Name: Screening kleiner Moleküle und Toxizitätstests an Zebrafischlarven im Frühstadium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T14:10:00.000+00:00
Duration: 2 min 52 s
Description: Erfahren Sie das Screening kleiner Moleküle und Toxizitätstests an Zebrafischlarven im Frühstadium. Diese Methode ermöglicht morphologische Bewertungen nach chemischer Behandlung für pharmakologische Forschung.

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<ol><li>Teame, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+biomedical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Front%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models.</a> Anim Front. 9 (3), 68-77 (2019).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+disease+models+in+drug+discovery%3A+From+preclinical+modelling+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).</li>
<li>Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+behavior+in+zebrafish+larvae%3A+Effects+of+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding.</a> Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).</li>
<li>Keenan, S. R., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+phases+of+zebrafish+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developmental phases of zebrafish myogenesis.</a> J Dev Biol. 7 (2), 12(2019).</li>
<li>Tonelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+resourceful+vertebrate+model+to+investigate+skeletal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 489(2020).</li>
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<li>Chen, J. R., Lai, Y. H., Tsai, J. J., Hsiao, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+fluorescent+staining+platform+for+drug-screening+and+mechanism-analysis+in+zebrafish+for+bone+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Live fluorescent staining platform for drug-screening and mechanism-analysis in zebrafish for bone mineralization.</a> Molecules. 22 (12), 2068(2017).</li>
<li>He, H., Wang, C., Tang, Q., Yang, F., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+mechanisms+of+prednisolone-induced+osteoporosis+in+zebrafish+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Possible mechanisms of prednisolone-induced osteoporosis in zebrafish larva.</a> Biomed Pharmacother. 101, 981-987 (2018).</li>
<li>Huang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bone+transgenic+zebrafish+in+anti-osteoporosis+chemical+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Model+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis chemical screening.</a> Animal Model Exp Med. 1 (1), 53-61 (2018).</li>
<li>Haney, M. G., Moore, L. H., Blackburn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+of+primary+patient+derived+tumor+xenografts+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish.</a> J Vis Exp. (158), e60996(2020).</li>
<li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+zebrafish+in+systems+toxicology+for+developmental+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Congenit+Anom+%28Kyoto%29%22%5BJournal%5D)">Using zebrafish in systems toxicology for developmental toxicity testing.</a> Congenit Anom (Kyoto). 56 (1), 18-27 (2016).</li>
<li>Hayot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+toxicity+of+chemicals+using+a+zebrafish+vibration+startle+response+screening+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system.</a> J Vis Exp. (203), e66153(2024).</li>
<li>Hoyberghs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+concentrations+up+to+1%25+are+safe+to+be+used+in+the+zebrafish+embryo+developmental+toxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Toxicol%22%5BJournal%5D)">DMSO concentrations up to 1% are safe to be used in the zebrafish embryo developmental toxicity assay.</a> Front Toxicol. 3, 804033(2021).</li>
<li>Lipton, J. H., Brümmendorf, T. H., Sweet, K., Apperley, J. F., Cortes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+in+the+management+of+patients+treated+with+bosutinib+for+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Hematol%22%5BJournal%5D)">Practical considerations in the management of patients treated with bosutinib for chronic myeloid leukemia.</a> Ann Hematol. 103 (9), 3429-3442 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Starlab</td><td>E1415-1510</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro; L Mikropipette (P10)</td><td>Gilson</td><td>F144802&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10/20 & Mikro; L Pipettenspitzen</td><td>Starlab</td><td>S1110-3810</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Mikropipette (P1000)</td><td>Gilson</td><td>F123602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1000 &Mikro; L Pipettenspitzen</td><td>Starlab</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7512</td><td>Steril, einfach verpackt, unbehandelt, mit Deckel</td></tr><tr><td>20 & Mikro; L Mikropipette (P20)</td><td>Gilson</td><td>F123600&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 & Mikro; L Mikropipette (P200)</td><td>Gilson</td><td>F123601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 & Mikro; L Mehrkanal-Pipette&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F81024</td><td></td></tr><tr><td>200 & Mikro L Pipettenspitzen</td><td>Starlab</td><td>S1113-1006</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7596</td><td>Steril, einfach verpackt, mit flachem Boden, unbehandelt, mit Deckel</td></tr><tr><td>Zuchtbecken mit innenliegendem Gitter, schrägem Boden, Tankteiler und Deckel</td><td>Tecniplast</td><td>ZB17BTISLOP, ZB17BTE,&nbsp; ZB17BTL, ZB17BTD</td><td>Schräger Innentank</td></tr><tr><td>Mesh-Sieb</td> <td>//</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nitrilhandschuhe</td><td>Mercator</td> <td>//</td><td></td></tr> <tr><td>Petrischale</td><td>Starlab</td><td>CC7672-3394/CC7672-3359</td><td>100 x 20 mm oder 60 x 15 mm</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica M205 FCA Fluoreszenz-Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>10450826</td><td></td></tr><tr><td>Peltier-gekühlter Inkubator inkl. 2 Einlegeböden mit Lichtmodul kaltweiß</td><td>Memmert</td><td>IPP110ecoplus, T8</td><td>Ausgestattet mit Tag-/Nacht-Zyklus</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>504341000</td><td>Zur Herstellung einer 1%igen Lösung in E3</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>303080500</td><td>Zur Herstellung von E3</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>313060500</td><td>Zur Herstellung von E3</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>316030500</td><td>Zur Herstellung von E3</td></tr><tr><td>SCREEN-WELL&nbsp; Wnt Pathway library (Bosutinib)</td><td>Enzo</td><td>BML-2838-0500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3161/53</td><td>Zur Vorbereitung von E3</td></tr></tbody></table>

screening kleiner moleküle und toxizitätstests an zebrafischlarven im frühstadium

Small Molecule Screening and Toxicity Testing in Early-stage Zebrafish Larvae

Die Anomalien können einzeln oder kumulativ über den experimentellen Zeitraum bis 7 dpf betrachtet werden. Der maximale Morphologie-Score pro Anomalie kann verwendet werden, um morphologische Anomalien als Prozentsatz der Anzahl der verwendeten Larven zu berechnen. Wenn beispielsweise an Tag 7 die Morphologiewerte des Perikardödems bei 19 bzw. 20 für die Bewerter 1 bzw. 2 von 24 liegen, was bedeutet, dass 19 oder 20 Larven von 24 ein Perikardödem aufweisen, kann der prozentuale Wert wie folgt berechnet werden:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67759/67759eq1.jpg">
Die ergänzende Tabelle S1 zeigt die morphologischen Bewertungsergebnisse (beider Bewerter) bei 4 dpf nach Toxizitätstests für die Substanz Bosutinib, einen Tyrosinkinase-Inhibitor, der zur Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie indiziert ist15. Die gleiche morphologische Bewertung wird für exponierte Fische im Alter von 5 dpf bis 7 dpf wiederholt. Die Verbindung wurde in einem Konzentrationsbereich von 100 μM bis 6,25 μM getestet. Drei technische Replikate wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt, und die durchschnittliche kumulative Mortalitätsrate bei 7 dpf wurde verwendet, um LC50 zu bestimmen, die Konzentration, bei der 50 % der Larven überleben. Der LC50 kann zu jedem beliebigen Expositionszeitpunkt bestimmt werden. Wir empfehlen jedoch, diesen mit 7 dpf zu berechnen.
Die kumulative durchschnittliche Mortalität bei 7 dpf wurde verwendet, um eine LC50-Kurve zu erstellen, die in Abbildung 3 zu sehen ist. Für Bosutinib wurde die LC50-Konzentration auf 37,95 μM geschätzt.
HINWEIS: Diese geschätzte LC50-Konzentration gilt ausschließlich für dieses Modellsystem und kann dann für weitere nachgelagerte Phänotypisierungsassays verwendet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des vorgeschlagenen Wirkstoffscreenings bei Larven bei 3-7 dpf. Die 96-Well-Testplatten sind für die Untersuchung von fünf Konzentrationen im Bereich von 100 μM bis 6,25 μM für die Substanz Bosutinib ausgelegt. Abkürzung: dpf = Tage nach der Befruchtung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Repräsentative morphologische Defekte, die bei Zebrafischlarven bei 5 dpf bei verschiedenen chemischen Konzentrationen (2 Tage nach der Exposition) beobachtet wurden. (A) Kontroll-Zebrafisch (nicht betroffen), (B) Zebrafischlarve mit leichtem Perikardödem, (C) Zebrafisch mit schwerem Perikardödem und Dotterblutung, (D) Zebrafisch mit Entwicklungsverzögerung, verminderter Pigmentierung, kleiner Schwimmblase, (E) Zebrafisch mit geschwollenem Eigelb und geknickter Schwanzflosse, (F) Zebrafisch ohne Schwanzflosse, (G) Zebrafisch mit gebogenem Notochord, (H) Zebrafisch mit abgeschnittenem Schwanz, und (I) toter Zebrafisch mit Nekrose. Fehler sind mit roten Pfeilspitzen gekennzeichnet. Maßstabsleisten = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig3.jpg"> 
Abbildung 3: LC50-Kurve, die die Konzentration im Verhältnis zur %-Mortalität zeigt. Die fünf getesteten Konzentrationen betrugen 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM und 6,25 μM, wobei die Mortalität in % 100 %, 100 %, 29,2 %, 12,5 % bzw. 12,5 % betrug. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Morphologische Defekte</td>
			<td>Beschreibung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perikardödem</td>
			<td>Flüssigkeitsansammlung um das Herz herum bei gestrecktem Herzen und Fehlfunktion der Durchblutung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herzschläge (pro Minute)</td>
			<td>Reduzierte Anzahl von Schlägen pro Minute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eidotter</td>
			<td>Vorhandensein oder Fehlen von Dotterödemen oder Blutungen, die gleichzeitig mit Herzfehlern auftreten können</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yolk Erweiterung</td>
			<td>Eigelb, das geschwollen, dünn oder nicht vorhanden ist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gekrümmtes Notochord</td>
			<td>Vorhandensein eines geknickten oder wellenförmigen Notochords und/oder eines gekrümmten Schwanzes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schwimmblase</td>
			<td>Vorhandensein, Fehlen oder teilweise Entwicklung der Schwimmblase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pigmentierung</td>
			<td>Weniger oder keine Melanozyten im Vergleich zu den unbehandelten Fischen gleichen Alters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nekrose</td>
			<td>Vorhandensein (leicht oder schwer) oder Abwesenheit von Nekrose in irgendeinem Teil des Körpers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verzögerte Entwicklung</td>
			<td>Verzögerte oder verzögerte Entwicklung im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen gleichen Alters.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaktion auf Berührung</td>
			<td>Verzögerte oder keine Reaktion nach einem Schreck (z. B. mit einer Pipettenspitze)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abschneiden</td>
			<td>Fehlen eines hinteren Zebrafischkörpers (d.h. Bildung des Schwanzes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flossen</td>
			<td>Vorhandensein oder Fehlen der Schwanzflosse, die von einer dünnen Dotterverlängerung begleitet sein kann</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduzierte Körperachse</td>
			<td>Fische, die normal aussehen, aber bei der Messung kürzer sind</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Eine Liste der visuellen morphologischen Defekte, die nach Studien zur Arzneimittelexposition beobachtet werden können.
Ergänzende Tabelle S1: Repräsentative morphologische Ergebnisse für Bosutinib bei 4 dpf (1 Tag nach Exposition). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/SupplementalTable_1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Screening kleiner Moleküle und Toxizitätstests an Zebrafischlarven im Frühstadium

Zebrafish have become a prominent model organism for human translational research, toxicity testing of small molecules and environmental pollutants, ...

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Forschung

JoVE Journal

Biology

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