Fortschritte, einschließlich der oben genannten Moleküle und anderer, die an anderer Stellezusammengefasst sind 3, beim Verständnis der transkriptionellen und epigenetischen Regulation des frühen Schicksals vonT-FH-Zellen gemacht wurden, müssen bisher unbekannte Moleküle noch gelernt werden.
Im Mausmodell der akuten lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV)-Infektion durchlaufen adoptiv übertragene kongene TCR-transgene SMARTA (SM) CD4+ T-Zellen, die spezifisch das LCMV-Glykoprotein-Epitop I-AbGP66-77 erkennen, während der Virusinfektion entweder eineT-FH- oder eineT-H1-Zelldifferenzierung. Dieses TFH/TH1-Bifurkationsdifferenzierungsmuster unterstützt die Weiterentwicklung des SM/akuten LCMV-Infektionsmodells bei der Untersuchung der Biologie virusspezifischer TFH-Zellen. In der Tat ist das SM/akute LCMV-Infektionsmodell in derT-FH-Zellforschung weit verbreitet und hat eine entscheidende Rolle bei bahnbrechenden Entdeckungen in derT-FH-Zellbiologie gespielt. Dies beinhaltet die Identifizierung des bereits erwähnten Bcl-6 als liniendefinierenden Transkriptionsfaktor derT-FH-Zellen 5,6 sowie anderer wichtiger transkriptioneller Faktoren (z. B. Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 und Itch19), die die Differenzierungvon T-FH-Zellen steuern, posttranskriptionelle Regulierungen ( z.B. METTL316 und miR-17~9220) der T-FH-Zelldifferenzierung, des T-FH-Zellgedächtnisses und der Plastizität21,22 und rationaler Impfstrategien, die auf T-FH-Zellen abzielen (z. B. Selen23).
Die vorliegende Studie beschreibt reproduzierbare Methoden für den Zugang zur frühen Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen , einschließlich (1) der Etablierung eines akuten LCMV-infizierten SM-Chimären-Mausmodells, das für den Zugang zu früh differenziertenT-FH-Zellen geeignet ist, (2) der Durchführung von Durchflusszytometrie-Färbungen von Molekülen, die mit frühdifferenziertenT-FH-Zellen verwandt sind, und (3) der Durchführung retroviraler vektorbasierter Genmanipulation in SM CD4+ T-Zellen. Diese Methoden werden für Studien nützlich sein, die die frühe Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen untersuchen.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldehyd-Fixlösung, 4 % PFA</td><td>Beyotime</td><td>P0099-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Zellensieb</td><td>Merck</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Maus TCR V&alpha; 2 (Klon B20.1)</td><td>Biolegend</td><td>127812</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Anti-Maus CD45.1 (Klon A20)</td><td>Biolegend</td><td>110724</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>APC Anti-Maus CD25 (Klon PC61)</td><td>Biolegend</td><td>101910</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) Maus</td><td>The Jackson Laboratory 002014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeaverBeads Streptavidin</td><td>Beaver</td><td>22321-10</td><td></td></tr><tr><td>Biotin Anti-Maus F4/80 Antikörper (Klon BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123106</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Biotin Ratte Anti-Maus CD11c (Klon N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Biotin Ratte Anti-Maus CD19 (Klon 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Biotin Ratte Anti-Maus CD8a (Klon 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Biotin Ratte Anti-Maus NK-1.1 (Klon PK136)</td><td>Biolegend</td><td>108704</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Biotin Ratte Anti-Maus TER-119/Erythroide Zellen (Klon TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin, BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Anti-T-bet (Klon 4B10)</td><td>Biolegend</td><td>644816</td><td>1:100 Verdünnung</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anti-Maus CD279 (PD-1) (Klon 29F.1A12)</td><td>Biolegend</td><td>135220</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>C57BL/6J (B6) Maus</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>CXCR5-GFP Knock-in-Reportermaus</td><td></td><td></td><td>Im Haus; Die CXCR5-GFP-Knock-in-Mauslinie wurde durch die Insertion eines IRES-GFP-Konstrukts nach dem offenen Leserahmen von Cxcr5 erzeugt.</td></tr><tr><td>DMEM 10 % Medium</td><td></td><td></td><td>DMEM-Medium mit 10 % FBS</td></tr><tr><td>DMEM-Medium</td><td>Gibco</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>FACSFortesa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, FBS</td><td>Sigma</td><td>F8318</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo (Version 10.4.0)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foxp3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set</td><td>Invitrogen</td><td>00-5523-00</td><td>Das Kit enthält drei Reagenzien: a. Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat (4X); b. Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel; c. Permeabilisierungspuffer.</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Ratten-IgG-Antikörper (H+L), Biotinylierter</td><td>Vektor Laboratorien</td><td>BA-9400-1,5</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolationspuffer</td><td></td><td></td><td>FACS-Puffer mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>LCMV GP61-77 Peptid (GLKGPDIYKGVYQFKSV)</td><td>Chinesisches Peptidunternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixierbares Nahinfrarot-Färbungskit für tote Zellen, für 633 oder 635 nm Anregung</td><td>Life Technologies</td><td>L10199</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>MigR1</td><td>addgene</td><td>#27490</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>addgene</td><td>#12371</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-Maus CD69 (Klon H1.2F3)</td><td>Biolegend</td><td>104508</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>PE Maus Anti-Bcl-6 (Klon K112-91)</td><td>BD Biosciences</td><td>561522</td><td>1:50 Verdünnung</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Solarbio</td><td>H8761</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigte Ratte Anti-Maus CXCR5 (Klon 2G8)</td><td>BD Biosciences</td><td>551961</td><td>1:50 Verdünnung</td></tr><tr><td>Ratte monoklonales PerCP Anti-Maus CD4 (Klon RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100538</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>rekombinant murine IL-2</td><td>Gibco</td><td>212-12-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lysepuffer für rote Blutkörperchen</td><td>Beyotime</td><td>C3702-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 2%</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640 Medium mit 2% FBS</td></tr><tr><td>SMARTA (SM) TCR transgene Maus</td><td></td><td></td><td>Die transgene Linie SM TCR in unserem Labor ist ein Geschenk von Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Darüber hinaus kann diese Mauslinie auch von The Jackson Laboratory (Fleck#: 030450) bezogen werden.</td></tr><tr><td>Färbepuffer</td><td></td><td></td><td>PBS mit 2 % FBS und 0,01 % NaN3</td></tr><tr><td>Streptavidin PE-Cyanin7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>TCF1/TCF7 (C63D9) Kaninchen mAb (Alexa Fluor 488 Konjugat)</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>6444S</td><td>1:400 Verdünnung</td></tr><tr><td>TFH-Zellfärbepuffer</td><td></td><td></td><td>FACS-Puffer mit 1 % BSA und 2 % Mausserum</td></tr><tr><td>TransIT-293 Reagenz</td><td>Mirus Bio</td><td>MIRUMIR2700</td><td></td></tr></tbody></table>

zugang zur frühen differenzierung der virusspezifischen follikulären helferzelle cd4+ t-zellen in akuten lcmv-infizierten mäusen

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follikuläre T-Helferzellen (TFH) werden als eigenständige CD4+ T-Zelllinie wahrgenommen, die verwandte B-Zellen bei der Produktion von hochaffinen Antikörpern unterstützt und so eine langfristige humorale Immunität aufbaut. Während einer akuten Virusinfektion wird das Schicksal virusspezifischerT-FH-Zellen in der frühen Infektionsphase bestimmt, und Untersuchungen der früh differenziertenT-FH-Zellen sind entscheidend für das Verständnis der T-Zell-abhängigen humoralen Immunität und die Optimierung des Impfstoffdesigns. In der Studie haben wir unter Verwendung eines Mausmodells für eine akute Infektion mit dem lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV) und der TCR-transgenen SMARTA (SM)-Maus mit CD4+ T-Zellen, die spezifisch das LCMV-Glykoprotein-Epitop I-AbGP66-77 erkennen, Verfahren beschrieben, um auf der Grundlage von Durchflusszytometrie-Färbungen auf das frühe Schicksal von virusspezifischenT-FH-Zellen zuzugreifen. Darüber hinaus werden durch die Ausnutzung der retroviralen Transduktion von SM CD4+ T-Zellen auch Methoden zur Manipulation der Genexpression in früh differenzierten virusspezifischenT-FH-Zellen bereitgestellt. Daher werden diese Methoden bei Studien helfen, die den Mechanismus untersuchen, der der frühen Bindung von virusspezifischenT-FH-Zellen zugrunde liegt.

Eigenschaften von früh differenzierten virusspezifischenT-FH-Zellen während einer akuten LCMV-Infektion Um die frühe Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen zu untersuchen, wurden naive kongene SM CD4+ T-Zellen, die spezifisch das LCMV-GP-Epitop I-AbGP66-77 erkennen, adoptiv in CD45.2+ C57BL/6-Empfänger übertragen. Am nächsten Tag wurden diese Empfänger intravenös mit einer hohen Dosierung des akut aufgelösten LCMV Armstrong infiziert (Abbildung 1A). Am Tag 3 nach der Infektion wurden die Splenozyten von C57BL/6-Empfängern mittels Durchflusszytometrie analysiert, und die Ergebnisse zeigten eine große Menge an übertragenen CD45.1+ SM CD4+ T-Zellen (~10% der gesamten CD4+ T-Zellen) (Abbildung 1B), was eine ausreichende Anzahl virusspezifischer CD4+ T-Zellen für weitere Untersuchungen lieferte. Weitere Analysen von übertragenen SM CD4+ T-Zellen zeigten eine Koexpression von CXCR5 und Bcl-6/TCF-1 und eine reziproke Expression von CXCR5 und CD25/T-bet, wodurch die Linien TFH (CXCR5+Bcl-6+ oder CXCR5+TCF-1+) und TH1 (CXCR5-CD25+ oder CXCR5-T-bet+) definiert wurden (Abbildung 1C). Um die Spezifität und Sensitivität der in der Studie vorgestellten CXCR5-Antikörperfärbung zu bewerten, kreuzten wir die oben erwähnte CD45.1+ SM-Mauslinie mit der CXCR5-GFP-Knock-in-Mauslinie, die durch die Insertion eines IRES-GFP-Konstrukts nach dem offenen Leserahmen von Cxcr529 erzeugt wurde. Anschließend wurden CD45.1+ CXCR5-GFP-Reporter-SM-Zellen in C57BL/6-Empfänger übertragen. Diese Empfänger wurden mit LCMV Armstrong infiziert, und ihre Milzzellen wurden am Tag 3 nach der Infektion analysiert. Tatsächlich überlappte sich das Fluoreszenzsignal durch die CXCR5-Antikörperfärbemethode in der Studie fein mit dem GFP-Signal in übertragenen CXCR5-GFP-Reporterzellen29 SM CD4+ T-Zellen am Tag 3 nach der Infektion (Abbildung 1D), was auf die hohe Spezifität der dreistufigen CXCR5-Antikörperfärbemethode hinweist.
Retrovirus-basierte Bcl-6-Überexpression in SM CD4+ T-Zellen Bcl-6 ist eines der wichtigsten Moleküle bei der Förderung der Differenzierung vonT-FH-Zellen 6,7,8. Um die Zuverlässigkeit des aktuellen Protokolls beim Zugang zu früh differenziertenT-FH-Zellen zu ermitteln, wurden CD45.1+ SM CD4+ T-Zellen in vivo aktiviert und mit Retrovirus-Überständen aus MigR1-Plasmid- oder MigR1-Bcl6-Überexpressionsplasmid-transfizierten 293T-Zellen transduziert (Abbildung 2 und Abbildung 3A). Retrovirus-transduzierte SM CD4+ T-Zellen wurden als nächstes adoptiv in C57BL/6-Empfänger übertragen, die dann mit LCMV Armstrong infiziert wurden (Abbildung 3B). Am Tag 3 nach der Infektion fanden wir eine ausgewogene Bifurkation vonT-FH- undT-H1-Zellenin MigR1-SM CD4+ T-Zellen, während eine vorherrschende T-FH-Zell-gerichtete Differenzierung in MigR1-Bcl6-SM CD4+ T-Zellen zu verzeichnen war (Abbildung 3C). Konsistent war das Bcl-6-Expressionsniveau in MigR1-Bcl6-SM CD4+ T-Zellen im Vergleich zu dem in MigR1-SM CD4+ T-Zellen erhöht (Abbildung 3D). Daher wurde der Phänotyp, der die ektopische Bcl-6-Expression der T-FH-Zelldifferenzierung6 steuert, nach dem aktuellen Protokoll fein reproduziert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig01.jpg"> Abbildung 1: Durchflusszytometrische Analysen der frühen Schicksalsbindung von SM TFH-Zellen während der LCMV-Armstrong-Infektion. (A) Versuchsdesign. Milz-CD4+-T-Zellen wurden von CD45.1+ SM-Mäusen geerntet und dann adoptiv in C57BL/6-Empfänger (CD45.2+) übertragen. Am nächsten Tag wurden diese Empfänger mit LCMV Armstrong infiziert. Am Tag 3 nach der Infektion wurden übertragene CD45.1+ SM-Zellen aus der Milz der Empfänger mittels Durchflusszytometrie analysiert. (B) Repräsentative Durchflusszytometrie-Daten, die die Gating-Strategie von übertragenen CD45.1+ SM CD4+ T-Zellen aus der Milz der Empfänger am Tag 3 nach der LCMV-Armstrong-Infektion zeigen. (C) Repräsentative Durchflusszytometrie-Daten, die Co-Färbungen von CXCR5 und anderen T-FH-Zell-assoziierten Molekülen (Bcl-6, TCF-1, CD25 und T-bet) in übertragenen CD45.1+ SM-Zellen aus der Milz von Empfängern am Tag 3 nach der LCMV-Armstrong-Infektion zeigen. (D) Repräsentative Durchflusszytometrie-Daten, die Co-Färbungen von Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern gegen CXCR5 und GFP-Signal in übertragenen CD45.1+ CXCR5-GFP-Reporter-SM-Zellen aus der Milz von Empfängern am Tag 3 nach LCMV-Armstrong-Infektion zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig02.jpg"> Abbildung 2: Retrovirale Transduktion in SM CD4+ T-Zellen. (A) Schematische Darstellung der Retrovirusproduktion und der retroviralen Transduktion in SM CD4+ T-Zellen. Für die Retrovirusproduktion wurden 293T-Zellen, die in einer 6-Well-Platte ausgesät wurden, mit Ziel-DNA-Plasmiden transfiziert, wenn die Zelldichte ≥80% Konfluenz erreichte. Dann wurde der Zellkulturüberstand, der Retroviren enthielt, 72 h nach der Transfektion entnommen und sofort verwendet oder bei -80 °C gelagert. Für die retrovirale Transduktion in SM CD4+ T-Zellen wurde einer CD45.1+ SM-Maus intravenös 200 μg LCMV GP61-77 Peptid injiziert. Dann wurde die Milz 16-18 h nach der Peptidinjektion von SM-Maus präpariert und der Aktivierungsstatus von Milz-CD4+ T-Zellen nachgewiesen. Aktivierte SM CD4+ T-Zellen wurden mit Kulturüberständen, die Retroviren enthielten, transduziert und in vitro für 48 Stunden kultiviert, bevor sie auf die Transduktionseffizienz zugreifen konnten. (B) Fluoreszenzmikroskopische Bildgebung von GFP in Plasmid-DNA-transfizierten 293T-Zellen. Maßstabsbalken: 400 μm. (C) Durchflusszytometrische Analyse der CD25- und CD69-Expressionsniveaus in milznaiven CD4+ T-Zellen aus naiven Mäusen (naiv, links) oder Milz-SM CD4+ T-Zellen aus LCMV GP61-77 peptidinjizierten SM-Mäusen (aktiviert, rechts). (D) Durchflusszytometrische Analyse der GFP-Expression in Retrovirus-transduzierten SM CD4+ T-Zellen (transduziert, links) oder Retrovirus-nicht transduzierten SM CD4+ T-Zellen (nicht transduziert, links). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig03.jpg"> Abbildung 3: Auswirkungen der Bcl-6-Überexpression auf das Schicksal von SM TFH-Zellen . (A) Lineare Karten der retroviralen MigR1-Rückgrate (oben) und des modifizierten MigR1-Vektors mit der Bcl6-CDS-Region stromaufwärts von IRES-GFP (MigR1-Bcl6) (unteres Bild). (B) Versuchsplanung. MigR1-transduzierte oder MigR1-Bcl6-transduzierte SM CD4+ T-Zellen wurden einen Tag vor LCMV Armstrong adoptiv in C57BL/6-Empfänger (CD45.2+) übertragen. Am Tag 3 nach der Infektion wurden übertragene CD45.1+ SM CD4+ T-Zellen aus der Milz der Empfänger mittels Durchflusszytometrie analysiert. (C) Durchflusszytometrische Analyse von CXCR5 und CD25 in MigR1-transduzierten oder MigR1-Bcl6-transduzierten GFP+ SM CD4+ T-Zellen. Die Zahlen neben dem Gate geben die Häufigkeiten vonT-FH-Zellen in SM-CD4+ -T-Zellen an. (D) Durchflusszytometrische Analyse des Bcl-6-Expressionsniveaus in MigR1-transduzierten oder MigR1-Bcl6-transduzierten SM CD4+ T-Zellen. MFI, mittlere Fluoreszenzintensität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Die aktuelle Studie zeigt Protokolle zur Bewertung der frühen Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen und zur Manipulation der Genexpression in diesen Zellen.

Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4+ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen

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Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4+ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen (Video) | JoVE Journal

Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4⁺ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen

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