Zweidimensionale superauflösende Visualisierung der Mikrovaskulatur des Gehirns von Ratten mittels Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie

Der Schwerpunkt unserer Forschung liegt auf der Entwicklung eines Protokolls für die Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie, um eine hochauflösende Bildgebung der Mikrovaskulatur des Gehirns von Ratten zu erreichen. Unser Ziel ist es, die Herausforderungen der Balance zwischen der speziellen Auflösung und den Eindringtiefen bei der Bildgebung kleiner Gefäße zu adressieren und detaillierte Einblicke in die Gefäßstruktur und die Dynamik des Blutflusses bei gesunden und Krankheitszuständen zu erhalten.

Unser Protokoll bietet den Vorteil, dass es eine hohe räumliche Auflösung von 12,5 Mikrometern bei gleichzeitiger Beibehaltung einer Eindringtiefe von bis zu 12 Millimetern erreicht und damit herkömmliche Methoden wie MRT, CT und Doppelultraschall übertrifft. Im Gegensatz zu optischen Techniken ermöglicht es die gleichzeitige Bildgebung tiefer Hirnregionen, die Rekonstruktion mikrovaskulärer Strukturen und die Visualisierung der Blutflussdynamik.

Unsere Ergebnisse ebnen den Weg für die Untersuchung mikrovaskulärer Veränderungen bei neurologischen Erkrankungen, wie z.B. Glioblast-Tumoren und der Alzheimer-Krankheit. Die Möglichkeit, die Dynamik des Blutflusses und die mikrovaskuläre Architektur mit hoher Auflösung zu visualisieren, eröffnet neue Möglichkeiten, das Fortschreiten der Krankheit, die Wirksamkeit der Behandlung und den Zusammenhang zwischen muskulären Veränderungen und der Gehirnfunktion zu untersuchen.

[Erzähler] Positionieren Sie zunächst die betäubte Ratte auf dem Operationstisch. Befestigen Sie die oberen Schneidezähne der Ratte in der Kerbe der Schneidestange und positionieren Sie den Unterkiefer unter der Stange. Positionieren Sie die Ohrbügel in der knöchernen Vertiefung, leicht nach vorne und oberhalb des Gehörgangs, und stellen Sie sicher, dass die Schädeloberfläche horizontal bleibt. Üben Sie einen kleinen Druck auf verschiedene Teile des Kopfes aus, um die Stabilität zu beurteilen. Passen Sie die Höhe der Bildgebungsplattform an und stellen Sie den Winkel des Kopfes der Ratte mit der Kerbe des Schneidezahns ein, um eine ungehinderte Atmung zu gewährleisten. Tragen Sie Erythromycin-Salbe oder 30%ige Glycerinlösung auf die Augen der Ratte auf, um sie vor chirurgischen Lichtern zu schützen und die Feuchtigkeit zu erhalten. Rasieren Sie den Kopf der Ratte mit einer elektrischen Schermaschine gegen die Haarwuchsrichtung und decken Sie den Bereich zwischen den Ohren und von den Augen bis zum Hals ab. Machen Sie nun einen Schnitt entlang der sagittalen Naht des Schädels der Ratte, der nur am Hinterhauptbein beginnt und sich etwa vier Zentimeter nach vorne erstreckt. Verwenden Sie Hämostatika, um die Haut auf beiden Seiten zurückzuziehen. Optional können Sie die Haut über dem Schädel herausschneiden, um einen besseren Zugang zu erhalten. Entfernen Sie mit einer kleinen Schere das Periost vom Schädel, wodurch die harte Knochenschicht vollständig freigelegt wird. Führen Sie die Kraniotomie mit einem tragbaren Mini-Schädelbohrer mit einem 2,5 Millimeter kugelförmigen Bohrer durch. Klopfen Sie sanft auf den Knochen, bohren Sie jeweils zwei bis drei Sekunden lang, beginnen Sie mittig und gehen Sie nach außen. Injizieren Sie alle zwei Minuten etwa einen Milliliter 0,9%ige Natriumchloridlösung in den Bohrbereich, um Schmutz abzukühlen und abzuspülen. Wechseln Sie zu einem feineren Ein-Millimeter-Bohrer, sobald das weiße Knochengewebe nicht mehr durchgehend verbunden erscheint. Die Bohrung wurde fortgesetzt, bis die zentralen großen Blutgefäße deutlich dunkelbraun sichtbar sind, wobei das umgebende Gewebe rosa und die Mikrogefäße leicht rötlich erscheinen. Zur Herstellung des Kontrastmittels SF6-Gas und lyophilisiertes Kontrastmittelpulver in fünf Millilitern 0,9 % Natriumchlorid auflösen. Schütteln Sie die Mischung kräftig, um eine Mikroblase oder MB-Suspension mit einer SF6-Endkonzentration von acht Mikrolitern pro Milliliter zu bilden. Ziehen Sie 0,8 Milliliter der MB-Suspension in eine Ein-Milliliter-Spritze, die an einer Mikroinjektionspumpe befestigt ist. Führen Sie eine 26-Gauge-Verweilnadel mit einem Katheter in die Schwanzvene der Ratte ein und injizieren Sie sie. Montieren Sie vor der Bildgebung eine Sonde mit einer Zentralfrequenz von 15,625 Megahertz an den Manipulatorarm des stereotaktischen Instruments des Gehirns, das mit einer Klemme ausgestattet ist. Positionieren Sie die Ultraschallsonde direkt über dem exponierten Rattengehirn und tragen Sie das Kopplungsgel auf die freiliegende Gehirnoberfläche auf, um eine optimale Signalübertragung zu gewährleisten. Öffnen Sie die Hauptschnittstelle der Software, die einen Wrap-Gehirnatlas mit Programmen zur Steuerung von Motorbewegungen integriert. Legen Sie den BGMA-Punkt als Ursprung fest und verwenden Sie die Echtzeitanzeige der Software, um die Flugbahn der Sonde und die entsprechende Position der Rattenhirnscheibe zu überwachen. Wählen Sie die Ziel-Bildgebungsebene aus, z. B. BGMA minus ein Millimeter. Starten Sie die Software MATLAB 2021a und geben Sie das Datenerfassungsskript in MATLAB 2021a ein. Geben Sie im Stammverzeichnis "activate" in das Befehlszeilenfenster ein, um die Laufzeitumgebung zu aktivieren. Legen Sie dann die Start- und Endtiefe der Datenerfassung auf fünf bzw. 120 Wellenlängen fest, um den interessierenden Bereich effektiv zu erfassen. Stellen Sie die Lenkwinkel der Flugzeugwellenübertragung in Schritten von minus fünf Grad bis fünf Grad in Schritten von 2,5 Grad ein, um die Bildauflösung und den Kontrast zu verbessern. Die Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie zeigte eine klare Visualisierung von Mikrogefäßen in Tiefen von bis zu 12 Millimetern. Die Analyse der vollen Breite bei halbem Maximum ergab den kleinsten erkennbaren Gefäßdurchmesser von 13 Mikrometern. Die Korrelation zwischen Fourier-Ringen bestätigte die räumliche Auflösung der mikrovaskulären Bildgebung bei 12,5 Mikrometern. Die Blutflussrichtungen in einem Querschnitt des Rattengehirns zeigten eine Abwärtsströmung in kleinen kortikalen Arterien und eine Aufwärtsströmung in kleinen Venen, dargestellt durch blaue bzw. rote Farben. Eine Geschwindigkeitskarte zeigte höhere Durchflussraten in größeren Schiffen, wobei sich die meisten Geschwindigkeiten im Bereich von 10 bis 25 Millimetern pro Sekunde konzentrierten. Die Bildgebung des Glioblastom-Rattenmodells zeigte eine abnormale Gefäßerweiterung, strukturelle Unregelmäßigkeiten in der Nähe des Tumors, veränderte Blutflussmuster in der Tumorregion und einen heterogenen Gefäßfluss innerhalb und um den Tumor herum.