AC-DC Elektropenetrographie zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis Mücken an menschlichen Händen

Unsere Gruppe verwendet EPG, um zu untersuchen, wie Arboviren und andere Faktoren das Sondierungs- und Aufnahmeverhalten beeinflussen, das während der Blutfütterung auftritt, da viele Krankheitserreger das Vektorverhalten manipulieren, um die Übertragung zu verbessern. Im Grunde untersuchen wir, was während eines Mückenstichs passiert und wie diese Verhaltensweisen die Übertragung von Krankheitserregern und die Krankheitspathologie beeinflussen. In der Vergangenheit wurde EPG hauptsächlich zur Untersuchung von pflanzenfressenden Insekten verwendet.

Die jüngste Entwicklung von AC-DC-EPG-Verfahren für blutfressende Arthropoden ermöglicht es uns, das Sondierungs- und Aufnahmeverhalten, das während der Blutfütterung auftritt, in beispielloser Detailgenauigkeit zu untersuchen, ohne dass invasive Verfahren erforderlich sind, was möglicherweise die Entwicklung neuartiger Managementstrategien ermöglicht. Die größte Herausforderung bei der Anwendung von EPG bei blutsaugenden Arthropoden besteht darin, die Wellenformen mit biologischen Aktivitäten wie Speichelfluss und Erregerübertragung zu korrelieren. Wir haben starke Hypothesen, die auf den elektrischen Ursprüngen der Wellenformen und der Literatur basieren, aber wir brauchen immer noch empirische Beweise.

Führen Sie zunächst die Spitze einer Weidepipette aus Glas durch eine Flamme und drehen Sie die Pipette leicht. Überprüfen Sie den Durchmesser und wiederholen Sie den Vorgang, um die Pipette auf die gewünschte Größe zu bringen. Um einen Insektensauger herzustellen, decken Sie das große Ende der modifizierten Weidepipette mit einem Moskitonetz ab und führen Sie es in den Silikonschlauch ein, der mit einem Laborsauger verbunden ist und die Verbindung mit Isolierband sichert.

Für die Aufzeichnungselektroden wickeln Sie einen Schaumstoffblock mit frischer Plastikfolie ein, um die vorbereiteten Insektenstummel und verdrahteten Mücken zu halten. Den oberen Zentimeter des Kupferdrahtes mit einer Rasierklinge abkratzen, bis er von allen Seiten glänzt. Schneiden Sie dann Golddraht mit einem Durchmesser von 0,025 Millimetern in vier bis fünf Zentimeter lange Stücke.

Halten Sie den Draht in einer selbstschließenden Pinzette, die mit Klebeband abgedeckt ist, um eine Delle des Drahtes zu vermeiden, und wickeln Sie den Golddraht vorsichtig dreimal um den Kupferdraht des Insektenstumpfes, beginnend entlang der sauberen Spitze des Kupferdrahtes. Verwende eine Seziersonde, um Silberkleber aufzutragen, um den Golddraht an Ort und Stelle zu halten. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass kein loses Ende vorhanden ist, legen Sie den Insektenstummel in den Schaumstoff, bis der Kleber getrocknet ist.

Streichen Sie dann vorsichtig über den Golddraht, der am Insektenstummel befestigt ist, um ihn zu einem langen, sanften Bogen zu formen, und schneiden Sie den Draht auf eine Länge von etwa 2,5 bis 3 Zentimetern ab. Halten Sie unter einem Präpariermikroskop den Insektenstummel mit der nicht dominanten Hand am Messingnagel, während der Golddraht den Dissektionsmikroskoptisch berührt, und fassen Sie mit der dominanten Hand das äußerste Ende des Golddrahtes mit einer feinen Pinzette, kreuzen Sie mit der feinen Pinzette die Spitze des Golddrahtes über den Kupferdraht des Insektenstumpfes in der Nähe des geklebten Bereichs. Ziehen Sie dann vorsichtig am Insektenstumpf, bis der Golddraht eine kleine goldene Schlaufe um die feine Pinzette bildet.

Lösen Sie den Golddraht und entfernen Sie vorsichtig die Pinzette. Während du den Insektenstummel in der nicht dominanten Hand hältst, greifst du die goldene Schlaufe mit einer feinen Pinzette. Ziehen Sie am Insektenstummel und drehen Sie die Pinzette leicht vom Stummel weg, bis sich die Schlaufe in einem 90-Grad-Winkel zum Drahthals biegt.

Stellen Sie sicher, dass die goldene Schlaufe vollständig geschlossen ist, bevor Sie den Insektenstummel wieder in den Schaumstoffblock legen. Bereiten Sie zunächst den Insektensauger und die Aufzeichnungselektroden für die Verkabelung der Mücken vor. Positionieren Sie die betäubten Mücken auf dem Rücken auf dem Anästhesiekissen, wobei der Bauch zum Forscher zeigt.

Tragen Sie nach dem Anbringen eines Labortapes einen 0,5 Zentimeter großen Tropfen frisch angemischten Silberkleber auf das Tape auf. Saugen Sie dann den Bauch einer betäubten Mücke in den Aspirator ab. Verwenden Sie den Sauger nur lange genug, um den Bauch an Ort und Stelle zu setzen und halten Sie die Mücke mit dem Aspirator unter das Präparierfernrohr über den Silberkleber.

Nachdem Sie eine Minucheraffennadel in den Silberkleber getaucht haben, tragen Sie eine dünne Schicht auf das Pronotum der Mücke auf. Tauchen Sie die Goldschlaufe an der Spitze der Aufnahmeelektrode schnell in den silbernen Kleber. Lege sie auf den silbernen Klebefleck am Pronotum der Mücke und schaukele die Schlaufe hin und her, um sicherzustellen, dass sie bündig sitzt.

Setzen Sie als Nächstes den Insektenstummel in einem Winkel in den Schaumstoff ein, der es der verdrahteten Mücke ermöglicht, beim Aufwachen bequem zu stehen. Sobald die gewünschte Anzahl von Mücken verkabelt ist, legen Sie den Schaumstoffblock in eine Aufbewahrungsbox und pflegen Sie sie. Befestigen Sie zu Beginn die Aufzeichnungselektroden am Elektropenetographie- oder EPG-Experimentiertag an den Mücken.

Sobald der Host in Position ist, drehen Sie den Kopfverstärker zur Seite. Nachdem Sie eine kabelgebundene Mücke entfernt haben, stecken Sie den Messingstift des Insektenstummels in die Öffnung am Kopfverstärker. Starten Sie die Aufnahme mit der Hardware-Management-Software.

Positionieren Sie den Kopfverstärker über der Hand, so dass die Mücke bequem stehen und sondieren kann. Schalten Sie den Top-Verstärker ein, während er geerdet ist. Passen Sie die Position der Host-Hand nach Bedarf an, um den Erfolg der Sondierung zu unterstützen.

Verwenden Sie die Hardware-Management-Software, um Beobachtungen mit Zeitstempel in Bezug auf Host-Antworten, Mückenverhalten, Verstärkungsänderungen und andere relevante Ereignisse während der Aufzeichnung vorzunehmen. Passen Sie die Position der Signale auf dem Bildschirm und die Softwareverstärkung mit der Hardware-Management-Software an, um beide Signale deutlich sichtbar zu halten. Um die Hardware-Verstärkung anzupassen, drehen Sie den Kanalbereich um einen Bereich und die Multiplikatorschalter um.

Wenn diese Einstellung nicht ausreicht, drehen Sie den Gain-Regler für Kanal eins nach rechts oder links, um den Gain zu erhöhen bzw. zu verringern und so Peak-Outs oder unklare Spitzen zu vermeiden. Um den Offset zu optimieren, stellen Sie den Offset-Schalter des Kanals um einen Schalter an der Steuerbox auf neg. Drehen Sie dann den Kanal um einen Offset-Regler, bis die Spitzen in den Vor- und Nachsignalen in der gleichen Richtung auf dem Computerbildschirm erscheinen.

Wenn sich die Mücke in der Mitte einer Sonde befindet, lassen Sie sie fertig werden. Wenn er nicht innerhalb von 10 Minuten prüft, schalten Sie den Kopfverstärker aus. Lassen Sie den Wirt vorsichtig seine Hand entfernen und entfernen Sie dann die Mücke mit dem beigefügten Insektenstumpf.

Zum Schluss setzen Sie die Mücke wieder in die Aufbewahrungsbox ein. AC-DC-EPG-Aufzeichnungen von Culex tarsalis-Mücken, die sich von menschlichen Händen ernähren, erzeugten interpretierbare Wellenformen, die sich für die Klassifizierung in Familien, Typen und Subtypen eignen.