3D-Generierung von humanem Myokardgewebe mittels Schmelzelektrospinnen, Schreiben von Polycaprolacton-Gerüsten und hiPSC-abgeleiteten Herzzellen

Diese Studie zielt darauf ab, biometrische 3D-Herzgewebe unter Verwendung von Schmelzgerüsten und humanen iPSC-abgeleiteten Herzzellen zu entwickeln, um die Krankheitsmodellierung, Arzneimitteltests und Anwendungen in der regenerativen Medizin zu verbessern. Humaninduzierte Berichte über Kardiomyozyten in Stammzellen bleiben unausgereift, was ihre Funktionalität einschränkt. Darüber hinaus ist es eine Herausforderung, die hohe Komplexität zu reproduzieren, die für die Modellierung von Herzgewebe in 3D erforderlich ist.

Dieses Modell ahmt das native Myokard besser nach und ermöglicht komplexe extrazelluläre 3D-Matrix-Interaktionen für die Modellierung von Krankheiten, Medikamententests und patientenspezifische Anwendungen. Es bietet eine relevantere Alternative zu 2D-Kulturen und Tiermodellen. In Zukunft wird sich unsere Forschung auf die Untersuchung von Kardiomykologiemodellen, die Verbesserung von 3D-Gewebereifungsprotokollen und die Entwicklung größerer Konstrukte für präklinische Myokardinfarkttherapien in großen Tiermodellen wie Schweinen konzentrieren.

Schließen Sie zunächst die Spritze an eine unter Druck stehende Stickstoffzuleitung an und führen Sie sie in die Heizkammer ein. Schalten Sie das Schmelze-Elektrospinn-Schreibgerät ein und stellen Sie die Temperaturregler auf 80 Grad Celsius für die Kammer und 65 Grad Celsius für die Düse ein. Bewegen Sie die Auffangplatte nach 30 Minuten, bis sich der Druckkopf an einer Kante der Platte oder an einer beliebigen Stelle befindet.

Stellen Sie den Abstand zwischen der Heizkammer und der Kollektorplatte manuell auf 10 Millimeter in der Z-Ebene ein. Schließen Sie die Tür des Geräts, die automatisch die Stromversorgung des elektrischen Feldes verbindet. Stellen Sie die Spannung auf sieben Kilovolt Stickstoffdruck auf zwei bar für die Extrusion durch die 23-Gauge-Spitze ein.

Laden Sie den Design-G-Code in die Software, um Gerüste mit einer quadratischen Mustergeometrie zu drucken. Stellen Sie die Kollektorgeschwindigkeit auf 1080 Millimeter pro Minute ein. Drücken Sie dann die Taste Cycle Start, um den Druckvorgang zu starten.

Entfernen Sie nach Beendigung des Druckvorgangs das Gerüst vorsichtig aus dem Auffangbehälter. Schneiden Sie das bedruckte Netz mit einem Stempel mit einem Durchmesser von sechs Millimetern ab, um die endgültigen Gerüste für die Gewebeherstellung zu erhalten. Behandeln Sie die Gerüste fünf Minuten lang mit Sauerstoffplasma.

Sterilisieren Sie die Netze, indem Sie sie 30 Minuten lang in 70%iges Ethanol tauchen. 30 Minuten lang ausgiebig mit sterilem destilliertem Wasser waschen und dann trocknen lassen. Nach dem Ablösen der humanen iPSC-Kardiomyozyten wird das Zellpellet wieder in das Gewebegenerationsmedium suspendiert und die Zellen mit der Neubauer-Kammer gezählt.

In ähnlicher Weise wird nach dem Ablösen der humanen iPSC-Herzfibroblasten das Zellpellet im Gewebeerzeugungsmedium wieder suspendiert und die Zellen gezählt. Mischen Sie die benötigten Gesamtzellen in ein neues Röhrchen und bezeichnen Sie den Inhalt als Cell Mix. Und zentrifugieren Sie bei 300 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Suspendieren Sie dann die Zellmischung erneut in das erforderliche Volumen des Gewebeerzeugungsmediums. Um Hydrogel Mix zu erzeugen, geben Sie das erforderliche Volumen Fibrinogen bei Raumtemperatur in das Röhrchen und mischen Sie vorsichtig. Säen Sie den Hydrogel-Mix auf eine Polytetrafluorethylen-Oberfläche, um eine Fibrinhaftung an der Platte zu verhindern.

Pipettieren Sie die Hälfte des Gewebevolumens und lassen Sie es als Tropfen übrig. Legen Sie ein Polycaprolacton- oder PCL-Gerüst auf jeden Tropfen und geben Sie das verbleibende Volumen auf das Gerüst. Fügen Sie nun die erforderliche Menge Thrombin hinzu und mischen Sie das Hydrogel schnell, wobei Sie Blasen sorgfältig vermeiden.

Inkubieren Sie das Gewebe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um die Fibrinpolymerisation abzuschließen. Nehmen Sie jedes Gewebe vorsichtig mit einer sterilen Pinzette am Rand auf und übertragen Sie es auf 12-Well-Platten, die ein mit Aprotinin versetztes Gewebeerzeugungsmedium enthalten. Inkubieren Sie das Gewebe 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag frischen Sie das Medium mit zwei Millilitern Gewebeerhaltungsmedium auf und entfernen Sie KSR- und Y-27-Rückstände. Die Aussaat einer Mischung aus humanen iPSC-Kardiomyozyten und humanen iPSC-Herzfibroblasten in Fibrin-Hydrogele führt innerhalb einer Stunde nach der Polymerisation zu einer gleichmäßigen Zellverteilung in den Gerüstporen. Konfokale Immunfluoreszenzbilder zeigten eine gemischte Zellverteilung der Zellen durch das 3D-Gewebe, das mit dem PCL-Gerüst interagierte, wobei die Mehrheit der humanen iPSC-Kardiomyozyten, die für sarkomerisches Actinin gefärbt waren, mit Vimentin-markierten humanen iPSC-Herzfibroblasten interspacediert waren.

Humane iPSC-Kardiomyozyten weisen eine gut organisierte Sarkomerstruktur durch sarkomerisches Actinin-Protein in regelmäßigen Abständen auf. Die Zellen begannen am zweiten Tag mit einer mittleren Schlagfrequenz von 30 Schlägen pro Minute am siebten Tag spontan zu schlagen und zeigten eine stabilisierte Kontraktion im gesamten Netz. Im Laufe der Zeit wurde ein allmählicher Rückgang beobachtet, der am 14. Tag 17 BPM erreichte.

Trotzdem blieb die metabolische Aktivität zwischen dem siebten und dem 14. Tag stabil, was die anhaltende Lebensfähigkeit der Zellen bestätigt. Schließlich zeigte die Track-Point-Analyse des schlagenden Gewebes eine Kontraktionsgeschwindigkeit von 38 Mikrometern pro Sekunde und eine Kontraktionsamplitude von 29 Mikrometern.