Erschwingliche Sauerstoffmikroskopie-unterstützte Biofabrikation von mehrzelligen Sphäroiden

Das Protokoll beschreibt die Hochdurchsatz-Sphäroiderzeugung für Bioprinting unter Verwendung der multiparametrischen Analyse ihrer Oxygenierung und ihres Zelltods auf einem Standardfluoreszenzmikroskop. Dieser Ansatz kann angewendet werden, um die Lebensfähigkeit der Sphäroide zu kontrollieren und eine Standardisierung durchzuführen, die für die Modellierung von 3D-Gewebe, Tumormikroumgebung und erfolgreicher (Mikro-) Gewebebiofabrikation wichtig ist.

Unser Protokoll hilft bei der Abbildung der Oxygenierung von mehrzelligen Sphäroiden mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop. Mit dieser Methode kann man Tausende von mit Sauerstoffsonden gefärbten Sphäroid-Mikrogeweben herstellen und anschließend in 3D-Druckanwendungen verwenden. Zum Beispiel vaskularisierte Knochengewebetransplantate.

Nahinfrarot-Sauerstoffsonde ist kompatibel mit der Verwendung anderer Farbstoffe wie der grünen Fluoreszenzfärbung von Letztendlich ermöglicht dies eine Live- und Multiparameter-Langzeitanalyse. Übertragen Sie mikrogemusterte PDMS-Stempel von einem Lagerfläschchen in eine sterile Petrischale und trocknen Sie sie mit der glatten Oberfläche unter den sterilen laminaren Luftströmungsbedingungen für 10 Minuten an der Luft. Legen Sie jeden Stempel in die Mitte des Brunnens einer sterilen Gewebekulturplatte mit 12 Vertiefungen.

Ein bis zwei Minuten mit offenem Deckel an der Luft trocknen. Bereiten Sie 50 Milliliter 3% homogene Agaroselösung vor und fügen Sie sofort etwa zwei Milliliter heiße Agaroselösung zu jeder Vertiefung der 12-Well-Platten hinzu, um den eingelegten PDMS-Stempel abzudecken. Erstarren Sie die Agarose für 20 Minuten, indem Sie sie unter sterilem Luftstrom inkubieren.

Drehen Sie mit einem sterilen Spatel die Agarose mit dem eingebetteten PDMS-Stempel in jedem Bohrloch auf den Kopf. Fügen Sie etwa 200 Mikroliter steriles Wasser auf die glatte Oberseite des Stempels hinzu. Lösen Sie es mit einem Spatel von der Agarose und entfernen Sie es aus dem Brunnen.

Geben Sie einen Milliliter entsprechender steriler Zellkulturmedien zu den Agarosestempeln für die direkte Verwendung. Den Teller mit dem Deckel abdecken und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Vor Gebrauch die mikrogemusterten Agaroseplatten in einem Kohlendioxid-Inkubator eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius erwärmen.

Spülen Sie 70% bis 90% Konfluenzzellkultur mit vorgewärmtem PBS. Dissoziierende Enzymlösung hinzufügen und drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Später neutralisieren Sie Trypsin mit vollständigen Zellkulturmedien, die 10% FBS enthalten.

Um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, dissoziieren Sie Zellaggregate mit einer Pipettenspitze von 1.000 Mikrolitern auf der Oberseite der serologischen Pipette. Zählen Sie mit einer Zählkammer die Anzahl der Zellen pro Milliliter der Zellsuspension. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf 500.000 Zellen pro Milliliter und fügen Sie ihr konzentrierte Sauerstoffsondenlösung hinzu.

Entfernen Sie alte Medien aus mikrostrukturierten Vertiefungen der 12-Well-Agarose-beschichteten Zellkulturplatte und fügen Sie einen Milliliter der vorbereiteten Zellsuspension zu den Vertiefungen hinzu. Kultivieren Sie die Sphäroide in einem Kohlendioxid-Inkubator für zwei bis fünf Tage in ständiger Anwesenheit der Sauerstoffsonde, um sicherzustellen, dass sie während der Sphäroidbildung und -verdichtung belastet wird. Schließen Sie das Ende einer sterilen drei Kubikzentimeter großen Kartusche mit einer Spitzenkappe und füllen Sie sie mit Bio-Tinte durch Pipettieren.

Setzen Sie einen Kolben in die Patrone ein und halten Sie ihn auf den Kopf. Entfernen Sie die Spitzenkappe und drücken Sie den Kolben in Richtung der Bio-Tinte, bis die gesamte Luft aus der Patrone entfernt ist. Kühlen Sie die Bio-Tinte im Heizmantel des Bioprinters bei 23 Grad Celsius ab.

Besprühen Sie den Bioprinter mit 70% Ethanol und trocknen Sie ihn mit absorbierendem Papier. Schrauben Sie einen Druckadapter an der Oberseite der Kartusche ein. Montieren Sie eine konische Polyethylennadel mit 22 Gauge auf der Kartusche.

Setzen Sie die Kartusche im Heizmantel auf dem extrusionsbasierten Druckkopf ein. Schließen Sie den Druckeinlass an und öffnen Sie den Clip am Einlass. Laden Sie die G-Code-Datei Ihres Designs in die Drucksoftware.

Starten Sie die Nadellängenmessung. Regulieren Sie den Druckdruck, indem Sie etwas Bio-Tinte in eine sterile Petrischale geben. Installieren Sie eine Sechs-Well-Platte, öffnen Sie die Well-Platte, schließen Sie die Haube und drucken Sie.

Lassen Sie die Gerüste nach dem Drucken für 10 Minuten bei fünf Grad Celsius physisch vernetzt werden. Bestrahlen Sie die bedruckten Gerüste 60 Sekunden lang mit einer UV-LED-Lampe. Fügen Sie sofort die entsprechenden Wachstumsmedien mit dualer antibiotischer Lösung zu allen Vertiefungen mit biogedruckten Gittern hinzu.

Kultur die Gerüste bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator. Für die Mikroskopiebeobachtung übertragen Sie ein gedrucktes Waffelgitter in eine Mikroskopie-Schalenabdeckung mit bildgebenden Medien. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette die vorgefärbten Sauerstoffsonden-Sphäroide vorsichtig aus den Agarose-Mikrovertiefungen auswaschen und in ein 15-Milliliter-konisches Bodenrohr überführen.

Um die Sammlung aller Sphäroide aus einem mikrogemusterten Brunnen zu gewährleisten, spülen Sie den Brunnen ein- bis dreimal mit dem zusätzlichen Milliliter Kulturmedium aus und kombinieren Sie alle Sphäroidsuspensionen in einem Fläschchen. Lassen Sie die Durchstechflasche bis zu 10 Minuten vertikal, damit sich die Sphäroide auf dem Boden absetzen. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus dem Schlauch, so dass die Sphäroide ungestört bleiben.

Fügen Sie ein frisches Kulturmedium hinzu, das für mindestens 20 Sphäroide pro Probenschale ausreicht, und suspendieren Sie die Sphäroide sanft durch Pipettieren. Fügen Sie sofort ein gleiches Volumen an Sphäroidsuspension zu jeder vorbeschichteten Mikroskopie hinzu. Lassen Sie die Sphäroide für eine Stunde bei 37 Grad Celsius, um sie an der Oberfläche des Mikroskopiebrunnens zu befestigen.

Entfernen Sie das Medium aus der Mikroskopie gut und spülen Sie es einmal mit bildgebenden Medien ab. Fügen Sie der Probe die genaue Menge an Bildmedien hinzu. Richten Sie die Mikroskopie gut mit gefärbten Sphäroiden auf der Mikroskopiestufe ein.

Verwenden Sie das 10-fache Vergrößerungsobjektiv und zeigen Sie eine Vorschau der Probe im Transmissionslicht an. Konzentrieren Sie sich vorläufig auf Sphäroide, positionieren Sie sie in der Mitte des Bildes und bringen Sie das Objektiv mit der erforderlichen hohen Vergrößerung in die Arbeitsposition. Konzentrieren Sie sich auf den Transmissionslichtmodus im äquatorialen Querschnitt des Sphäroides.

Passen Sie die Einstellungen zum Sammeln von Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzsignalen von Referenz- und empfindlichen Spektralkanälen der Sauerstoffsonde an und starten Sie den Bildgebungsprozess. Öffnen Sie die vsi-Datei mit Intensitätsdaten der Sauerstoffsonde aus Referenz- und empfindlichen Spektralkanälen im zusammengeführten Modus. Öffnen Sie das Funktionsfenster für die Verhältnisanalyse über das Menü "Maßnahme".

Wählen Sie die Intensität des Referenzkanals als Zähler und die Intensität des empfindlichen Kanals als Nenner für die R-Berechnung. Wenden Sie im Fenster zur Verhältnisanalyse die entsprechenden Intensitätsschwellenwerteinstellungen auf jeden Spektralkanal an, um den Hintergrund vom zusammengeführten Intensitätsbild zu subtrahieren. ROI-Masken, die auf Sphäroidbilder angewendet werden, bestimmen die Sphäroidgrenzen.

Erhöhen Sie die Schwellenwerte, bis der Bildhintergrund gleichmäßig schwarz ist. Passen Sie im Fenster zur Verhältnisanalyse den Skalierungsfaktor an das Verhältnisbild an, bis das Vorschaubild die gewünschte Auflösung des R-Farbverlaufs liefert. Das Bild der Intensitätsverhältnisverteilung wird als Ebene zum ursprünglichen Mehrkanalbild hinzugefügt.

Aktivieren Sie im Fenster des Mehrkanalbildes die Ebene mit einem Falschfarbenbalken. Bestimmen Sie manuell die Verknüpfungs- und Entlinkungsgrenzen eines Verhältnisverteilungshistogramms mit der festen Skalierungsoption im Anzeigefenster anpassen. Öffnen Sie das entsprechende Transmissionslichtbild von Sphäroiden.

Wählen Sie die lineare Linealfunktion und messen Sie den Durchmesser von Sphäroiden. Exportieren Sie Daten als Tabellenkalkulationstabellendatei. Wählen Sie den ROI der gewünschten Größe und Form und wenden Sie ihn auf die Peripherie und den hypoxischen Kern des Sphäroid an.

Transformieren Sie den ROI in das Messobjekt, um den durchschnittlichen R innerhalb des gewählten ROI zu analysieren. Exportieren Sie Daten in einem Tabellenkalkulations-kompatiblen Tabellenformat. Wenden Sie Messungen auf jeden Mikroskopieabschnitt von Sphäroiden an, um den Datensatz der Sphäroiddurchmesser RC und RP zu erhalten, um weitere Berechnungen und statistische Vergleiche durchzuführen.

Kombinieren Sie alle Daten in einer Tabellenkalkulationsdatei. Die MMIR1-Sonde hat eine geringe Photobleiche und eignet sich für die Echtzeituntersuchung der schnellen Atemreaktion in hDPSC-Sphäroiden auf verschiedene Mitochondrienreize. FCCP zeigte in einigen Bereichen nur einen leichten Entkopplungseffekt und dann eine leicht verminderte Zellatmung.

Auf der anderen Seite hemmte Rotenon die Atmung stark, was zu einer Sphäroidreoxygenierung und Dissipation der Peripherie-zu-Kern-Sauerstoffgradienten innerhalb von etwa 80 Sekunden nach der Stimulation führte. Unter Verwendung des automatisierten Protokolls der Pixel-für-Pixel-Intensitätsverhältnisberechnungen, die von der Bildgebungssoftware bereitgestellt werden, werden in Echtzeit erkannte Peripherie-zu-Kern-Sauerstoffgradienten in allen Sphäroidtypen mit der sauerstoffhaltigen Peripherie und den hypoxischen Nischen in der Mitte visualisiert. Die Diagramme hierin zeigen Verhältnisprofile der äquatorialen Sphäroidquerschnitte für verschiedene Sphäroidtypen.

Im Vergleich zu homozellulären hDPSC-Sphäroiden wiesen heterozelluläre hDPSC- bis HUVEC-Sphäroide signifikant steilere Gradienten auf. Der Peripherie-zu-Kern-Sauerstoffgradient in heterozellulären Sphäroiden wird wahrscheinlich von hDPSC in ihrer Zusammensetzung gemäß hDPSC-Sphäroiden mit starker Atmungsaktivität erzeugt. Die Grafiken zeigen, dass biogedruckte hDPSC-Sphäroide eine signifikant oxygenierte Peripherie aufwiesen als Sphäroide, die vor dem Bioprinting gemessen wurden, während ihre Kernoxygenierung ähnliche Werte aufwies.

Wenn gelegentliche Sondenausfällungen die gleichmäßige Sphäroidbildung stören, filtern oder zentrifugieren Sie die Sondenlösung vor dem Gebrauch mit hoher Geschwindigkeit. Die Korrektur der Nadellängenmessung und die Druckregulierung sind wesentliche Schritte, um die Bioprinting-Rate und den Federbeindurchmesser sowie die Bioprint-Mikroaggregate in einem porösen Gerüst anzupassen. Wählen Sie die Mikroskopieeinstellungen für die sauerstoffempfindliche Sondenbildgebung unter Berücksichtigung ihrer Auswirkungen auf die Photostabilität der Sonde.

Die Sauerstoffbildgebung ist mit vielen Arten von Lebendmikroskopiemessungen kompatibel. Nach der Bildgebung kann man auch Immunfluoreszenz durchführen, Proteine für Western Blotting extrahieren oder Genexpressionsanalysen durchführen.