Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der durch Stechmücken übertragenen Krankheiten zu beantworten, z. B. ob eine Mückenart ein kompetenter Vektor für ein bestimmtes Virus ist oder nicht. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass eine große Anzahl von Mücken gleichzeitig analysiert werden kann, ohne dass Labortiere wie Mäuse verwendet werden müssen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie feinmotorische Fähigkeiten erfordert, die nur durch Übung erworben werden können.

visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die wichtigsten Schritte schwer zu erlernen sind. Sie erfordern Erfahrung im Umgang mit Mücken und Viren, aber auch Feinmotorik. Verdünnen Sie zunächst den Virusbestand. Mischen Sie dann abgelaufenes menschliches Blut mit Fruktose, filtriertem Rinderserum und der Virusbrühe.

Frieren Sie 140 Mikroliter Blutmehlmischung für die weitere Analyse über TCID50 ein. Geben Sie dann zwei 50-Mikroliter-Tröpfchen der Blutmehlmischung in ein Plastikfläschchen und lassen Sie die Mücken zwei Stunden lang fressen. Nachdem Sie die Mücken betäubt haben, zählen Sie die vollständig angeschwollenen Individuen und geben Sie sie in ein neues Fläschchen mit einem in Fruktose getränkten Wattepad.

Halten Sie die Mücken dann 14 oder 21 Tage lang bei 27 Grad Celsius und 80 % Luftfeuchtigkeit. Füllen Sie die mit Fruktose getränkten Wattepads alle 72 Stunden mit 1,5 Millilitern Fruktose auf. Zuerst werden 20.000 Vero-Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit zugesetztem Wachstumsmedium gesät.

Um das Speichelgerät vorzubereiten, stellen Sie eine quadratische Glasplatte in einem Winkel von 30 Grad auf die Bank. Kleben Sie dann doppelseitiges Klebeband auf die Oberseite der Glasplatte. Rollen Sie dann Modelliermasse bis zu einem Durchmesser von 0,5 Zentimetern und befestigen Sie sie horizontal einen Zentimeter vom doppelseitigen Klebeband entfernt an der Platte.

Schneiden Sie die Spitzen von der erforderlichen Anzahl von 10-Mikroliter-Filterspitzen ab und füllen Sie jede Spitze mit 10 Mikrolitern PBS. Legen Sie dann die Spitzen auf die Modelliermasse und fixieren Sie sie mit leichtem Druck. Als nächstes machen Sie die Mücken bewegungsunfähig, indem Sie ihre Beine und Flügel entfernen.

Befestigen Sie die Mücken an dem Klebeband über den Filterspitzen. Stecken Sie den Rüssel jeder Mücke vorsichtig in eine Filterspitze. Entfernen Sie nach 30 Minuten die Filterspitzen und entsorgen Sie den Ton und das Klebeband.

Den gesammelten Speichel in Reaktionsröhrchen mit 10 Mikrolitern PBS überführen. Mischen Sie den Speichel und PBS vorsichtig und geben Sie die Mischung in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Überprüfen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop auf das Vorhandensein einer zytopathischen Wirkung. Sobald eine Vertiefung positiv für die zytopathische Wirkung ist, verwenden Sie eine Pipette, um 140 Mikroliter des Überstands zu ernten. Dann wird der Überstand in ein Reaktionsgefäß überführt.

Mischen Sie anschließend 140 Mikroliter des Überstands mit 560 Mikrolitern AVL-Puffer und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zum Schluss fügen Sie 560 Mikroliter Ethanol hinzu und drehen Sie die Probe um, um sie zu mischen. Mit Hilfe dieses Protokolls wurden mehrere Mückenarten unter verschiedenen klimatischen Bedingungen auf Zika-Virus-Infektionen und -Übertragung getestet.

Unter 27 Grad Celsius Inkubationsbedingungen zeigten alle Aedes-Speichel Zika-Virus-positiven Speichel. Umgekehrt enthielt keine der Speichelproben der Culex-Taxa Hinweise auf das Virus. Einmal gemeistert, kann diese Technik bei richtiger Ausführung für 50 Mücken in einer Stunde durchgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Experimente mit erzwungenem Speichelfluss durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit infizierten Mücken sehr gefährlich sein kann, daher sollten bei der Durchführung eines Experiments immer besondere Sicherheitsmaßnahmen für den Umgang mit Mücken unter BSA-3-Bedingungen getroffen werden.