Name: Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Methode des erzwungenen Speichelflusses zur Analyse der Vektorkompetenz von Stechmücken für das Zika-Virus. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung zahlreicher Mücken ohne Labortiere.

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Wir bedanken uns bei Ella Weinert, Michelle Helms und Marlis Badusche für hervorragende technische Unterstützung, Jessica Börstler für Analysen von Culex -Mücken, Norbert Becker und Björn Pluskota für die Bereitstellung von Aedes Albopictus Eier und Olli Vapalahti für Bereitstellung den Virus bestand. ML wurde von der Leibniz-Gemeinschaft unterstützt; Nummer Säge-2014-SGN-3 zu gewähren.

1. bereiten Sie weibliche Stechmücken
<ol><li>Sammeln Sie Mücken aus ein großer Käfig mit einer Absauganlage (ca. 400 Mücken pro großer Käfig).</li>
	<li>Betäuben Sie die Mücken mit Kohlendioxid (CO2) für 7 s.</li>
	<li>Sortieren Sie 20 Weibchen pro Kunststoff Vial (Ø 50 mm × 100 mm). Hinweis: Wenn die Mücken aufwachen, verwenden Sie weitere 3 s Co2.
</li>
	<li>Verhungern Sie die Mücken über Nacht.</li>
</ol>2. künstliche Blutmahlzeit
Hinweis: Alle Schritte sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>
Bereiten Sie die infektiöse Blutmahlzeit.
	<ol>
<li>Verdünnen Sie den Virus bestand, die Konzentration von 1 x 108 Plaque bilden Einheiten (PFU) / mL. Hinweis: Die Lager Konzentration wurde bestimmt durch Gewebekultur Infektion Dosis 50-Methode (TCID50) ausführen und berechnet, indem die Spearman & Kärber Algorithmus10,11.</li>
		<li>Mix abgelaufen menschliches Blut (Blut-Erhaltung) von der Blutbank (nicht geeignet für Menschen mehr, aber nützlich für die Mücken) mit Fruchtzucker (8 % ige Lösung), filtriert, bovine Serum (FBS) und funktionierende Lösung des Bestands Virus (menschliches Blut: Fruktose: FBS abgelaufen: Arbeitslösung = 5:3:1:1). Hinweis: Wir entschieden uns für menschliches Blut, denn dies ist der bekannte natürliche Säugetier-Gastgeber des ZIKV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>140 µL Blutmahlzeit Mix zur weiteren Analyse über TCID50 einfrieren.</li>
	<li>
Führen Sie die künstliche Ernährung mit verschiedenen Fütterung Methoden, abhängig von der Sorte:
	<ol>
<li>
Aedes Aegypti: verwenden eine Membran Fütterungssystem für 30 min (1 mL pro Feeder).</li>
		<li>
Culex spp.: bieten die ansteckende Blut über ein Wattestäbchen über Nacht und nicht das Blut (300 µL pro Fläschchen) Aufwärmen.</li>
		<li>
Aedes Albopictus: zwei Tropfen (50 µL) der Blutmahlzeit Mischung in die Kunststoff-Flasche und lassen die Moskitos für 2 h füttern. Das Blut nicht Aufwärmen. Hinweis: Die Mücken werden in den ersten 15 min einfließen. Die längeren Inkubationszeit ist aus Sicherheitsgründen notwendig. Die Tröpfchen Blut abgelassen nach 2 h, damit das Kontaminationsrisiko reduziert wird, während die Sortierung der Mücken gefüttert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Betäuben Sie die Mücken mit CO2 für 7 s. Hinweis: Wenn die Mücken aufwachen, verwenden Sie weitere 3 s CO2.</li>
	<li>Art und Anzahl voll gestaut Mücken in ein neues Fläschchen.</li>
	<li>Fügen Sie ein Wattepad, gesättigt mit Fruchtzucker (8 % ige Lösung) zwischen das Fläschchen und ein Stecker.</li>
	<li>Halten Sie die Mücken an der vorgesehenen Temperatur von 18 ° C und 27 ° C in der Luftfeuchtigkeit von 80 % für 14 oder 21 Tage.</li>
	<li>Füttern Sie die Mücken mit Fruktose gesättigte Wattepads. Alle 72 h mit Fruktose (8 % ige Lösung) pro Fläschchen 1,5 mL Auffüllen (bis zu 20 Mücken, abhängig von der Fütterung bewerten, siehe Punkt 2.5).</li>
</ol>(3) gezwungen Speichelfluss Assay an Tag 14 oder 21
Hinweis: Alle Schritte sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>2 x 104 Vero-Zellen Seed / pro Bohrloch in ein 96 sowie Platte mit 200 µL Wachstumsmedium (Dulbecco´s modifiziert Eagle Medium (DMEM) mit 3 % FBS, 100 U/mL Penicillin, 100 mg/mL Streptomycin, 5 µg/mL Amphotericin B, 2 mM L-Glutamin ergänzt 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1 % Natrium Pyruvat).</li>
	<li>
Bereiten Sie das Speichelfluss-Gerät:
	<ol>
<li>Legen Sie eine quadratische Glasplatte (20 × 20 cm) auf der Bank in einem Winkel von 30°. Hinweis: Dies ist notwendig, da der Unterdruck im Sicherheitslabor. Wenn die Platte horizontal oder vertikal, wird Flüssigkeit austreten.</li>
		<li>Legen Sie doppelseitiges Klebeband auf die Glasplatte.</li>
		<li>Rolle der Modelliermasse bis es erreicht einen Durchmesser von 0,5 cm und horizontal 1 cm entfernt von dem doppelseitigen Klebeband befestigen.</li>
		<li>Die ersten 0,3 cm von der Spitze der eine 10 µL Filterspitze abgeschnitten. Hinweis: Es empfiehlt sich, dies vor Beginn des Experiments außerhalb des Biosafety Labors vorzubereiten.</li>
		<li>Füllen Sie die Filter-Tips mit 10 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Legen Sie die Filter-Tips auf die Modelliermasse mit der Spitze in Richtung der Klebeband.</li>
		<li>Sichern Sie die Filter-Tips mit sanftem Druck.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie die Mücken:
	<ol>
<li>Die Mücken mit CO2zu betäuben.</li>
		<li>Entfernen Sie die Beine und Flügel, die Mücken zu immobilisieren.</li>
		<li>Befestigen Sie die Mücke lebenden Körper auf Klebeband über eine Filterspitze.</li>
		<li>Legen Sie den Rüssel sanft in die Filterspitze.</li>
		<li>Laufen Sie den Speichelfluss Test für 30 min.</li>
		<li>Entfernen Sie die Filter-Tips und entsorgen Sie der Lehm und Band.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Verarbeitung von Speichel
Hinweis: Schritte 4.1 – 4.6.2 sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>Vertreiben Sie den Inhalt in die Reaktionsgefäße mit 10 µL PBS.</li>
	<li>Mischen Sie vorsichtig und übertragen Sie die Inhalte in die Vertiefungen der vorbereiteten 96-well-Platte mit einem Brunnen pro Probe.</li>
	<li>7 Tage bei 37 ° C mit 5 % CO2inkubieren Sie Platte.</li>
	<li>Verwenden Sie das Fernglas, um die Zellen auf das Vorhandensein von Zytopathischer Effekt (CPE) überprüfen.</li>
	<li>Wenn die nun positiv für CPE, Ernten des Überstands durch pipettieren 140 µL in einem Reaktionsgefäß für RNA-Extraktion.</li>
	<li>
Reinigen Sie die RNA mittels einer RNA-Extraktion-Kit.
	<ol>
<li>Mix-140 µL des Überstands mit 560 µL AVL Puffer (virale Lyse Puffer) und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Hinzufügen von 560 µL Ethanol (96 %) und Wirbel der Probe. Hinweis: Die Proben sind nach diesem Schritt deaktiviert und aus dem Labor BSL-3 abgeführt werden können.</li>
		<li>Pipettieren 630 µL der Probe auf eine Spalte und Zentrifuge mit 6.000 x g für 1 min.</li>
		<li>Verwerfen Sie das Filtrat, pipettieren der verbleibenden 630 µL auf die Spalte zu und wiederholen Sie die Zentrifugation.</li>
		<li>Waschen der RNS, gebunden an die Membran der Spalte, durch Zugabe von 500 µL Waschpuffer 1 Spalte und Zentrifuge bei 6.000 X g für 1 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie das sammelröhrchen und legen Sie die Spalte in eine neue Kollektion-Röhre. Fügen Sie 500 µL waschen Puffer 2 und Zentrifuge bei 12.500 X g für 3 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie das sammelröhrchen und legen Sie die Spalte in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß.</li>
		<li>Fügen Sie 50 µL der Elution Buffer und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Bei 6.000 X g für 1 min zentrifugieren Sie und verwerfen Sie die Spalte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Proben für ZIKV RNA durch RT-qPCR analysieren.</li>
</ol>5. Bearbeitung von Mosquito Körper
Hinweis: Die Schritte 5.1-5.5 sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>Entfernen Sie der Körper des Moskitos und jeder Körper in einem Reaktionsgefäß. Hinweis: Es ist möglich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten und speichern die Proben bei-80 ° C.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL der Homogenisierung Medien (DMEM ohne irgendwelche Nahrungsergänzungsmittel) in das Reaktionsgefäß.</li>
	<li>Homogenisieren Sie den Körper mit motor Handmixer zu und verwenden Sie einen neuen Stempel für jede Probe.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Das Homogenat in eine 96-Well-Platte für die Reinigung. Hinweis: Es ist möglich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten und speichern die Proben bei-80 ° C.</li>
	<li>Deaktivieren Sie die Platte durch Inkubation für 60 min bei 60 ° C.</li>
	<li>Reinigen Sie die RNA durch automatisierte Nukleinsäure-Reinigung. Hinweis: Es ist möglich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten und speichern die Proben bei-80 ° C.</li>
</ol>6. Analyse
<ol><li>Die virale RNA-Kopien mit RT-qPCR zu quantifizieren. Hinweis: Die RNA-Kopien wurden gemittelt über alle ZIKV-positiven Moskito Körper und ohne Einbeziehung der ZIKV-Negative Mücken.</li>
	<li>Berechnen Sie die IR, definiert als die Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper pro Anzahl der Weibchen gefüttert.</li>
	<li>TR, definiert als die Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper zu berechnen. Die Übertragungsrate konnte nicht für Arten-Temperatur-Kombinationen mit keine ZIKV-positiven Körper berechnet werden.</li>
</ol>

<ol><li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li>
<li>World Health Organization Regional Office for Europpe (WHO/Europe). No Title. , Available from:
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<li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933(2017).</li>
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<li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1439-0442.1985.tb01965.x">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt für Veterinärmedizin R A. 32 (1-10), 480(2010).</li>
<li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li>
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<li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes%3A+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895(2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Bisher hat sich gezeigt, dass klassische neu Fütterung Experimente6Ergebnisse mit erzwungenen Speichelfluss entsprechen. Jedoch ist wieder Fütterungsversuche sowohl in unsere vorgestellte Methode der erzwungenen Speichelfluss, es unmöglich, direkt Nachweis Speichelfluss Aktivität oder die Freisetzung von Speichel zu überwachen. Um Speichelfluss Aktivität zu beweisen, konnte Proben getestet werden, für andere Komponenten im Speichel vorhanden (zB., Proteine, Kohlenhydrate, etc..). Darüber hinaus könnten zusätzliche qPCRs Nachweis von viraler RNA-Kopien. Dies erfordert allerdings, Spaltung der Speichelproben für verschiedene Analysen, die Empfindlichkeit in der Zelle Kultur Test bei sehr niedrigen Partikelanzahl begrenzen können. Im Gegenzug könnte dies zu einer Unterschätzung des ermittelten Übertragungsraten.
Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen ist es notwendig, um sicherzustellen, dass alle Mücken bis zum Ende des Experiments am Leben zu bleiben. Dies wird gesteuert, indem Sie visuell überwachen den Körper Bewegungsaktivität der Moskitos. Darüber hinaus hat die Prinzip Verwendung des Speichelfluss Assays für einen bestimmten Mückenarten getestet werden, durch die Fütterung von Kontrolle-Viren, die bekannt sind, durch diese bestimmte Mückenarten übertragen werden. Umgekehrt, hat jeder Virus erstmals in einem Experiment in einer anfälligen Mücke getestet werden.
Erzwungene Speichelfluss Assays haben viele Vorteile. Hohe Anzahl von Mücken können gleichzeitig auf einem einzigen Exemplar unter kontrollierten standardisierten Bedingungen getestet werden, ohne dass Konflikte mit Tierschutz Vorschriften9.
Die Methode wird von mehreren Labors verwendet. Genaue Einstellungen können jedoch abweichen, um Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Labors führen kann. Eine wichtige Komponente ist die Kapillare, den Speichel zu sammeln, die von Glas14 oder Kunststoff15erfolgen kann. Zur Einhaltung der hohen Sicherheitsbestimmungen ein Biosafety Level 3 Insectary benutzten wir Kunststoff Filterspitzen anstelle von Glaskapillaren, wodurch das Risiko von Verletzungen. Filter-Tips haben darüber hinaus den Vorteil, dass die gesammelte Flüssigkeit mit einer Pipette leicht übertragen werden kann.
Das Setup des hier vorgestellten erzwungene Speichelfluss Assays beruht auf zwei Ermittler arbeiten zusammen und teilen Aufgaben. Demobilisierung der Mücke wird von einer Person durchgeführt, während die andere gleichzeitig das erzwungene Speichelfluss Setup bereitet. Dies reduziert die Bearbeitungszeit erheblich und minimiert das Risiko der Probe Schalter als Wechsel zwischen der Demobilisierung-Arbeitsplatz und den Speichelfluss-Platte ist nicht notwendig. Darüber hinaus erlaubt es die Mücken auf dem erzwungenen Speichelfluss Gerät sofort nach der Demobilisierung platzieren. Diese eher kurze Mücke Bearbeitungszeit ist entscheidend für erfolgreiche erzwungene Speichelfluss. Schließlich können die Mücken direkt auf Motilität in das ganze Experiment überwacht werden.
Die hier vorgestellten Speichelfluss-Assay wird verwendet, um Einblicke in das Vektor-Potenzial der Mückenarten. Jedoch, einige konkreten Fragen zu beantworten (zB., die Zahlen von Mückenstichen, die erforderlich sind, um Wirbeltiere infizieren), tierische Experimente noch erforderlich sein könnten.

In 2015, Zika-Virus (ZIKV), assoziiert ein Moskitos übertragene Virus (Mobovirus) aus der Familie , die Flaviviridae, in Kolumbien und Brasilien entstand und verbreitete sich rasch in ganz Nord-und Südamerika und der Karibik, verursacht eine Epidemie mit einer bemerkenswerten Anzahl von klinische Fälle von Mikrozephalie und Guillain-Barré-Syndrom1. Stechmücken der Gattung Aedes Aegypti und Aedes Albopictus gelten die primären und sekundären Vektoren von ZIKV2, aber andere Arten der Gattung Aedes haben auch bewiesen, experimentelle vektorkompetenz3 haben . Im Gegensatz zu den Aedes -Arten sind die meisten der Gattung Culex getestet bisher nicht in der Lage, das Virus4übertragen. Bloß, lieferten die Daten für Culex Quinquefasciatus eindeutigen Ergebnisse3. Derzeit fehlen Informationen über Moskito vektorkompetenz für ZIKV bei moderaten Temperaturen (< 20 ° C). Diese Information ist jedoch wesentlich für die Risikobewertung von möglichen Spreads in Regionen mit gemäßigtem Klima wie Mitteleuropa.
Ein kompetenter Vektor für ZIKV ist in der Lage zu erwerben, zu erhalten, zu verstärken und schließlich das Virus übertragen. Deshalb testen die Mücke Organe oder Körperteile, wie Beine, Mitteldarm, Kopf oder Speicheldrüsen, für ZIKV nicht ausreichen, um vektorkompetenz bestimmen. Es ist obligatorisch, infektiösen Viruspartikeln in freigegebenen Speichel testen. Zur Beurteilung vektorkompetenz müssen Infektionsrate (IR, Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper pro Anzahl der engorged Mücken) und Übertragungsrate (TR, Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper), bestimmt. IRs Mücken kann leicht durch einfach homogenisierende Mücken gefolgt von eine Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) analysiert werden gezielt ZIKV. Darüber hinaus kann die Infektion weiter charakterisiert werden, durch die Bestimmung der viralen heftnummern pro Mücke. Im Gegensatz dazu setzt die Analyse der Übertragungsraten auf die Erkennung von lebensfähigen Viruspartikel im Speichel der einzelnen Mücken. Dies kann erreicht werden durch die Fütterung von infizierten Mücken auf empfänglichen Wirtstiere, gefolgt von der Analyse der Virämie in der Host-5. Jedoch diese Methode stützt sich auf geeignete Modellorganismen und ist kostspielig und durch Tierschutz Vorschriften beschränkt. Um den Einsatz von Versuchstieren für die Analyse von Übertragungsraten zu vermeiden und Kosten zu senken, beschrieben künstliche neu Zuführsysteme mit Blut Tropfen wurden6. Prüfung auf individuellen Ebene kombiniert mit einer hohen Anzahl von Personen ist jedoch schwierig und zeitaufwändig. Die erste Beschreibung eines Speichelfluss Assays auf individueller Ebene erschien 19667 und erzwungene Speichelfluss Experimente geworden in den letzten Jahren die Methode der Wahl, die vektorkompetenz von Stechmücken3,8 zu bewerten .
Basierend auf unsere Vektor-Kompetenz-Studie der mitteleuropäischen Mücken veröffentlichte vor kurzem9, beschreiben wir gezwungen Speichelfluss, wie Anderson Et al.berichtet. 8 mit einigen Änderungen. Diese Methode ermöglicht hoher Durchsatz standardisiert Experimente Bedingungen hohe Biosafety Niveau (BSL-3) und umfasst die Ermittlung des aktiven Virus durch Zelle Kultur basierte Assays. Die hier beschriebenen Experimente gehören 856 Mücken. Sie waren mit ZIKV durch künstliche Blutmahlzeit angesteckt und anschließend auf das Vorhandensein von infektiösen Viruspartikeln im Speichel analysiert. Die Mücken in die Experimente bestand aus zwei alteingesessenen Labor Populationen von Ae. Aegypti und Culex Pipiens Pipiens Biotyp Molestus (Cx. p. Molestus) sowie Feld eingeführt gefangen Culex Pipiens Pipiens Biotyp Pipiens (Cx. s. Pipiens), Culex Torrentium (Cx. Torrentium) und zwei Ae. Albopictus Populationen. Mit Ausnahme von einem der beiden Ae. Albopictus Populationen, die in Italien gesammelt wurde, wurden alle Mücken in Deutschland gesammelt.

<table><tbody><tr><td>Inject+matic Sleeper</td><td>Inject+matic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1 Insektenaufzuchtkäfig</td><td>BugDorm Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Kultivierungsröhrchen</td><td>Carl Roth</td><td>PK11.2</td><td>Kunststofffläschchen für Mücken</td></tr><tr><td>Stopfen für Drosophila-Kultivierungsröhrchen</td><td>Carl Roth</td><td>PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>Konstantklimaschrank</td><td>Binder</td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td>Blutkonserven</td><td></td><td></td><td>von menschlichem Blut, abgelaufen, nicht verwendbar für medizinische Anwendungen</td></tr><tr><td>Dumont-Pincette Electronic SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>Vero Zellen</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blitzlichtaspirator</td><td>Bioquip</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>doppelseitiges Klebeband</td><td></td><td></td><td>kein spezifischer Anbieter</td></tr><tr><td>Gammex Puderfreie Handschuhe mit AMT</td><td>Ansell</td><td></td><td>aus Sicherheitsgründen, die bei der Arbeit mit Stichen im BSL3-Labor erforderlich</td></tr><tr><td>sind RealStar Zika-Virus RT-PCR-Kit</td><td>Altona Diagnostik</td><td>591013</td><td></td></tr><tr><td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td><td>Thermo Fisher wissenschaftliche</td><td>4462359 RNA-Isolierung</td><td>von Mückenkörpern</td></tr><tr><td>Qiamp virale RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-Isolierung des Überstandsfilters</td></tr><tr><td> Trinkgelder (20 & Mikro; L)</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>Schneiden Sie die ersten 3 mm der Spitze</td></tr><tr><td>Handmotormischer</td><td>Carl Roth</td><td>ausverkauft</td><td></td></tr><tr><td>Mikrostößel für Handmotormischer</td><td>Carl Roth</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamin Penicilin / Streptomycin</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>Fruktose</td><td>carl roth</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr> P0832100 <tr><td>Hemotek Feeder</td><td>Hemotek</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Software</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Modelliermasse</td><td></td><td></td><td>kein spezifischer Anbieter</td></tr><tr><td>King Fisher Flex Purification System</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aedes albopictus</td><td></td><td></td><td>Eier wurden in Freiburg, Deutschland</td></tr><tr><td>gesammelt Binokular</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Binokulares Licht</td><td>MOTIC</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>Thermo scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

gezwungen speichelfluss als methode zur vektorkompetenz von stechmücken analyse

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vektorkompetenz ist definiert als das Potenzial einer Mückenarten Moskitos übertragene Virus (Mobovirus) zu einem fest gefügten Host übertragen. Tragfähige Viruspartikel sind während einer Blutmahlzeit über den Speichel einer infizierten Mücke übertragen. Erzwungene Speichelfluss Assays ermöglichen Bestimmung der potentiellen Vektor auf der Grundlage der einzelnen Mücken, den Verzicht auf Tierversuche. Die Methode ist geeignet, eine große Anzahl von Mücken in einem Experiment innerhalb kurzer Zeit zu analysieren. Erzwungene Speichelfluss Assays wurden verwendet, um 856 einzelne Mücken in Deutschland, darunter zwei verschiedene gefangen analysieren Culex Pipiens Pipiens Biotope, Culex Torrentium sowie Aedes Albopictus, die experimentell infiziert wurden mit Zika-Virus (ZIKV) und inkubierten bei 18 ° C und 27 ° C für zwei bis drei Wochen. Die Ergebnisse zeigten die mangelnde vektorkompetenz von verschiedenen Culex Taxa für ZIKV. Im Gegensatz dazu war Aedes Albopictus anfällig für ZIKV, aber nur bei 27 ° C, mit Übertragungsraten, die ähnlich wie eine Aedes Aegypti Labor Kolonie parallel getestet.

Aedes Aegypti ist als kompetenter Vektor für ZIKV zumindest unter tropischen Klimabedingungen12bekannt. Daher verwendet wir Ae. Aegypti als Positivkontrolle der Assay etablieren und IRs sowie TRs bei einer Inkubationstemperatur von 27 ° C und einer Luftfeuchtigkeit von 80 % zu analysieren. IR und TR wurden definiert, wie zuvor beschrieben von Fortuna Et Al. 13. Challenged Ae. Aegypti zeigte IR von 50 % und 72 % und TR von 42 % und 31 % bei 14 und 21 Tagen post Infektion (dpi), bzw. (Abbildung 1A und 1 b). Anschließend wurden europäische Stechmücken für ZIKV Infektion und Übertragung mit tropischen sowie gemäßigten klimatischen Bedingungen getestet.
Bei 27 ° C Inkubationstemperatur zeigten alle Mückenarten ZIKV Infektion an 14 dpi sowie 21 dpi, mit Ausnahme von s. Pipiens Cx. und Cx. Torrentium Einzelpersonen, die mit 14 dpi nur positiv waren. Alle Arten der Aedes zeigte höhere IRs (zwischen 50 % und 72 %) sowie höhere virale RNA-Konzentration (106 bis 109 RNA-Kopien/Moskito-Proben) im Vergleich zu den verschiedenen Taxa Culex , offenbart die IRs zwischen 0 % und 32 % und Viruslast von 103 104 RNA-Kopien/Moskito-Proben. Alle Arten der Aedes angezeigt ZIKV-positiven Speichel (TR 13 – 42 %), während keiner der Speichelproben von Culex Taxa ZIKV (Abbildung 1A und 1 b) enthalten. Interessanterweise Übertragungsraten bei 21 dpi waren ähnlich in Ae. Aegypti und Ae. Albopictus aus Deutschland (30 %), aber deutlich niedriger in Ae. Albopictus aus Italien (13 %).
Inkubation von herausgefordert Mücken bei mäßiger Temperatur von 18 ° C zeigte im Allgemeinen niedriger Virus lädt in der Aedes -Arten (104– 106 RNA Kopien/Mücke) sowie in den verschiedenen Culex Taxa (102 –104 RNA Kopien/Mücke). Jedoch wurde bei 18 ° C Inkubationstemperatur, Übertragung von ZIKV nicht für eines der untersuchten Mückenarten beobachtet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> Abbildung 1: Übertragungsraten von Mücken experimentell infiziert mit ZIKV. Ergebnisse der Vektor-Kompetenz-Studium mit ZIKV in verschiedenen Mückenarten. Sechs verschiedene Moskito Taxa wurden mit ZIKV infiziert und bei 27 ° C und 18 ° C für 14 (A) oder 21 (B) Tage inkubiert. TR ist definiert als die Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper. Die Gesamtzahl der Moskitos untersucht wurde 856, mit einem Minimum von 30 Personen für jede Zeit-Punkt/Temperatur/Moskito-Taxa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.

Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der durch Stechmücken übertragenen Krankheiten zu beantworten, z. B. ob eine Mückenart ein kompetenter Vektor für ein bestimmtes Virus ist oder nicht. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass eine große Anzahl von Mücken gleichzeitig analysiert werden kann, ohne dass Labortiere wie Mäuse verwendet werden müssen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie feinmotorische Fähigkeiten erfordert, die nur durch Übung erworben werden können.Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die wichtigsten Schritte schwer zu erlernen sind. Sie erfordern Erfahrung im Umgang mit Mücken und Viren, aber auch Feinmotorik. Verdünnen Sie zunächst den Virusbestand. Mischen Sie dann abgelaufenes menschliches Blut mit Fruktose, filtriertem Rinderserum und der Virusbrühe.Frieren Sie 140 Mikroliter Blutmehlmischung für die weitere Analyse über TCID50 ein. Geben Sie dann zwei 50-Mikroliter-Tröpfchen der Blutmehlmischung in ein Plastikfläschchen und lassen Sie die Mücken zwei Stunden lang fressen. Nachdem Sie die Mücken betäubt haben, zählen Sie die vollständig angeschwollenen Individuen und geben Sie sie in ein neues Fläschchen mit einem in Fruktose getränkten Wattepad.Halten Sie die Mücken dann 14 oder 21 Tage lang bei 27 Grad Celsius und 80 % Luftfeuchtigkeit. Füllen Sie die mit Fruktose getränkten Wattepads alle 72 Stunden mit 1,5 Millilitern Fruktose auf. Zuerst werden 20.000 Vero-Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit zugesetztem Wachstumsmedium gesät.Um das Speichelgerät vorzubereiten, stellen Sie eine quadratische Glasplatte in einem Winkel von 30 Grad auf die Bank. Kleben Sie dann doppelseitiges Klebeband auf die Oberseite der Glasplatte. Rollen Sie dann Modelliermasse bis zu einem Durchmesser von 0,5 Zentimetern und befestigen Sie sie horizontal einen Zentimeter vom doppelseitigen Klebeband entfernt an der Platte.Schneiden Sie die Spitzen von der erforderlichen Anzahl von 10-Mikroliter-Filterspitzen ab und füllen Sie jede Spitze mit 10 Mikrolitern PBS. Legen Sie dann die Spitzen auf die Modelliermasse und fixieren Sie sie mit leichtem Druck. Als nächstes machen Sie die Mücken bewegungsunfähig, indem Sie ihre Beine und Flügel entfernen.Befestigen Sie die Mücken an dem Klebeband über den Filterspitzen. Stecken Sie den Rüssel jeder Mücke vorsichtig in eine Filterspitze. Entfernen Sie nach 30 Minuten die Filterspitzen und entsorgen Sie den Ton und das Klebeband.Den gesammelten Speichel in Reaktionsröhrchen mit 10 Mikrolitern PBS überführen. Mischen Sie den Speichel und PBS vorsichtig und geben Sie die Mischung in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.Überprüfen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop auf das Vorhandensein einer zytopathischen Wirkung. Sobald eine Vertiefung positiv für die zytopathische Wirkung ist, verwenden Sie eine Pipette, um 140 Mikroliter des Überstands zu ernten. Dann wird der Überstand in ein Reaktionsgefäß überführt.Mischen Sie anschließend 140 Mikroliter des Überstands mit 560 Mikrolitern AVL-Puffer und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zum Schluss fügen Sie 560 Mikroliter Ethanol hinzu und drehen Sie die Probe um, um sie zu mischen. Mit Hilfe dieses Protokolls wurden mehrere Mückenarten unter verschiedenen klimatischen Bedingungen auf Zika-Virus-Infektionen und -Übertragung getestet.Unter 27 Grad Celsius Inkubationsbedingungen zeigten alle Aedes-Speichel Zika-Virus-positiven Speichel. Umgekehrt enthielt keine der Speichelproben der Culex-Taxa Hinweise auf das Virus. Einmal gemeistert, kann diese Technik bei richtiger Ausführung für 50 Mücken in einer Stunde durchgeführt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Experimente mit erzwungenem Speichelfluss durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit infizierten Mücken sehr gefährlich sein kann, daher sollten bei der Durchführung eines Experiments immer besondere Sicherheitsmaßnahmen für den Umgang mit Mücken unter BSA-3-Bedingungen getroffen werden.

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Forschung

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Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

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