Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken

Das Ziel des folgenden Experiments ist es, ausgerichtetes funktionelles Myokardgewebe durch Mikrokontaktdruck zu erzeugen. Dies wird durch den ersten Mikrokontaktdruck von Fibronektin auf Polydimethylsiloxan-Substrate erreicht. Als zweiter Schritt doppelt transgen.

Embryonale Stammzelllinien werden in vitro differenziert und mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung isoliert, wodurch hochreine Populationen stark kardiogener Vorläuferzellen gewonnen werden können. Als nächstes werden isolierte kardiale Vorläuferzellen auf mikropatentierte PDMS-Substrate ausgesät, um sie bösartig zu machen und eine kardiale Myozyten-ähnliche Stäbchenform anzunehmen. Es werden Ergebnisse erhalten, die die erfolgreiche Isolierung und ein isotropes Wachstum von kardialen Vorläuferzellen auf der Grundlage von Fakten und Immunfluoreszenzanalysen zeigen.

Die Erzeugung eines isotropen Myokardgewebes kann zu Fortschritten in den Bereichen Stammzellbiologie und Gewebe-Bioengineering beitragen, indem sie die Möglichkeit eröffnet, krankheitsspezifische Zellresays für die Arzneimittelentwicklung und -entdeckung zu entwickeln. Und indem wir den Grundstein für die regenerative Herzmedizin legen. Erster IL-Schutz, 180 4 Polydimethylalan-Elastomer in einem Verhältnis von 10 zu eins und gut mischen.

Entgasen Sie die Baugruppe mit einem Trockenmittel, um Luftblasen zu entfernen. Gießen Sie das PDMS in ein zuvor hergestelltes Master mit einer Breite von 20 Mikrometern und zwei Mikrometern Werkzeugrippen, die durch einen Abstand von 20 Mikrometern getrennt sind, und härten Sie es dann zwei Tage lang in einem Trockenmittel bei Raumtemperatur aus, um mikrotexturierte PDMS-Stempel zu erhalten. Nach dem Rendern werden die PDMS-Stempeloberflächen mit einem Plasmareiniger hydrophil.

Sterilisiere die Stempel eine Minute lang mit 70%Ethanol. In einer biologischen Sicherheitswerkbank schnell mit Druckluft trocknen. Decken Sie die sterilen Stempeloberflächen mit Fibronektinlösung ab, um sie mindestens 10 Minuten nach der Resorption zu absorbieren.

Schütteln Sie die Fibronektinlösung von den Stempeln ab und trocknen Sie sie schnell mit Druckluft. Stellen Sie zwei Minuten lang einen konformen Kontakt zwischen dem Stempel und den zuvor vorbereiteten PDMS-beschichteten Glasdeckgläsern her, wie im Textprotokoll beschrieben, und drücken Sie fest. Spülen Sie Mikromustersubstrate mit destilliertem Wasser ab.

Lagern Sie sie maximal zwei Wochen lang in destilliertem Wasser von vier Grad Celsius, es sei denn, sie sollen sofort verwendet werden. Bestreichen Sie sechs Well-Platten mit steriler 0,1%iger Gelatine in destilliertem Wasser und lassen Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius einziehen. Während dieser Zeit bereiten Sie die embryonalen Fibroblasten der Maus aus Ahor Aliquot vor, indem Sie sie zu 50 Millilitern PBS in einem konischen Röhrchen hinzufügen. Zentrifugieren Sie das Meth fünf Minuten lang bei 1000 U/min und suspendieren Sie es wieder in Meth-Medium.

Nach Ablauf der Inkubationszeit wird die überschüssige Gelatine abgesaugt und das Mes in die Vertiefungen gegeben. Warten Sie einen Tag, bis sich das MES angeschlossen hat. Bereiten Sie die embryonalen Stammzellen oder ES-Zellen aus einem Gedankenaliquot vor, indem Sie sie zu 50 Millilitern PBS in einer konischen Röhrchenzentrifuge hinzufügen.

Die ES-Zellen arbeiten fünf Minuten lang mit 1000 U/min und werden durch Resus im ESC-Medium suspendiert. Geben Sie die E-ES-Zellen in die Vertiefungen, die Mythen enthalten, und halten Sie sie im ESC-Medium, bis die Konfluenz erreicht ist, um kofluente ES-Zellen zu massieren. Aspirieren Sie zunächst das ESC-Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit sterilem PBS.

Saugen Sie dann das PBS an und fügen Sie 500 Mikroliter Fahrten in den Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte dreieinhalb Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Pipettieren Sie die TRIPSIN-Lösung mehrmals auf und ab.

Zuerst die E es Zellkolonien aufbrechen. Neutralisieren Sie dann die Tripsin-Lösung, indem Sie 500 Mikroliter ESC-Medium in die Vertiefung geben. Massieren Sie die ES-Zellen im gewünschten Verhältnis, hier werden die E-ES-Zellen im Verhältnis von eins zu 30 passageiert, wodurch sie innerhalb von drei Tagen die Konfluenz erreichen können.

Beginnen Sie mit der In-vitro-Differenzierung, wenn die ES-Zellen die Konfluenz erreicht haben. Zuerst 10 Zentimeter große Kulturschalen mit steriler 0,1%iger Gelatine in destilliertem Wasser bestreichen und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius ziehen lassen. Ernten Sie in dieser Zeit die ES-Zellen wie zuvor.

Nach Ablauf der 15 Minuten wird überschüssige Gelatine aspiriert und etwa ein Drittel bis die Hälfte der E-ES-Zellsuspension in Kulturschalen mit Anpassungsmedium gegeben. Nachdem Sie die Zellen zwei Tage lang in Anpassungsmedium kultiviert haben, ernten Sie die adaptierten ES-Zellen mit 1,5 Millilitern Trypsin in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das PBS enthält. Zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 1000 U/min und suspendieren Sie sie wieder in einem Differenzierungsmedium.

Embryokörper oder EBS aus etwa 1000 Zellen pro 10 Mikroliter Tropfen Differenzierungsmedium in 15 Zentimeter großen Kulturschalen herstellen. Drehen Sie die Platten und die Kultur mit einer Mehrkanalpipette um. EBS hängt zweieinhalb Tage lang Tröpfchen bei 37 Grad Celsius.

Nach zweieinhalb Tagen ziehen Sie die EBS von sechs bis acht 15-Zentimeter-Schalen mit einem Differenzierungsmedium zu einer und kultivieren sie für weitere dreieinhalb Tage. Nach weiteren dreieinhalb Tagen sammeln Sie das EBS in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Platte einmal mit sterilem PBS, um das gesamte EBS zu sammeln. Lassen Sie sie dann etwa fünf Minuten lang auf den Boden sinken.

Entfernen Sie dann das Supinat und waschen Sie das EBS mit sterilem PBS. Lassen Sie das EBS für ca. fünf Minuten wieder auf den Boden sinken. Dissoziieren Sie das EBS durch Zugabe von 2,5 Millilitern Trypsin und schütteln Sie das Röhrchen zwei Minuten lang sanft in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie dann 2,5 Milliliter steriles PBS in die Tripsin-Lösung und pipettieren Sie mit der serologischen 10-Milliliter-Pipette etwa acht bis 10 Mal auf und ab, um Zellcluster aufzubrechen. Neutralisieren Sie das Trypsin mit 10 Millilitern Faxpuffer mit 7,5 % E-ES-Zelle oder FBS in Differenzierungsqualität und 0,01 % DPI in PBS-Zentrifuge, dissoziiertes EBS bei 1000 U/min für fünf Minuten. Entfernen Sie dann das Supinat und fügen Sie etwa einen Milliliter Faxpuffer hinzu, pipettieren Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette etwa acht- bis zehnmal auf und ab, um Zellcluster aufzubrechen.

Übertragen Sie die Zellen in ein steriles Rundbodenröhrchen mit einem 35-Mikron-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Sortieren Sie differenzierte ES-Zellen mit einem aria-Durchflusszytometer und erhalten Sie gereinigte Populationen von engagierten ventrikulären Vorläuferzellen. Im Textteil des Protokolls finden Sie eine detaillierte Gating-Strategie.

Die Mikromustersubstrate mit 1%onic F1 27 10 Minuten in destilliertem Wasser essen. Waschen Sie sie dann dreimal mit sterilem PBS. Befestigen Sie PDMS-Dichtungen um den Modellbereich und drücken Sie sie fest.

Säen Sie dann kardiale Vorläuferzellen auf Fibronektin-Mikromustersubstrate. Die folgenden Bilder stammen aus einer repräsentativen Durchflusszytometrie-Tabelle von in vitro differenzierten ES-Zellen am sechsten Tag. Dieses Bild zeigt das Gating auf der Vorwärtsstreuamplitude FSCA und der Seitenstreuamplitude SSCA.

Dies ermöglicht die Trennung ganzer Zellen von Zelltrümmern. Hier ist das Anschnitt auf FSCA und die Vorwärtsstreubreite FSCW zu sehen. Dies ermöglicht die Isolierung von Zellsinglets aus Dubletten und anderen zellulären Aggregaten.

Dieses Bild zeigt das Gating auf SSCA und die Streuung mit SSCW. Dies erhöht die Reinheit der Zell-Singuletts. Dieses Bild zeigt das Gating auf FSCA- und DPI-Färbung, das die Isolierung lebensfähiger DPI-negativer Zellen aus nicht lebensfähigen Zellen ermöglicht.

Hier ist ein Anschnitt für Fico, Rine, PE und PE Cyan in DI seven PE SI seven zu sehen. Auf diese Weise können echte rote und echte rote negative Zellen erhalten und autofluoreszierende rot-negative Zellen ausgeschlossen werden. Diese Bilder zeigen ein Gating für die Fluorescein-Isothiocyanat-Amplitudenanpassung von CA und PEA, das die Sortierung von richtig grün positiven und richtig grün negativen Zellen innerhalb von rot positiven und rot negativen Populationen ermöglicht.

Die Faxreinigung von in vitro differenzierten ES-Zellen zeigt vier verschiedene Populationen von Vorläuferzellen, wie in diesem Durchflusszytometrie-Diagramm zu sehen ist. Die vier unterschiedlichen Populationen von Vorläuferzellen sind rot, positiv grün, positiv rot, positiv grün, negativ rot, negativ grün positiv und rot negativ grün negativ. Dieses repräsentative Immunfluoreszenzmikroskopie-Bild zeigt mikrostrukturierte Fibronektinsubstrate.

Der Maßstabsbalken stellt 80 Mikrometer dar. Dieses Bild zeigt eine repräsentative Immunfluoreszenzmikroskopie von embryonalen Fakten, isolierte Vorläuferzellen in den oberen Panels und ESL-abgeleitete Fakten, isolierte Vorläuferzellen in den unteren Panels nach weiteren fünf Tagen Kultivierung auf blau gefärbten Fibronektin-Mikromuster-Kernen. S-M-M-H-C-A gefärbtes sarkomerisches Alpha-Actinin erscheint grün.

Der Maßstabsbalken beträgt 40 Mikrometer. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man anisotropes funktionelles Myokardgewebe aus einer erneuerbaren Zellquelle des Herzprotus erzeugt.