Mechanische Abbildung von Sphäroiden mittels Brillouin-Spektroskopie

Wir nutzen Brillouin-Spektroskopie, um die Zellmechanik nicht-invasiv zu untersuchen und so die Rolle der Mechanobiologie im Krankheitsverlauf zu verstehen. Nicht-invasive Technologien wie die Brillouin-Spektroskopie ermöglichen es uns, Mechanik in drei Dimensionen zu charakterisieren, ohne die Probe zu stören. Zu Beginn werden die Vertiefungen der Mikrowellplatte vorbehandelt, indem Sie 500 Mikroliter Anti-Adhärenz-Spüllösung zu jedem Bohrloch hinzufügen.

Zentrifugiere die Platte bei 1.300 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem Luftblasen entfernt wurden, entferne die Anti-Adhärenz-Spüllösung aus den Brunnen. Gib als Nächstes jedem Brunnen einen Milliliter PBS hinzu und aspiriere ihn vollständig.

Nach der Wiederholung des PBS-Waschs bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Sphäroid und die Anzahl der Sphäroide pro Gel gemäß dem experimentellen Design. Die Zellen pelletieren und in einem Milliliter zugesetztem DMEM neu suspendieren. Dann gibt es einen Milliliter dieser Zellsuspension in einen Brunnen der Mikrowellplatte und mischt gut.

Zentrifugiere die Platte bei 100 g für drei Minuten bei Raumtemperatur. Beobachten Sie die Mikrowell-Platte unter dem Mikroskop, um die gleichmäßige Verteilung der Zellen zu bestätigen und sicherzustellen, dass sie sich am Boden der Brunnen niedergelassen haben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden, um die Sphäroidbildung zu ermöglichen.

Um die Sphäroide zu entnehmen, entfernen Sie das Kulturmedium vorsichtig und langsam, ohne die Sphäroide zu stören. Schneide die PBS/FBS-beschichtete Pipettenspitze ab, um die Öffnung zu vergrößern, und gib 500 Mikroliter PBS zu jedem Brunnen, um die Sphäroide zu lösen. Sammeln Sie das PBS mit den Sphäroiden in ein Rohr.

Dann werden 50 Mikroliter der sphäroiden Suspension in einen Brunnen einer 96-Well-Platte übertragen. Um das Zählen zu erleichtern, zeichnen Sie mit einem permanenten Marker ein Kreuz auf den Boden des Brunnens und zählen Sie die Anzahl der Kugeln in diesem Volumen unter dem Mikroskop. Verwenden Sie die Gleichung, um die Gesamtzahl der Kugeln zu berechnen.

Öffne die SpectraLok-Software und warte, bis alle verbundenen Geräte erkannt sind. Dann wähle die Spektrometer-Kamera aus. Installiere den Acrylwürfel auf dem Probenhalter des Mikroskops, wobei die klare Seite zur Objektivlinse zeigt.

Senken Sie das Objektivobjektiv so weit wie möglich und zentrieren Sie den Würfel darunter. Stellen Sie sicher, dass der optische Pfad im Mikroskop so eingestellt ist, dass die Spektrometerkamera belichtet wird, indem Sie den Drehort-Wähler drehen, um das SpektraLok-Kamerafenster zu L.In, die Belichtungszeit des Sensors auf 500 Millisekunden und die Softwareverstärkung auf 100 einzustellen. Drücken Sie Aufnahme und bewegen Sie das Objektivobjektiv langsam nach oben.

Heben Sie die Linse weiter, bis die Brillouin-Spitzen sichtbar werden und ihre Intensität stabilisiert wird, was darauf hindeutet, dass sich der Brennpunkt im Acrylwürfel befindet. Jetzt öffne das Pumpenkiller- oder PK-Kontrollfenster. Zoomen Sie auf eine der hellsten Brillouin-Bestellungen ein und stellen Sie die Druckstellerposition in Schritten von 100 Mikrometern an, indem Sie auf Bewegungs-Relativierung klicken, um die Rayleigh-Spitzenintensität zu minimieren.

Wenn das Rayleigh-Signal zunimmt, klicken Sie auf Rückwärts, um die Einstellungsrichtung zu ändern. Sobald die Rayleigh-Spitzenintensität abnimmt, wird der Etalon-Druck in kleineren Schritten von 10 Mikrometern fein abgestimmt. Im Kamerafenster zoomen Sie auf eine der Brillouin-Bestellungen.

Drücken Sie S, um Streifen zu visualisieren, über die der LUT auf das Kamerabild angewendet wird. Öffnen Sie das Einstellungsfenster und drücken Sie Quick Calibrate, um automatisch die optimale horizontale Versetzung der Streifen neu zu berechnen. Nach Überprüfung der Streifenausrichtung stellen Sie die Kollimatorlinsenachsen an, um die Kopplungseffizienz des Lichts vom Pump Killer zum Spektrometer zu maximieren.

Öffne dann das Spectrum-Fenster und klicke auf Unwrap, um das Spektrum abzurufen. In einem homogenen Acrylwürfel strebe die vollständige Unterdrückung des Rayleigh-Signals an und passe es an, bis das Brillouin-Signal deutlich sichtbar ist. Um die optimierten Parameter zu speichern, klicke auf "Alle aktualisieren" und dann auf "Alles speichern" im PK-Kontrollfenster.

Schließlich klicke im Hauptfenster im Bereich Datei-I/O auf Speichern, um die Konfiguration zu speichern. Nachdem Sie die Scansoftware geöffnet haben, stellen Sie die Glasboden-Petrischale mit der Hydrogel-Sphäroidprobe anstelle des Acrylwürfels ein. Entferne den Petrischalendeckel, füge ausreichend Medien hinzu, um das Gel einzutauchen, und lege einen Deckel darauf, um Gelbewegung zu verhindern.

Lokalisieren Sie die Sphäroide, indem Sie zuerst den Laserstrahl blockieren. Schalte den optischen Weg des Mikroskops auf das Okular um und schalte das weiße Licht ein. Mit dem Joystick steuern Sie manuell die Sample-Stufe, um das Sphäroid zu lokalisieren und zu fokussieren.

Erzeuge ein Hellfeldbild des Sphäroids und passe die Helligkeit der Beleuchtung an, indem du das Steuerrad drehst. Schalten Sie den optischen Pfad auf R, um die Mikroskopkamera zu belichten, und stellen Sie die Belichtungszeit nach Bedarf ein. Als Nächstes stellen Sie den Mikroskopanschluss auf L und nehmen den Hintergrund auf, während der Laser noch blockiert ist.

Entblocken Sie den Laser und wählen Sie je nach gewünschtem Signal-Rausch-Verhältnis eine Belichtungszeit zwischen 200 und 500 Millisekunden. Wählen Sie aus dem unwrapped Spektrum die Brillouin Peak Fitting Range aus. Stellen Sie den Schwellenwert auf etwa die Hälfte der Brillouin-Spitzenintensität an und schließen Sie alle Brillouin-Spitzen mit Amplitude unterhalb der Schwelle aus.

Wenden Sie eine Wellenlängenkorrektur auf den Laser gemäß allen identifizierten Brillouin-Peakpaaren an. Wählen Sie schließlich die Raster-Scan-Geometrie, indem Sie die Scan-Breite und die Schrittweite anpassen, und starten Sie den Scan, um die Messungen aufzuzeichnen. Repräsentative Bilder eines mesenchymalen Stammzell-Sphäroids, eingebettet in Hydrogel, zeigten deutliche Brillouin-Verschiebungs- und Brillouin-Linienbreitenkarten sowie entsprechende Brightfield-, Kern- und Aktinfilament-Fluoreszenzbilder.

Die niedrigauflösende Brillouin-Frequenzverschiebungskarte wurde basierend auf der manuell aus dem Hellfeldbild nachgezogenen Kontur in Gel- und Sphäroidregionen segmentiert. Mehrdeutige Pixel, die durch Downsampling entstanden, wurden aus der Analyse ausgeschlossen, während klare Binärmasken für die Gel- und Sphäroidregionen erstellt wurden, um BFS-Werte zu extrahieren. Der Vergleich von hoch- und niedrigauflösenden BFS-Karten zeigte, dass die Kernstichproben mittlere BFS-Werte lieferten, die mit hochauflösenden Scans vergleichbar sind, was auf eine konsistente Messung der sphäroiden Bulkmechanik hinweist.

Unser Protokoll wird eine Plattform bieten, die es Forschern ermöglicht, viele Krankheiten im Zusammenhang mit der Mechanobiologie zu untersuchen. Es wird interessant sein zu sehen, ob Veränderungen der Brillouin-Verschiebung, die mit den mechanischen Eigenschaften der Zellen korrelieren, wirksame Marker für die Stadien des Krankheitsverlaufs sind. Wir werden untersuchen, wie medikamentöse Behandlungen die Sphäroidmechanik über Zeiträume hinweg beeinflussen, die den Krankheitsverlauf nachahmen.