Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ausgerichtetes funktionelles myokardiales Gewebe mittels Mikrokontaktdruck zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Fibronectin mittels Mikrokontaktdruck auf Polydimethylsiloxan-Substrate aufgebracht wird. Als zweiter Schritt erfolgt die doppelte transgene.

Stammzelllinien von Embryonen werden in vitro differenziert und mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung isoliert, wodurch hochreine Populationen stark kardiogener Vorläuferzellen gewonnen werden können. Anschließend werden die isolierten kardialen Vorläuferzellen auf mikroporösen PDMS-Substraten ausgesät, um sie zu einer malignen Wachstumsform und einer stabförmigen, kardialen Myozyten ähnlichen Morphologie anzuregen. Es werden Ergebnisse erzielt, die auf Grundlage von Fakten und immunfluoreszenzanalytischen Untersuchungen die erfolgreiche Isolierung sowie ein anisotropes Wachstum kardialer Vorläuferzellen belegen.

Die Erzeugung eines isotropen Myokardgewebes kann die Bereiche der Stammzellbiologie und der Gewebe-Bioingenieurwissenschaft voranbringen, indem die Möglichkeit geschaffen wird, krankheitsspezifische Zelltests für die Arzneimittelentwicklung und -entdeckung zu entwickeln, und indem die Grundlage für die kardiale regenerative Medizin gelegt wird. Zunächst IL Schild, 180 4 Poly-Dimethyl-Alan-Elastomer im Verhältnis 10 zu 1 basierend auf Härtungsmittel und gut mischen.

Entgasen Sie die Baugruppe mithilfe eines Trockenbehälters, um Luftblasen zu entfernen. Gießen Sie das PDMS in eine zuvor hergestellte Negativform mit 20 Mikrometer breiten und zwei Mikrometer hohen Rillen, die durch einen 20-Mikrometer-Abstand getrennt sind, und härten Sie es zwei Tage lang bei Raumtemperatur im Trockenbehälter aus, um mikrostrukturierte PDMS-Stempel zu erhalten. Nachdem die Oberflächen der PDMS-Stempel mit einem Plasma-Reinigungsgerät hydrophil gemacht wurden.

Die Stempel mit 70 %igem Ethanol eine Minute lang sterilisieren. In einer biologischen Sicherheitswerkbank anschließend mit Druckluft schnell trocknen. Nach der Absorption die sterilen Stempeloberflächen mit Fibronectin-Lösung bedecken, damit sie mindestens 10 Minuten lang absorbieren können.

Schütteln Sie die Fibronectin-Lösung von den Stempeln ab und trocknen Sie diese schnell mit Druckluft. Stellen Sie wie im Textprotokoll beschrieben zwei Minuten lang einen konformen Kontakt zwischen Stempel und zuvor vorbereiteten PDMS-beschichteten Glasdeckstücken her und drücken Sie fest darauf. Spülen Sie die mikrostrukturierten Substrate mit destilliertem Wasser ab.

Lagern Sie sie bis zu zwei Wochen lang in destilliertem Wasser bei vier Grad Celsius, sofern sie nicht sofort verwendet werden. Beschichten Sie sechs-Loch-Platten mit steriler 0,1 %iger Gelatine in destilliertem Wasser und lassen Sie diese 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius einwirken. Bereiten Sie in dieser Zeit die embryonalen Mausfibroblasten aus einem Aliquot vor, indem Sie sie einem konischen Reagenzglas mit 50 Milliliter PBS hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 U/min fünf Minuten lang und resuspendieren Sie sie anschließend in MEM-Medium.

Nach Ablauf der Inkubationszeit das überschüssige Gelatin abpipettieren und das MES in die Vertiefungen geben. Das MES einen Tag lang zum Anheften lassen. Bereiten Sie die embryonalen Stammzellen oder ES-Zellen aus einer entsprechenden Aliquot durch Zugabe zu 50 Milliliter PBS in einem kegelförmigen Reagenzglas zur Zentrifugation vor.

Zentrifugieren Sie die ES-Zellen 5 Minuten bei 1000 U/min und resuspendieren Sie sie in ESC-Medium. Geben Sie die ES-Zellen in die Vertiefungen, die Mythe enthalten, und kultivieren Sie sie im ESC-Medium, bis Konfluenz erreicht ist, um kofluente ES-Zellen zu erhalten. Aspirieren Sie zunächst das ESC-Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit steriler PBS.

Anschließend die PBS abpipettieren und 500 Mikroliter TRIPSIN in die Vertiefung geben. Die Platte 3,5 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die TRIPSIN-Lösung mehrmals mit der Pipette auf und ab pipettieren.

Zunächst die ES-Zellkolonien aufbrechen. Danach die Trypsinlösung neutralisieren, indem 500 Mikroliter ESC-Medium in die Vertiefung gegeben werden. Die ES-Zellen entsprechend dem erforderlichen Verdünnungsverhältnis aufarbeiten; hier werden die ES-Zellen im Verhältnis 1 zu 30 weitergegeben, wodurch sie innerhalb von drei Tagen Konfluenz erreichen können.

Beginnen Sie die in vitro-Differenzierung, wenn die ES-Zellen Konfluenz erreicht haben. Beschichten Sie zunächst 10 cm Kulturschalen mit steriler 0,1 %iger Gelatinlösung in destilliertem Wasser und lassen Sie sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius einwirken. In dieser Zeit ernten Sie die ES-Zellen wie zuvor beschrieben.

Nach Ablauf der 15 Minuten überschüssiges Gelatine abpipettieren und etwa ein Drittel bis die Hälfte der E ES-Zellsuspension in Kulturschalen mit Anpassungsmedium geben. Nach zweitägiger Kultivierung der Zellen im Anpassungsmedium die angepassten ES-Zellen mit 1,5 Milliliter Trypsin in ein 50-Milliliter-Kegelrohr mit PBS abspülen. Zentrifugieren bei 1000 U/min für fünf Minuten und erneut in Differenzierungsmedium suspendieren.

Bilden Sie Embryoidkörper oder EBS mit etwa 1000 Zellen pro 10-Mikroliter-Tropfen Differenzierungsmedium in 15-Zentimeter-Kulturschalen. Drehen Sie die Schalen mithilfe einer Mehrkanalpipette um und kultivieren Sie die EBS als hängende Tropfen für zweieinhalb Tage bei 37 Grad Celsius.

Nach zweieinhalb Tagen das EBS aus sechs bis acht 15-Zentimeter-Schalen unter Verwendung von Differenzierungsmedium in eine Schale überführen und für weitere dreieinhalb Tage kultivieren. Nach weiteren dreieinhalb Tagen das EBS in einem 50-Milliliter-Konischglas sammeln und die Platte einmal mit steriler PBS spülen, um alle EBS einzusammeln. Anschließend etwa fünf Minuten lang sedimentieren lassen.

Entfernen Sie dann das Überstand und waschen Sie die EBS mit steriler PBS. Lassen Sie die EBS erneut etwa fünf Minuten lang auf den Boden absinken. Lösen Sie die EBS durch Zugabe von 2,5 Milliliter Trypsin auf und schütteln Sie das Gefäß vorsichtig zwei Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie dann 2,5 Milliliter sterilem PBS zur Trypsinlösung hinzu und pipettieren Sie mit einer 10-Milliliter-serologischen Pipette etwa acht bis zehn Mal auf und ab, um Zellklumpen aufzulösen. Neutralisieren Sie das Trypsin mit 10 Milliliter Fax-Puffer, der 7,5 % ES-Zell- oder Differenzierungsgrad-FBS und 0,01 % DPI in PBS enthält. Zentrifugieren Sie die dissoziierten EBS bei 1000 U/min für fünf Minuten. Entfernen Sie anschließend den Überstand und geben Sie etwa einen Milliliter Fax-Puffer hinzu. Pipettieren Sie mit einer 1-Milliliter-Pipette etwa acht bis zehn Mal auf und ab, um Zellklumpen aufzulösen.

Überführen Sie die Zellen in ein steriles Rundbodenglas mit einem 35-Mikron-Zellsieb, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Sortieren Sie differenzierte ES-Zellen mittels eines Aria-Fluoreszenz-Aktivierter-Zell-Sortierers (FACS) und gewinnen Sie gereinigte Populationen kommittierter ventrikulärer Vorläuferzellen. Siehe Textabschnitt des Protokolls für die detaillierte Gating-Strategie.

Ätzte die Mikromuster-Substrate 10 Minuten lang mit 1 %iger F127-Lösung in destilliertem Wasser. Danach wurden sie dreimal mit steriler PBS gewaschen. PDMS-Dichtungen um den Musterbereich herum anbringen und fest andrücken.

Anschießend säen Sie Herzmigrationzellen auf fibronectinmikrostrukturierten Substraten aus. Die folgenden Bilder stammen von einem repräsentativen Durchflusszytometrie-Diagramm von am sechsten Tag in vitro differenzierten ES-Zellen. Diese Aufnahme zeigt die Gating-Strategie basierend auf der Amplitude des Vorwärtsstreulichts (FSCA) und der Amplitude des Seitwärtsstreulichts (SSCA).

Dies ermöglicht die Trennung ganzer Zellen von zellulärem Detritus. Hier ist die Gating-Strategie anhand von FSCA und der Breite des Vorwärtsstreulichts (FSCW) dargestellt. Dadurch können Zell-Singuletts von Doubletts und anderen zellulären Aggregaten isoliert werden.

Dieses Bild zeigt die Gating-Strategie basierend auf SSCA und Streuung mit SSCW. Dadurch wird die Reinheit der Einzelzellen erhöht. Dieses Bild zeigt die Gating-Strategie basierend auf FSCA und DPI-Färbung, die die Isolierung lebensfähiger DPI-negativer Zellen von nicht lebensfähigen Zellen ermöglicht.

Hier ist die Gating-Strategie für Fico, Rine, PE und PE Cyan in DI sieben PE SI sieben dargestellt. Dadurch können echte rot-positive und echte rot-negative Zellen erhalten sowie autofluoreszierende rot-negative Zellen ausgeschlossen werden. Diese Bilder zeigen das Gating für die Fluoreszeinisothiocyanat-Amplitude, Fit CA und PEA, das es ermöglicht, echte grün-positive und echte grün-negative Zellen innerhalb der rot-positiven und rot-negativen Populationen zu sortieren.

Die FACS-Reinigung in vitro differenzierter ES-Zellen zeigt vier unterschiedliche Populationen von Vorläuferzellen, wie anhand dieses Durchflusszytometrie-Diagramms ersichtlich. Die vier unterschiedlichen Populationen von Vorläuferzellen sind rot positiv, grün positiv, rot negativ, grün negativ, rot positiv grün negativ und rot negativ grün positiv. Dieses repräsentative Immunfluoreszenzmikroskopiebild zeigt mikrostrukturierte Fibronectin-Substrate.

Die Maßstabsleiste repräsentiert 80 Mikrometer. Dieses Bild zeigt repräsentative Immunfluoreszenzmikroskopie von embryonalen abgeleiteten Fakten, isolierten Vorläuferzellen in den oberen Feldern und ESL-abgeleiteten Fakten, isolierten Vorläuferzellen in den unteren Feldern nach weiteren fünf Tagen Kultur auf Fibronectin-Mikromustern, wobei die Kerne blau angefärbt sind. S-M-M-H-C-A ist rot gefärbt, das sarkomere alpha-Aktinin erscheint grün.

Die Maßstabsleiste entspricht 40 Mikrometern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man anisotropes funktionelles Herzmuskelgewebe aus einer nachwachsenden Zellquelle von kardialen Protus erzeugt.