Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse
August 7th, 2018
Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.
Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der durch Stechmücken übertragenen Krankheiten zu beantworten, z. B. ob eine Mückenart ein kompetenter Vektor für ein bestimmtes Virus ist oder nicht. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass eine große Anzahl von Mücken gleichzeitig analysiert werden kann, ohne dass Labortiere wie Mäuse verwendet werden müssen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie feinmotorische Fähigkeiten erfordert, die nur durch Übung erworben werden können.
Dievisuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die wichtigsten Schritte schwer zu erlernen sind. Sie erfordern Erfahrung im Umgang mit Mücken und Viren, aber auch Feinmotorik. Verdünnen Sie zunächst den Virusbestand. Mischen Sie dann abgelaufenes menschliches Blut mit Fruktose, filtriertem Rinderserum und der Virusbrühe.
Frieren Sie 140 Mikroliter Blutmehlmischung für die weitere Analyse über TCID50 ein. Geben Sie dann zwei 50-Mikroliter-Tröpfchen der Blutmehlmischung in ein Plastikfläschchen und lassen Sie die Mücken zwei Stunden lang fressen. Nachdem Sie die Mücken betäubt haben, zählen Sie die vollständig angeschwollenen Individuen und geben Sie sie in ein neues Fläschchen mit einem in Fruktose getränkten Wattepad.
Halten Sie die Mücken dann 14 oder 21 Tage lang bei 27 Grad Celsius und 80 % Luftfeuchtigkeit. Füllen Sie die mit Fruktose getränkten Wattepads alle 72 Stunden mit 1,5 Millilitern Fruktose auf. Zuerst werden 20.000 Vero-Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit zugesetztem Wachstumsmedium gesät.
Um das Speichelgerät vorzubereiten, stellen Sie eine quadratische Glasplatte in einem Winkel von 30 Grad auf die Bank. Kleben Sie dann doppelseitiges Klebeband auf die Oberseite der Glasplatte. Rollen Sie dann Modelliermasse bis zu einem Durchmesser von 0,5 Zentimetern und befestigen Sie sie horizontal einen Zentimeter vom doppelseitigen Klebeband entfernt an der Platte.
Schneiden Sie die Spitzen von der erforderlichen Anzahl von 10-Mikroliter-Filterspitzen ab und füllen Sie jede Spitze mit 10 Mikrolitern PBS. Legen Sie dann die Spitzen auf die Modelliermasse und fixieren Sie sie mit leichtem Druck. Als nächstes machen Sie die Mücken bewegungsunfähig, indem Sie ihre Beine und Flügel entfernen.
Befestigen Sie die Mücken an dem Klebeband über den Filterspitzen. Stecken Sie den Rüssel jeder Mücke vorsichtig in eine Filterspitze. Entfernen Sie nach 30 Minuten die Filterspitzen und entsorgen Sie den Ton und das Klebeband.
Den gesammelten Speichel in Reaktionsröhrchen mit 10 Mikrolitern PBS überführen. Mischen Sie den Speichel und PBS vorsichtig und geben Sie die Mischung in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.
Überprüfen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop auf das Vorhandensein einer zytopathischen Wirkung. Sobald eine Vertiefung positiv für die zytopathische Wirkung ist, verwenden Sie eine Pipette, um 140 Mikroliter des Überstands zu ernten. Dann wird der Überstand in ein Reaktionsgefäß überführt.
Mischen Sie anschließend 140 Mikroliter des Überstands mit 560 Mikrolitern AVL-Puffer und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zum Schluss fügen Sie 560 Mikroliter Ethanol hinzu und drehen Sie die Probe um, um sie zu mischen. Mit Hilfe dieses Protokolls wurden mehrere Mückenarten unter verschiedenen klimatischen Bedingungen auf Zika-Virus-Infektionen und -Übertragung getestet.
Unter 27 Grad Celsius Inkubationsbedingungen zeigten alle Aedes-Speichel Zika-Virus-positiven Speichel. Umgekehrt enthielt keine der Speichelproben der Culex-Taxa Hinweise auf das Virus. Einmal gemeistert, kann diese Technik bei richtiger Ausführung für 50 Mücken in einer Stunde durchgeführt werden.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Experimente mit erzwungenem Speichelfluss durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit infizierten Mücken sehr gefährlich sein kann, daher sollten bei der Durchführung eines Experiments immer besondere Sicherheitsmaßnahmen für den Umgang mit Mücken unter BSA-3-Bedingungen getroffen werden.
Übersicht
Dieser Artikel behandelt eine Methode zur Analyse der Vektorkompetenz von Mücken, insbesondere Aedes albopictus und verschiedenen Culex-Taxa, für die Übertragung des Zika-Virus. Die erzwungene Speicheltechnik ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Mücken ohne den Einsatz von Labortieren.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Vektorbiologie
- Virologie
- Von Mücken übertragene Krankheiten
Hintergrund
- Das Verständnis der Vektorkompetenz ist entscheidend für die Kontrolle von durch Mücken übertragenen Viren.
- Erzwungenes Speicheln ist eine neuartige Methode zur Beurteilung des Übertragungspotenzials von Mücken.
- Frühere Methoden erforderten oft Labortiere, was diese Technik zu eliminieren versucht.
- Feinmotorische Fähigkeiten sind für diese Methode unerlässlich und erfordern Übung und Erfahrung.
Zweck der Studie
- Um die Vektorkompetenz verschiedener Mückenarten für das Zika-Virus zu bewerten.
- Um eine Methode zu demonstrieren, die eine Hochdurchsatzanalyse des Mückenspeichels ermöglicht.
- Um eine visuelle Anleitung für Forscher bereitzustellen, die neu in der Technik sind.
Verwendete Methoden
- Zubereitung einer Blutmahlzeitmischung zur Fütterung der Mücken.
- Erzwungene Speicheltechnik zur Sammlung von Speichel von Mücken.
- Zellkulturmethoden zur Beurteilung des Vorhandenseins des Zika-Virus.
- Inkubation und Analyse von Proben auf zytopathische Effekte.
Hauptergebnisse
- Aedes-Arten zeigten positiven Speichel für das Zika-Virus unter kontrollierten Bedingungen.
- Culex-Taxa zeigten keine Anzeichen von Zika-Virus in ihrem Speichel.
- Die Methode ermöglicht die Untersuchung von bis zu 50 Mücken in einer Stunde, wenn sie einmal beherrscht wird.
- Visuelle Demonstrationen unterstützen das Erlernen der Technik erheblich.
Schlussfolgerungen
- Erzwungenes Speicheln ist eine effektive Methode zur Untersuchung der Übertragung von durch Mücken übertragenen Viren.
- Training und Übung sind für die erfolgreiche Umsetzung der Technik unerlässlich.
- Sicherheitsmaßnahmen müssen beim Umgang mit infizierten Mücken eingehalten werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Forced salivation assays enable high-throughput evaluation of mosquito vector competence without animal models, supporting early-stage target validation in antiviral discovery. The method provides quantitative, replication-competent virus detection from individual insects, informing go/no-go decisions for prophylactic or therapeutic candidates against arboviruses. Its scalability and reproducibility enhance predictive confidence in preclinical de-risking of transmission-blocking interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring virus transmission potential in individual disease vectors.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets through direct assessment of vector competence under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying non-competent vector species, reducing false-positive leads in arbovirus programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral screening by confirming virus susceptibility in vector models.
- Operational Value: Standardizes saliva collection and virus detection, ensuring reproducible quantitative outputs across large mosquito cohorts.
- Scalability: Facilitates platform reuse for high-throughput evaluation of transmission-blocking compounds or vaccines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by testing vector competence under epidemiologically relevant temperatures (18–27°C).
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via consistent saliva-based virus readouts.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by establishing temperature-dependent transmission thresholds for lead candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The forced salivation method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for arbovirus-directed interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying virus presence in mosquito saliva as a functional readout of transmission potential.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized saliva collection and TCID50-equivalent virus detection in Vero cells.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (viral titer in saliva) enabling comparison across species, strains, and environmental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via temperature-stratified transmission data that mirrors field-relevant transmission windows.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening multiple arboviruses (e.g., ZIKV, DENV, CHIKV) across vector species without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in transmission biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across entomology and virology teams.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on empirical vector competence data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, virology, and microsurgical techniques under BSL-3 containment.
- Dependent on specialized instrumentation including salivation devices, incubators with precise humidity control, and microscopy for cytopathic effect scoring.
- Necessitates cross-team standardization of bloodmeal preparation, incubation timelines, and saliva collection intervals.
- Adaptation considerations include species-specific proboscis size, feeding behavior, and salivary gland morphology across vector models.
- Practical limitations include the need for extensive training to achieve proficiency and the method’s dependence on viable virus recovery from saliva.
