Ein modifiziertes QuEChERS-HPLC-Verfahren zum Nachweis von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in Zebrafischembryonen, die Feinstaub ausgesetzt waren

Diese Forschung zielt darauf ab, eine modifizierte QuEChERS-HPLC-Methode zur Quantifizierung von PAK in Zebrafischembryonen zu entwickeln, die EOM ausgesetzt sind, um die derzeitige Lücke zu schließen, die durch technische Herausforderungen bei der Messung des internen PAK-Spiegels aufgrund der Massengröße der Embryonen und der Komplexität ihrer biologischen Matrix verursacht wurde. Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, sind 200 Embryonen pro Gruppe erforderlich, was eine praktische Herausforderung darstellt. Die Kombination von HPLC mit Fluoreszenzdetektor könnte die Empfindlichkeit der Methode weiter erhöhen. Im Vergleich zu anderen Techniken reduziert diese modifizierte QuEChERS-HPLC-Methode die Hangtime der Proben erheblich und bietet einen schnellen und effizienten Ansatz für die Analyse der Konzentrationen von 16 PAK in Zebrafischembryonen, die EOM ausgesetzt waren.

[Erzähler] Bereiten Sie zunächst die QuEChERS-Probe vor, indem Sie 72 Stunden nach der Befruchtung die Schalen mit den Embryonen aus dem Inkubator nehmen. Waschen Sie die Embryonen dreimal mit reinem Wasser. Übertragen Sie die Embryonen in 1,5-Milliliter-Röhrchen und entfernen Sie überschüssiges Wasser. Legen Sie die Röhrchen für 30 Minuten in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius, um die Embryonen zu lyophilisieren. Nach der Lyophilisierung zerkleinern Sie die Embryonen mit einem Glasstab. Geben Sie 25 Mikroliter 16 polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) in die DMSO-Kontrollgruppe, um die Spike-Wiederfindung zu testen. Fügen Sie dann einen Milliliter n-Hexan hinzu und wirbeln Sie es 30 Sekunden lang. Ultraschall der Mischung bei 35 Grad Celsius für 30 Minuten. Zentrifugieren Sie nun die Probe bei 7.000 g für fünf Minuten. Den Überstand in ein frisches Röhrchen umfüllen. Die gesammelten Überstände werden unter Stickstofffluss in einem 35 Grad Celsius warmen Wasserbad bis zur Trockenheit verdampft. Fügen Sie einen Milliliter Acetonitril hinzu und wirbeln Sie ihn 30 Sekunden lang. Geben Sie 10 Milligramm primäres sekundäres Amin, 45 Milligramm Magnesiumsulfat und 15 Milligramm C18-Packung in die Probe und wirbeln Sie sie dann 30 Sekunden lang. Bei 7.000 g fünf Minuten zentrifugieren und den Überstand in ein frisches Röhrchen umfüllen. Verdampfen Sie den Überstand auf 0,5 Milliliter unter Stickstoff und filtrieren Sie die Probe durch eine 0,22 Mikrometer große mikroporöse Membran. Bereiten Sie eine Reihe von Arbeitslösungen von einem bis 500 Nanogramm pro Milliliter für den 16-PAK-Mischstandard mit Acetonitril vor. Injizieren Sie 20 Mikroliter der Probenlösungen in einen Flüssigchromatographen unter Verwendung einer Acetonitril- oder wasserbeweglichen Phase und befolgen Sie das auf dem Bildschirm gezeigte Elutionsverfahren. Zeichnen Sie eine Standardkurve mit den Massenkonzentrationen der Standardarbeitslösungen auf der x-Achse und den entsprechenden Peakbereichen auf der y-Achse, die einen Bereich von fünf Nanogramm pro Milliliter bis 500 Nanogramm pro Milliliter abdeckt. Injizieren Sie die gereinigte Probe in den Flüssigkeitschromatographen, der mit einem Fluoreszenzdetektor (FLD) und einem Diodenarray-Detektor (DAD) ausgestattet ist. Identifizieren Sie das Vorhandensein von PAK, indem Sie die Retentionszeiten vergleichen. Messen Sie Peakbereiche, um die Konzentration zu bestimmen. Berechnen Sie abschließend die internen Konzentrationen der 16 PAK auf Basis der gemessenen Massenkonzentrationen. In dieser Tabelle sind die Konzentrationen von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) in Zebrafischembryonen 72 Stunden nach der Befruchtung angegeben. Sechs PAK wurden erfolgreich in extrahierbaren organischen Stoffen (EOM) von Zebrafischembryonen nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurden in den DSMO-Kontrollproben nur zwei PAK identifiziert, die deutlich unter denen der EOM-Proben lagen.