Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse
7. August 2018
Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.
Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der durch Stechmücken übertragenen Krankheiten zu beantworten, z. B. ob eine Mückenart ein kompetenter Vektor für ein bestimmtes Virus ist oder nicht. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass eine große Anzahl von Mücken gleichzeitig analysiert werden kann, ohne dass Labortiere wie Mäuse verwendet werden müssen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie feinmotorische Fähigkeiten erfordert, die nur durch Übung erworben werden können.
Dievisuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die wichtigsten Schritte schwer zu erlernen sind. Sie erfordern Erfahrung im Umgang mit Mücken und Viren, aber auch Feinmotorik. Verdünnen Sie zunächst den Virusbestand. Mischen Sie dann abgelaufenes menschliches Blut mit Fruktose, filtriertem Rinderserum und der Virusbrühe.
Frieren Sie 140 Mikroliter Blutmehlmischung für die weitere Analyse über TCID50 ein. Geben Sie dann zwei 50-Mikroliter-Tröpfchen der Blutmehlmischung in ein Plastikfläschchen und lassen Sie die Mücken zwei Stunden lang fressen. Nachdem Sie die Mücken betäubt haben, zählen Sie die vollständig angeschwollenen Individuen und geben Sie sie in ein neues Fläschchen mit einem in Fruktose getränkten Wattepad.
Halten Sie die Mücken dann 14 oder 21 Tage lang bei 27 Grad Celsius und 80 % Luftfeuchtigkeit. Füllen Sie die mit Fruktose getränkten Wattepads alle 72 Stunden mit 1,5 Millilitern Fruktose auf. Zuerst werden 20.000 Vero-Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit zugesetztem Wachstumsmedium gesät.
Um das Speichelgerät vorzubereiten, stellen Sie eine quadratische Glasplatte in einem Winkel von 30 Grad auf die Bank. Kleben Sie dann doppelseitiges Klebeband auf die Oberseite der Glasplatte. Rollen Sie dann Modelliermasse bis zu einem Durchmesser von 0,5 Zentimetern und befestigen Sie sie horizontal einen Zentimeter vom doppelseitigen Klebeband entfernt an der Platte.
Schneiden Sie die Spitzen von der erforderlichen Anzahl von 10-Mikroliter-Filterspitzen ab und füllen Sie jede Spitze mit 10 Mikrolitern PBS. Legen Sie dann die Spitzen auf die Modelliermasse und fixieren Sie sie mit leichtem Druck. Als nächstes machen Sie die Mücken bewegungsunfähig, indem Sie ihre Beine und Flügel entfernen.
Befestigen Sie die Mücken an dem Klebeband über den Filterspitzen. Stecken Sie den Rüssel jeder Mücke vorsichtig in eine Filterspitze. Entfernen Sie nach 30 Minuten die Filterspitzen und entsorgen Sie den Ton und das Klebeband.
Den gesammelten Speichel in Reaktionsröhrchen mit 10 Mikrolitern PBS überführen. Mischen Sie den Speichel und PBS vorsichtig und geben Sie die Mischung in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.
Überprüfen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop auf das Vorhandensein einer zytopathischen Wirkung. Sobald eine Vertiefung positiv für die zytopathische Wirkung ist, verwenden Sie eine Pipette, um 140 Mikroliter des Überstands zu ernten. Dann wird der Überstand in ein Reaktionsgefäß überführt.
Mischen Sie anschließend 140 Mikroliter des Überstands mit 560 Mikrolitern AVL-Puffer und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zum Schluss fügen Sie 560 Mikroliter Ethanol hinzu und drehen Sie die Probe um, um sie zu mischen. Mit Hilfe dieses Protokolls wurden mehrere Mückenarten unter verschiedenen klimatischen Bedingungen auf Zika-Virus-Infektionen und -Übertragung getestet.
Unter 27 Grad Celsius Inkubationsbedingungen zeigten alle Aedes-Speichel Zika-Virus-positiven Speichel. Umgekehrt enthielt keine der Speichelproben der Culex-Taxa Hinweise auf das Virus. Einmal gemeistert, kann diese Technik bei richtiger Ausführung für 50 Mücken in einer Stunde durchgeführt werden.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Experimente mit erzwungenem Speichelfluss durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit infizierten Mücken sehr gefährlich sein kann, daher sollten bei der Durchführung eines Experiments immer besondere Sicherheitsmaßnahmen für den Umgang mit Mücken unter BSA-3-Bedingungen getroffen werden.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Analyse der Vektorkompetenz von Mücken, insbesondere von Aedes albopictus und verschiedenen Culex-Taxa, für die Übertragung des Zika-Virus beschrieben. Die erzwungene Speichelsekretionstechnik ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Mücken, ohne Labor tiere einsetzen zu müssen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Vektorbiologie
- Virologie
- Mückenübertragene Krankheiten
Hintergrund
- Das Verständnis der Vektorfähigkeit ist entscheidend für die Bekämpfung von mückenübertragenen Viren.
- Die erzwungene Speichelsekretion ist eine neuartige Methode zur Beurteilung des Übertragungspotenzials von Mücken.
- Bisherige Methoden erforderten oft Labor tiere, auf die bei dieser Technik verzichtet werden soll.
- Feinmotorik ist für diese Methode unerlässlich und setzt Übung und Erfahrung voraus.
Zweck der Studie
- Die Vektorfähigkeit verschiedener Mückenarten für das Zika-Virus bewerten.
- Eine Methode demonstrieren, die eine Hochdurchsatzanalyse von Mückenspeichel ermöglicht.
- Neuen Forschern, die mit der Technik nicht vertraut sind, eine visuelle Anleitung bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Zubereitung einer Blutmahlzeitmischung zur Fütterung von Mücken.
- Erzwungene Speichelsekretionstechnik zur Sammlung von Speichel von Mücken.
- Zellkulturmethode zur Beurteilung des Vorhandenseins des Zika-Virus.
- Bebrütung und Analyse von Proben auf zytopathische Effekte.
Hauptergebnisse
- Bei Aedes-Arten wurde unter kontrollierten Bedingungen eine positive Speichelprobe auf das Zika-Virus festgestellt.
- Culex-Taxa zeigten keine Hinweise auf das Zika-Virus in ihrem Speichel.
- Die Methode ermöglicht es, bis zu 50 Mücken pro Stunde zu testen, sobald sie beherrscht wird.
- Visuelle Demonstrationen tragen erheblich zur Erlernung der Technik bei.
Schlussfolgerungen
- Erzwungene Speichelsekretion ist eine wirksame Methode zur Untersuchung der über Mücken übertragenen Virusübertragung.
- Schulung und Übung sind unerlässlich für die erfolgreiche Anwendung der Technik.
- Bei der Handhabung infizierter Mücken müssen Sicherheitsmaßnahmen eingehalten werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Forcierte Speichelsekretionsassays ermöglichen die Hochdurchsatzbewertung der Vektorfähigkeit von Mücken ohne Tierversuche und unterstützen die Validierung von Zielstrukturen in der frühen Phase der antiviralen Wirkstoffentwicklung. Die Methode ermöglicht den quantitativen Nachweis replikationskompetenter Viren in einzelnen Insekten und liefert damit Entscheidungsgrundlagen für die Weiterentwicklung oder Einstellung von prophylaktischen oder therapeutischen Kandidaten gegen Arboviren. Durch ihre Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit erhöht die Methode die Vorhersagesicherheit bei der präklinischen Risikominimierung von übertragungshemmenden Maßnahmen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem das Übertragungspotential von Viren in einzelnen Krankheitsüberträgern gemessen wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung von Zielstrukturen durch direkte Bewertung der Vektorfähigkeit unter kontrollierten Bedingungen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Projekten, indem nicht fähige Vektorarten identifiziert werden, wodurch falsch-positive Ansatzpunkte in Programmen zu Arboviren verringert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für anschließende antivirale Tests vor, indem die Virusanfälligkeit in Vektor-Modellen bestätigt wird.
- Operativer Wert: Standardisiert die Speichelgewinnung und Virusdetektion und gewährleistet reproduzierbare quantitative Ergebnisse über große Mückenkolonien hinweg.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform zur hochdurchsatzfähigen Bewertung von übertragungshemmenden Substanzen oder Impfstoffen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bündet an krankheitsrelevante Systeme an, indem die Vektorfähigkeit unter epidemiologisch relevanten Temperaturen (18–27 °C) getestet wird.
- Operativer Wert: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch konsistente, auf Speichel basierende Virusnachweise.
- Risikominderung: Unterstützt Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem temperaturabhängige Transmissionsgrenzwerte für führende Kandidaten ermittelt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode der erzwungenen Speichelabsonderung fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Evaluation ein, insbesondere für arbovirale Interventionen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Wegen, indem die Viruspräsenz im Moskito-Speichel als funktioneller Endpunkt des Übertragungspotenzials quantifiziert wird.
- Screening: Bietet Bereitschaft und Reproduzierbarkeit des Assays durch standardisierte Speichelgewinnung und virusmengenäquivalente Detektion (TCID50-äquivalent) in Vero-Zellen.
- Analysen: Erzeugt quantitative abhängige Messgrößen (virale Titer im Speichel), die Vergleiche zwischen Arten, Stämmen und Umweltbedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch temperaturschichtbezogene Übertragungsdaten, die den feldrelevanten Übertragungsfenstern entsprechen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Methode zum Screening mehrerer Arboviren (z. B. ZIKV, DENV, CHIKV) über verschiedene Vektorarten hinweg, ohne dass eine Neuparametrierung erforderlich ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Unklarheiten in der Übertragungsbiologie.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über entomologische und virologische Teams hinweg.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und reduziertes biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen antiviraler Programme.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf empirischen Daten zur Vektorkompetenz.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Mücken, in Virologie und in mikrochirurgischen Techniken unter BSL-3-Bedingungen.
- Benötigt spezialisierte Geräte wie Speichelausstoßvorrichtungen, Inkubatoren mit präziser Feuchtigkeitsregelung und Mikroskopie zur Bewertung zytopathischer Effekte.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Teams hinweg bei der Zubereitung der Blutmahlzeiten, den Inkubationszeiträumen und den Zeitintervallen zur Speichelentnahme voraus.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind die artenspezifische Größe des Saugrüssels, das Fressverhalten und die Morphologie der Speicheldrüsen in verschiedenen Vektor-Modellen.
- Praktische Einschränkungen bestehen in dem hohen Schulungsaufwand, der zur Erreichung der erforderlichen Kompetenz notwendig ist, sowie in der Abhängigkeit der Methode von der Gewinnung lebensfähiger Viren aus dem Speichel.
